腫瘍 - 株式会社コーストワイズ・ベンチャーズ・グループ

Communications Biology volume 6、記事番号: 60 (2023) この記事を引用

2519 アクセス

8 オルトメトリック

メトリクスの詳細

多種多様な治療用カーゴを送達できる癌特異的リガンドが引き続き求められています。腫瘍特異性と治療薬の効率的な細胞取り込みを媒介する能力の両方を示すリガンドは、標的療法を拡大するために重要です。我々は以前、非小細胞肺がん（NSCLC）細胞株を標的として使用したペプチドライブラリからのペプチドの選択を報告しました。ここでは、切断、N 末端キャッピング、原子価の変更などの一連の化学修飾によってリードペプチドを最適化します。得られた 10 アミノ酸のペプチドは、単量体として 4 つの異なる NSCLC 細胞株に対して <40 nM の親和性を有し、ヒト血清中で > 48 時間安定です。このペプチドは細胞結合時に急速に内部移行し、リソソームに輸送されます。このペプチドは動物モデルの腫瘍に到達し、最長 72 時間保持されます。重要なのは、このペプチドが細胞傷害性タンパク質サポリンをインビトロおよびインビボで癌細胞に特異的に送達し、効果的な抗癌剤となることを実証したことである。

過去 30 年間で新規症例数は減少しているにもかかわらず、米国における癌関連死亡の約 20% は依然として肺癌によるものです1。低線量スパイラル CT による喫煙者のスクリーニングにより検出率は向上しましたが、局所的な段階で検出される肺がんは 17% のみです。新しい治療法は、腫瘍の遺伝子型および/または表現型に依存する分子誘導治療に焦点を移しています2。そのような治療クラスの 1 つは、抗体薬物複合体 (ADC) です。抗体は、腫瘍内では発現が上方制御されているが、正常細胞ではほとんど発現していない細胞表面受容体を標的とする送達システムとして機能します。モノクローナル抗体は、正常細胞への送達を避けるために高い細胞特異性を示さなければなりません。さらに、有毒なペイロードを送達するには細胞内に取り込まれなければなりません。癌細胞に対する抗体の特異性により、毒性が強すぎて全身投与できない薬物を ADC として利用できます。エムタンシンに結合した抗 HER2 抗体である Kadcyla®3、およびモノメチルオーリスタチンに結合した抗 CD30 抗体である Adcetris4,5 の承認により、ADC の開発が活性化されました。 2017 年以来、8 つの ADC が FDA の承認を受けています6、7、8。しかし、現在まで肺がんの治療に承認された ADC はありません9。

ペプチドは、癌を標的とする分子の代替クラスを提供します。ペプチドは、親和性と特異性において抗体に匹敵します。それらは製造が容易であり、高分子バイオ医薬品を含むさまざまな貨物を運ぶために位置特異的に修飾することができます。ファージディスプレイバイオパニングは、がんに存在する新規バイオマーカーのペプチドリガンドを選択するために使用されています10。我々は以前、NSCLC細胞株HCC1511に対するバイオパニングによってファージディスプレイペプチドライブラリーからペプチドを単離しました。現在 MGS4 (以前は HCC15.2) と呼ばれているこのペプチドは、試験した NSCLC 株の約 54% (21/39) に内部移行し、組織マイクロアレイ内の固定ヒト NSCLC 生検サンプルの 24% (14/59) に結合します。不死化されたが形質転換されていないヒト気管支上皮細胞への内部移行の欠如、および組織マイクロアレイにおける隣接する正常な肺組織サンプルへの結合の欠如により、このペプチドの癌細胞対正常肺組織に対する特異性が確立される。したがって、MGS4 は、がんのサブセットに細胞毒性物質を送達するための有望な標的分子です。ここでは、一連の化学修飾によってリードペプチドを最適化し、血清安定性があり、細胞内でがん細胞にカーゴを送達できる高親和性ペプチドを作成します。得られたペプチドは、動物モデルの NSCLC 腫瘍にホーミングします。重要なのは、最適化されたMGS4が細胞傷害性タンパク質サポリンをin vitroおよびin vivoでがん細胞に特異的に送達し、効果的な抗がん剤となることを実証したことです。

