AcrVA5によるCas12a活性の可逆的調節 - 株式会社コーストワイズ・ベンチャーズ・グループ

Cell Discovery volume 8、記事番号: 45 (2022) この記事を引用

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編集者様へ、

クラスター化された規則的な間隔の短い回文反復 (CRISPR)/CRISPR 関連 (Cas) システムは、バクテリオファージなどの移動性遺伝要素 (MGE) から細菌や古細菌を保護します1。 Cas エフェクターは、CRISPR RNA (crRNA) によって誘導され、塩基対形成によって侵入核酸を標的にし、標的を切断して宿主に免疫を提供します 2,3。宿主の CRISPR システムによって課せられる免疫圧力に対処するために、ファージはさまざまな種類の抗 CRISPR (Acr) システムを進化させて、Cas ヌクレアーゼを不活性化し、次に宿主の免疫システムを閉じます 4。 Acr タンパク質は Cas タンパク質と直接相互作用して、crRNA のローディングやターゲットの結合を防ぐことができます。あるいは、crRNA を切断したり、Cas タンパク質を翻訳後修飾したりする酵素活性を持っています4。その中には、最近報告された GNAT ファミリーアセチルトランスフェラーゼ、すなわち AcrVA5 が存在します。これは MGE によってコードされ、重要なリジン部位のアセチル修飾を通じて VA 型 Cas12a エフェクターを特異的に阻害します。 AcrVA5 によって不活化された Cas12a は、プロトスペーサー隣接モチーフ (PAM) 部位と相互作用する能力を失い、侵入した MGE を切断することによって宿主を保護できなくなります 5,6。 acrVA5 遺伝子を含む MGE は、Cas12a システムを不活性化することで細菌の免疫システムを効果的に停止させることができ、Cas12a を保有する宿主間で広く拡散する可能性があります。しかし、非常に驚いたことに、acrVA5 遺伝子は、脱アセチラーゼを失った 3 つのモラクセラボボキュリ株にのみ存在します (補足表 S1)。したがって、アセチルトランスフェラーゼ AcrVA5 と、広く分布している細菌性脱アセチル化酵素 7 との間に競合関係が存在するのではないかと考えるのが合理的です。脱アセチル化酵素は、acrVA5 カセットを保持する MGE の侵入から宿主を守るために、脱アセチル化によって Cas12a を再活性化する可能性があります。

我々は最初にAcrVA5媒介インビトロアセチル化実験を実施し、AcrVA5アセチル化ラクノスピラ科細菌（Lb）Cas12aが二本鎖標的DNA（dsDNA）に対するシス切断活性とトランス切断活性の両方を失ったことを示しました（補足図S1a、b）。これは以前の発見と一致していました5,6、しかし、AcrVA5処理は、標的一本鎖DNA（ssDNA）によって引き起こされた場合、LbCas12aトランス切断活性に影響を与えませんでした（補足図S1c）。 PAM 部位は、Cas12a が標的 dsDNA を認識するのにのみ必要ですが、ssDNA8 を認識する場合には必要ないため、上記の結果は、AcrVA5 媒介アセチル化により Cas12a が標的 dsDNA5 の PAM 配列と相互作用するのを妨げることをさらに確認しました。

LbCas12a に加えて、Francisella tularensis subsp. 由来の Cas12a オーソログも分析しました。ノビシダ (FnCas12a) およびアシダミノコッカス sp. （AsCas12a）、AcrVA5が両方のオルソログを不活性化できることが実証されました（補足図S2およびS3）。注目すべきことに、AcrVA5は以前の研究でAsCas12aに対して無効であることが示されていましたが、AsCas12aには保存されたリジン残基が含まれていることを発見し（補足図S3c）、AcrVA5を介した治療によりシスとシスの両方の喪失が起こることが示されました。 AsCas12a と標的 dsDNA のトランス切断活性。