MGS4 は、生細胞上のペプチドライブラリーのファージディスプレイバイオパニングによって最初に選択されました。ライブラリー構築では、ペプチドが PIII コートタンパク質に遺伝子的に融合され、単一のペプチドがファージあたり 3 ～ 5 コピーで表示されるようになります。したがって、多くの場合、多価結合が必要となります。 MGS4 内部移行に多価結合が必要かどうかを確認するために、単量体 (MGS4_V2) および四量体 (MGS4_V1) ペプチドを合成し、記載されているように標識しました (補足図 1)。生細胞上でさまざまな濃度のペプチドをインキュベートした後、表面に結合したペプチドを低 pH 洗浄およびトリプシン処理によって除去しました。相対的な内部移行をフローサイトメトリーによって測定して、最大の半分の内部移行を生成するペプチドの濃度を表すEC50値を決定した。この測定は、細胞標的に対するペプチドの親和性と内部移行の速度に依存します。これは生物学的状況のより正確な表現であり、薬物送達剤としてのペプチドを評価するのに役立ちます。受容体媒介エンドサイトーシスについて予想されるように、MGS4 の取り込みは濃度の増加とともに飽和します。四量体化は EC50 を大きく変化させず、多量体化による MGS4 の親和性に明らかな変化がないことを示唆しています (図 1a)。

a 培養中の生 H1299 細胞上の四量体 MGS4_V1 および単量体 MGS4_V2 の結合と内部移行。細胞を、ストレプトアビジン-フィコエリトリンに結合したペプチドとともに37℃で1時間インキュベートしました。内在化されなかったペプチドを除去し、細胞をフローサイトメトリーで分析しました。 b H1299 細胞を、ストレプトアビジン-Alexa Fluor 555 (赤色) に結合した MGS4_V1 または MGS4_V2 と 1 時間インキュベートし、洗浄、固定し、WGA-Alexa Fluor 488 (緑色、細胞膜) および DAPI (青色、核) で対比染色し、次のように分析しました。蛍光顕微鏡検査。スケールバーは 20 μm を表します。 MGS4_V1 と MGS4_V2 は、同様の程度に内部化され、同様の宛先にローカライズされます。 c 切断された単量体 MGS4 ペプチドは、親の完全長ペプチドと同様の EC50 を持ちます。個々の測定値が表示されます。平均値は「X」で示され、黒いエラーバーは最小 3 回の反復実験 (SEM) の標準誤差を表します。すべての元の結合データとデータの非線形回帰分析は補足資料に含まれています。

エンドサイトーシスは、多くの場合、細胞表面の受容体の多量体化によって引き起こされます。ただし、データは、MGS4 がモノマー形式で内部化されることを示唆しています。内部移行を検証するために、ペプチドをストレプトアビジン-Alexa Fluor 555に結合させ、生細胞とともにインキュベートしました。内部移行は、共焦点蛍光顕微鏡法によって測定した。 MGS4_V2 は、MGS4_V1 で観察されたのと同様に、明確な内部化を示しました。両方の原子価は、核周囲領域の個別の点に局在しています（図1b）。したがって、MGS4_V2 は、低いナノモル親和性でがん細胞に結合し、カーゴを生細胞に送達します。単量体ペプチドの合成に必要な時間は半分未満、材料の生産量は 4 分の 1 であるため、さらなる最適化のために単量体 MGS4_V2 が使用されました。

どのアミノ酸が細胞結合に重要であるかを調べるために、末端からアミノ酸を連続的に切断して単量体 MGS4 を合成しました。各欠失が内部移行に及ぼす影響を調べた(表1)。 2 つの C 末端アミノ酸、アラニンとプロリンは、親和性がわずか約 3 ～ 5 倍低下するだけで切り詰められる可能性があります (MGS4_V3 および MGS4_V4)。 3 番目のアミノ酸であるスレオニンも除去されると (MGS4_V5)、すべての取り込みが失われます。同様に、最初の N 末端アミノ酸フェニルアラニンが短縮されている場合 (MGS4_V6)、取り込みは無効になります。間にあるすべてのアミノ酸が結合に必ずしも重要であるわけではありませんが、MGS4_V4 を末端からさらに切断することはできません。この切断により親和性は約 3 分の 1 に減少しますが、実用的な目的では C 末端のプロリンを除去することが有利です。プロリンはペプチドカップリング中にラセミ化を受けやすく、プロリンの二級アミンにより後続のアミノ酸のカップリングが遅くなり、プロリンは全体の合成収率を低下させる可能性があります12。

血清安定性はペプチドの制限としてよく挙げられ、主な分解は N 末端および C 末端ペプチダーゼによる切断です。 C 末端は、アミド化、ビオチン化アミノ酸、PEG リンカーによって分解から保護されています (補足図 1)。しかし、N 末端には未修飾の天然アミノ酸フェニルアラニンが含まれており、これを除去すると内部移行が完全に失われます。したがって、劣化からの保護が重要です。アミノ末端のアセチル化は、立体構造を最小限に抑えながら N 末端ペプチダーゼからペプチドを保護します 13。ただし、アセチル化により正味電荷が減少し、MGS4 の細胞受容体への結合が変化する可能性があります。

MGS4 の血清分解を減らすのにアセチル化が有効かどうかを調べるために、アセチル化 (MGS4_V8) ペプチドと非アセチル化 (MGS4_V4) ペプチドをヒト血清に溶解し、37 °C で 48 時間インキュベートしました。ペプチドは分析用 HPLC によってモニタリングされ、生成物は MALDI TOF/TOF™ MS によって検証されました。アセチル化によりMGS4_V8が分解から保護され、全長ペプチドのみが観察されます（補足図2）。対照的に、保護されていない MGS4_V4 の出発物質はまったく観察されません。代わりに、ペプチド断片の混合物が検出されますが、そのどれも出発ペプチドの質量に対応しません (補足表 1 および補足図 2)。主要な生成物は、5 つの N 末端アミノ酸の欠失に対応する短いフラグメントです。 QSFYT-PEG11、SFYT-PEG11、FYT-PEG11に関連するフラグメントが観察されます。 MGS4_V8 ではこれらの切断生成物が観察されず、アミノ末端 FHAVP フラグメントに対応する質量を特定できないため、非アセチル化変異体で観察された分解生成物は、エンドプロテアーゼではなくアミノペプチダーゼ切断によるものである可能性があります。

アセチル化がペプチド活性に影響を与えないことを確認するために、MGS4_V4 と MGS4_V8 の EC50 を比較しました。アセチル化は、アセチル化されていない MGS4_V4 と比較して、MGS4_V8 の内在化に大きな影響を与えません (表 1)。同様に、アセチル化された全長ペプチド MGS4_V7 と切断された MGS4_V8 の間には、無視できるほどの差があります。 MGS4_V2 と比較して MGS4_V7 の結合は低下していますが、モノマーペプチドとしての親和性は依然として in vivo ターゲティングに有用な範囲内にあります 14,15。したがって、アセチル化は、細胞標的への結合を阻害することなくMGS4のN末端を保護する効果的な方法です。