翻訳後のリジンのアセチル化は、細菌からヒトに至るまでの生物の多様な細胞プロセスにおいて重要な役割を果たしています9。細菌では、NAD+ 依存性のサーチュインタイプ CobB が多数のタンパク質を脱アセチル化し、全体的なアセチル化レベルを制御します7。 CobB が AcrVA5 処理 Cas12a を脱アセチル化し、そのシスおよびトランス切断活性を再活性化できるかどうかをテストするために、次に組換え大腸菌 CobB および LbCas12a を精製し、in vitro 脱アセチル化アッセイを実施しました。ウェスタンブロットの結果に基づいて、Cas12a はアセチル CoA の存在下で AcrVA5 によって首尾よくアセチル化され、アセチル修飾は CobB による処理後に効率的に除去できました。以前の発見と一致して7、CobB媒介脱アセチル化には補因子としてNAD +が厳密に必要です（補足図S4）。したがって、AcrVA5アセチル化LbCas12aは、標的dsDNAに対するシス切断活性とトランス切断活性の両方を失いましたが、CobBによって脱アセチル化された後、両方の活性を大幅に回復しました（図1a、b）。さらに、FnCas12aやAsCas12aなどのいくつかのCas12aオルソログをテストしたところ、CobBが両方のCas12aオルソログを脱アセチル化して再活性化できることがわかりました（補足図S5〜S8）。 CobB処理によるアセチル化AsCas12aの再活性化の成功により、AsCas12aがAcrVA5の標的であることが再び証明されたことは言及する価値がありますが（補足図S3）、この研究と以前の研究6の間の明確な結果の理由はまだ不明であり、可能性があります興味深い質問ですので、今後さらに調査してください。上記の結果に基づいて、AcrVA5およびCobBは、インビトロでのアセチル状態を調節することによってCas12aのシスおよびトランス切断活性の両方を可逆的に調節すると結論付けることができる。

a ターゲット dsDNA を使用した LbCas12a シス切断実験。以下に示すように、活性型 Cas12a は crRNA の誘導により標的 dsDNA を 2 つに切断することに成功しましたが、アセチル化 Cas12a は不活化され、標的 dsDNA に対するシス切断活性を失いました。 M、1 kb DNA ラダー (Thermo Fisher Scientific); S、dsDNA基質。 P、Cas12a シス切断産物。 b 標的 dsDNA を用いた LbCas12a トランス切断実験。以下に示すように、活性型 Cas12a タンパク質のトランス切断活性は、標的 dsDNA によって引き起こされ、蛍光消光レポーター (FQ レポーター) をトランス切断し、蛍光シグナルを照射します。しかし、Cas12a がアセチル化されると、Cas12a は不活化され、標的 dsDNA の存在下でトランス切断活性を失います。蛍光シグナルはリアルタイム qPCR 装置で収集され、値はバックグラウンドシグナルを差し引いて表示されました。 NC、ターゲットを添加しないネガティブコントロール反応。 LbCas12a、未処理のLbCas12aを使用した反応。 LbCas12a-AcCoA、アセチル-CoAのみで処理したLbCas12aを用いた反応。 LbCas12a-AcCoA-AcrVA5、アセチル-CoAの存在下でAcrVA5で処理したLbCas12aを使用する反応。 acLbCas12a、AcrVA5 アセチル化 LbCas12a; acLbCas12a-NAD+、NAD+ のみで処理されたアセチル化 LbCas12a。 acLbCas12a-NAD+-CobB、NAD+ の存在下で CobB で処理されたアセチル化 LbCas12a。 c 外来aprレポータープラスミドの侵入から宿主を保護する際のCobBの生理学的役割の分析。 W3110/cas12a、LbCas12a/crRNA複合体を発現する野生型。 ΔcobB、LbCas12a/crRNA複合体を発現するcobBヌル変異体。 W3110/cobB+cas12a、LbCas12a/crRNA複合体およびCobBを発現する野生型。 apr-WT、野生型 apr 遺伝子を持つレポータープラスミド。 apr-Mut、Cas12a による切断から逃れることができる変異型 apr 遺伝子を持つレポータープラスミド。 d AcrVA5およびCobBを介したCas12a活性の可逆的調節の調節モデル。アセチルトランスフェラーゼ AcrVA5 は、アセチル CoA を使用して Cas12a をアセチル化し、Cas12a および MGE に対する宿主抵抗システムを不活化しますが、宿主は NAD+ 依存性 CobB を有しており、これが Cas12a を脱アセチル化して再活性化し、侵入する核酸に対する二次的な保護手段を宿主に提供します。酸。