MGS4 をモノマーとして最適化することは効率的ですが、切断されたペプチドの最適な原子価は全長ペプチドの最適原子価とは異なる可能性があります。ペプチドは、モノマー (MGS4_V8)、ダイマー (MGS4_V9)、およびテトラマー (MGS4_V10) として合成されました。定量的データを得るために、色素標識ペプチドの相対蛍光の測定から、細胞あたりに取り込まれた色素分子の平均数の決定に移りました。このアプローチを使用すると、H1299 細胞上の MGS4_V8 の EC50 は以前に計算された値 (21 対 38 nM) よりわずかに高くなりますが、アッセイの誤差の範囲内です。二量体 MGS4_V9 の EC50 は 7 倍低く、単量体から二量体への変化に相乗効果があることを示しています (図 2a および表 2)。ただし、二量体から四量体ペプチド (MGS4_V10) に移行する場合、わずか 2 分の 1 の減少しかありません。また、他の 3 つの NSCLC 細胞株の EC50 も計算しました (表 2 および補足図 3)。すべての場合において、EC50 は実験誤差の範囲内で同じであり、MGS4 の親和性が細胞型に依存しないことを示唆しています。飽和条件で細胞あたりに取り込まれるペプチドの平均数は異なりますが、H1993 細胞は 3 つの原子価すべてで最も多くのペプチドを取り込みます (表 2)。これは、細胞の種類ごとに受容体の発現レベルが異なるためと考えられます。 1 時間で 50 nM で内部移行した平均分子も同じ傾向に従いました (図 2b)。さらに、MGS4_V8 および MGS4_V9 は NSCLC 細胞株に対する特異性を保持しています。正常なヒト気管支上皮細胞株では最小限の内部移行が観察されます（図2b）。

a MGS4_V8、MGS4_V9、または MGS4_V10 をストレプトアビジン-Alexa Fluor 647 と結合させ、H1299 細胞を標識結合体とともに 1 時間インキュベートしました。内在化されなかったペプチドを除去し、細胞当たり内在化されたペプチドの平均数を決定してEC50を計算した。個々の測定値が表示されます。平均値は「X」として表示されます。黒のエラーバーは標準誤差測定値を表し、場合によっては記号の高さを下回ります。 b 4つのNSCLC細胞株と1つの正常なヒト気管支上皮細胞株(HBEC)について、50nMで1時間における細胞当たりのペプチド分子の平均数を決定した。エラーバーはSEMを表し、個々のデータポイントが表示されます。 c H1299細胞を50 nMペプチド-ストレプトアビジン-Qdot605とともに1時間インキュベートし、除去し、通常の増殖培地に置き換えた。 24 時間後、細胞を固定し、DAPI (青) で対比染色しました。各グループの代表的な最大投影 Z スタックでは、ペプチドの内部移行または局在化に明らかな違いは見られません。スケールバーは 10 μm を表します。

EC50 は価数とともに減少しますが、飽和時の細胞あたりに取り込まれたペプチドの数は、4 つの細胞株にわたって価数にほとんど依存しません。したがって、異なる原子価のMGS4変異体は、異なる濃度であっても同じ最大取り込みに達します（図2b、表2）。同様に、すべての原子価は内部化され、同様の場所に移動します（図2c）。二量体や四量体を合成するための材料費や時間の増加は、収益逓減の影響を及ぼします。さらに、モノマーはタンパク質上に直接クローン化されて送達される可能性があります。これらを総合して、私たちはモノメリック MGS4_V8 の開発を進めました。

薬物複合体の内部移行後の体内輸送は、有効性に重要な影響を及ぼします。望ましい生物学的効果を生み出すためには、貨物が細胞の標的に到達できなければなりません。核、ER、ゴルジ、リソソーム、ミトコンドリア、サイトゾル、または細胞膜が標識された、一連の安定した細胞小器官特異的 GFP 標識 H1299 細胞が生成されました。各細胞株をMGS4_V8-ストレプトアビジンAlexa Fluor 555で処理しました。1時間で、MGS4_V8の共局在がリソソーム標識細胞で観察され、図3aの赤い矢印で示された黄色のピクセルとして見られました。 MGS4_V8 は他の細胞内位置には蓄積せず、細胞膜上にも観察されませんでした。