我々は、acrVA5 遺伝子を保有する MGE の侵入から Cas12a 含有宿主を保護する際の CobB の生理学的役割をさらに調査しました。まず、アプラマイシン耐性遺伝子（apr）の特定の配列を標的とするLbCas12aとcrRNAの両方を発現するCRISPRプラスミドを構築し、高レベルのCobB発現の有無にかかわらず大腸菌株に形質転換しました（補足図S9）。大腸菌10におけるネイティブcobB遺伝子の発現レベルが低いため（補足図S10）、野生型W3110およびcobB欠失株はcobB陰性宿主とみなされ、一方、cobB過剰発現株は、 cobB 陽性宿主。 Cas12a / crRNA複合体のターゲティング配列を持たないレポータープラスミドを調製するために、アミノ酸配列とアプラマイシン耐性を変更せずに、apr遺伝子のCas12aターゲティングDNA配列を変異させ（補足図S11）、変異型を得ました。 apr遺伝子。ナンセンス変異はPAM部位とガイド配列の両方を変化させたため、Cas12aはインビトロの両方で標的配列を切断できませんでした（補足図S11b）。その結果、変異体aprを有するレポータープラスミドは宿主防御システムから効果的に逃れ、acrVA5非依存的に高い形質転換効率を示した（図1c）。したがって、これを形質転換アッセイの対照として使用した。

次に、野生型 apr 遺伝子を含むレポータープラスミドを、MGE の侵入を模倣するために Cas12a を発現する大腸菌株に形質転換しました。予想通り、acrVA5 遺伝子の非存在下では、発現量に関係なく、試験したすべての株で形質転換体を取得できませんでした。 CobB のレベルは、外来プラスミドの侵入を宿主によって完全にブロックできることを示しています (図 1c)。しかし、レポータープラスミドが apr と acrVA5 の両方を含み、acrVA5 カセットを保有する MGE を模倣している場合、cobB 陰性宿主においてレポータープラスミドの高い形質転換効率が得られ、これは AcrVA5 が Cas12a を効果的に不活化するという上記の知見と一致しました。 cobB 陽性宿主における CobB の過剰発現は、AcrVA5 アセチル化 Cas12a を脱アセチル化して再活性化する可能性があるため、レポータープラスミドの形質転換は大幅にブロックされました。予想どおり、CobB および AcrVA5 の過剰発現により大腸菌の形質転換効率が大幅に低下する可能性がありますが、レポータープラスミドの効率は依然としてコントロールよりもはるかに低かった (図 1c)。上記の結果に基づいて、AcrVA5およびCobBはそれぞれアセチル化および脱アセチル化を通じて生体内でCas12a活性を可逆的に調節すると結論付けることができる。

AcrVA5 を介した Cas12a のアセチル修飾は、MGE による効果的な抗 Cas12a 戦略と考えられている 5,6 ため、CobB を介した修飾による Cas12a の脱アセチル化再活性化は、抗 CRISPR エレメントに対する予防戦略と、 CRISPR防御システムを保護し、acrVA5を含むMGEの侵入から宿主を保護します（図1d）。さらに、この研究は、Cas12a 切断活性を制御するためのより複雑なシステムを作成できる可能性を強調しており、これにより、in vivo 遺伝子編集と in vitro 標的核酸検出の両方が促進される可能性があります 11。

Cas12a に加えて、AcrVA5 は広域スペクトルのアセチルトランスフェラーゼとして機能し、細胞の代謝プロセスに影響を与える可能性があります。次に、大腸菌細胞抽出物と精製AcrVA5を使用してインビトロウェスタンブロット分析を実行し、多数のタンパク質がAcrVA5によってアセチル化できることがわかりました（補足図S12）。同様に、大腸菌でのAcrVA5の過剰発現後、全細胞のアセチル化レベルが大幅に増加し、アセチル化タンパク質はNAD +の存在下でCobBによって効率的に脱アセチル化できました（補足図S13）。質量分析を利用して、2688 個の部位と 1101 個のタンパク質を潜在的な AcrVA5 標的としてさらに特徴付けました (補足表 S2)。おそらくタンパク質サイズが小さく、立体障害が減少したため、AcrVA5は明らかな標的配列の優先性を示さなかったが、リジン、アルギニン、ヒスチジンなどの正に荷電したアミノ酸を好みました（補足図S14）。 AcrVA5 の広範な標的を考慮すると、CobB と AcrVA5 が宿主免疫系およびそれ以外の両方の制御をめぐって競合することが想像できます。さらに、脱アセチル化酵素ドメインを含む Dsr タンパク質が、dsDNA ファージの侵入から宿主を保護することが最近判明しており 12、今回の研究は不明なメカニズムに対する手がかりを提供する可能性があります。

総合すると、侵入する MGE と宿主微生物との間の戦争は決して終わることがなく、アセチル修飾および脱アセチル修飾以外にも、今後の調査の対象となる他の種類の競合メカニズムがおそらく存在すると推測できます。中国の慣用句の通り、悪徳は 1 フィート高くなりますが、美徳は 10 フィート高くなります。

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大腸菌 W3110 株と変異体を寛大に提供してくださった Jiaoyu Deng 教授 (武漢ウイルス研究所、CAS) に感謝します。データ分析における協力については Qiuxiang Cheng (Tolo Biotech.)、タンパク質精製における支援については Weixin Li、Yuangang Ni、Bangtai Luo (Tolo Biotech.)、そしてバイオインフォマティクスにおける協力については Jiacheng Wu (Shanghai Tech University) に感謝します。分析。この研究は、中国国家自然科学財団 (31922046、31770057)、深セン三明医療プロジェクト (SZSM202011017)、および中国国家重点研究開発プログラム (2018YFA0903700) からの助成金によって支援されました。

これらの著者は同様に貢献しました: Xiaoman Kang、Lei ying、Songkuan Zhuang

CAS 分子植物科学センター、中国科学院、上海、中国

カン・シャオマン＆趙国平

中国科学院大学、北京、中国

カン・シャオマン

Tolo Biotechnology Company Limited、上海、中国

レイ・イン

中国深セン市、深セン第二人民病院およびトランスレーショナル医学研究所/深セン大学健康科学センター第一付属病院臨床検査部

Songkuan Zhuang、Tianshuai Hu、Yong Xu、Jin Wang

上海師範大学生命科学学院（中国、上海）

ウー・ジレ

中国、上海、復旦大学華山病院抗生物質研究所

チェン・イージャン

中国、上海、国家衛生健康委員会、抗生物質の臨床薬理学の主要研究室

チェン・イージャン

中国深セン市、深セン第二人民病院/深セン大学第一附属病院、広東省泌尿生殖器腫瘍のシステム生物学および合成生物学重点研究室

ワン・ジン

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JW はプロジェクトを発案し、実験を設計しました。 XK、LY、および SZ はほとんどの実験を実行し、この研究に等しく貢献しました。 TH はタンパク質の精製に役立ちました。 ZW はバイオインフォマティクスの研究を行いました。 GZ、YC、YX、JW は実験データを分析しました。 JW が原稿を書き、著者全員が原稿を修正して原稿の最終版を承認しました。

Yijian Chen、Yong Xu、または Jin Wang との通信。

JW と GZ は Tolo Biotechnology Co., Ltd. の共同創設者です。LY は Tolo Biotechnology Co., Ltd. の従業員です。他の著者はすべて、競合する利益を宣言していません。

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転載と許可

Kang、X.、ying、L.、Zhuang、S. 他。 AcrVA5媒介アセチル化およびCobB媒介脱アセチル化によるCas12a活性の可逆的制御。セルディスコブ 8、45 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41421-022-00396-0

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受信日: 2021 年 11 月 15 日

受理日: 2022 年 3 月 10 日

公開日: 2022 年 5 月 17 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41421-022-00396-0

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