a H1299 細胞は、ER、ゴルジ、リソソーム、ミトコンドリア、核、細胞膜、およびサイトゾル (緑色) の GFP タグ付き細胞小器官特異的タンパク質で標識されました。細胞を 50 nM MGS4_V8-ストレプトアビジン Alexa Fluor 555 (赤色) とともに 37 °C で 1 時間インキュベートし、その後固定し、DAPI (青色) で対比染色しました。 MGS4_V8 は、赤い矢印で示される黄色の点として観察されるリソソームと共局在します。他の細胞内小器官との顕著な共局在は観察されません。 b リソソーム標識 H1299 細胞 (緑色) を 50 nM MGS4_V8-ストレプトアビジン Alexa Fluor 555 (赤色) とともに 0.5、1、4、または 24 時間インキュベートし、洗浄、固定し、DAPI (青色) で対比染色しました。代表的な単一の Z スライス画像が表示されます。ペプチドで満たされた小胞は 30 分でリソソームに移動するのが見られ、多くは 1 時間までにすでに共局在しています。ほとんどのペプチドは 4 時間までにリソソーム内で発見され、24 時間ではそこに保持されます。 c パネル b の画像から最大限に投影され、圧縮された Z スタック。すべての画像のスケールバーは 10 μm を表します。

リソソーム標識細胞 (緑色) を MGS4_V8-ストレプトアビジン Alexa Fluor 555 で 30 分間、1 時間、4 時間、または 24 時間処理しました。ペプチド含有小胞 (赤色) は標識されたリソソームから 30 分離れたところに見られ、1 時間までにリソソーム小胞 (黄色) と共局在し始めます。 MGS4_V8は24時間でもリソソームと共局在したままであり、シグナルの＞70％がリソソームと共局在している（図3b）。リソソーム内での輸送、蓄積、保持は、圧縮された最大投影された細胞の Z スタックでさらに明らかです (図 3c)。注目すべきことに、以前に内在化されたMGS4_V8と共局在していないGFPからの緑色シグナルの増加によって証明されるように、リソソームの再生が24時間で観察される。

サポリンはリボソーム不活化タンパク質 (RIP) であり、リボソーム 28 S rRNA を切断してタンパク質合成を停止することによって機能します 16、17、18。サポリンのリボソーム不活性化活性は触媒的であり、細胞内のリボソームを不活性化するのに少数の分子を必要とします。サポリンには内部移行ドメインがありません。ヒト細胞に対する指向性はなく、細胞内在化リガンドに結合しない限り毒素は内部に取り込まれません。 MGS4_V8 が活性タンパク質毒素を細胞内に送達するかどうかを確認するために、ビオチン化ペプチドをストレプトアビジン標識サポリンに結合させました。図4aに見られるように、MGS4_V8はH1299細胞へのサポリンの内部移行を媒介します。対照的に、コントロールペプチドMGS4_V6に結合したサポリンは細胞内に進入せず、細胞内送達を促進するには機能的ターゲティングペプチドが必要であることが示されています。

a H1299細胞を、ストレプトアビジン-サポリンに結合したビオチン化MGS4_V8と1時間インキュベートし、洗浄、固定し、抗サポリン抗体（赤）、WGA-AF488（緑）およびDAPI（青）で対比染色しました。 MGS4_V8 はサポリンを癌細胞にうまく送達しますが、対照ペプチドの MGS4_V6 は送達できません。 b MGS4_V8およびMGS4_V9サポリン結合体を連続希釈し、H1299およびH2009細胞とともに6時間インキュベートした後、MGS4-サポリン結合体を除去し、完全な増殖培地をウェルに戻しました。 72時間後に生存率を測定した。 IC50 値は挿入図に示されています。個々の測定値が表示されます。平均値は「X」として表示されます。黒のエラーバーは標準誤差測定値を表します。非線形回帰分析は補足資料に含まれています。 c 以前と同様に共局在化の時間経過。MGS4_V8-ストレプトアビジン-Qdot 輸送と MGS4_V8-サポリン輸送を比較します。ピクセルは、赤チャネル (x 軸) と緑チャネル (y 軸) の強度に基づいてプロットされます。ボックス 1 は、リソソームと共局在しないサポリンまたは Qdot の集団を表します。逆に、ボックス 2 は、Qdot またはサポリンシグナルに関連しないリソソーム染色を表します。ボックス 3 には共局在するピクセルが含まれており、黄色に誤って着色され、リソソームコンパートメント内で共局在するサポリンまたは Qdot を表します。サポリンを含む小胞の部分集団は、依然としてリソソームとは区別されます (ボックス 1)。すべての画像のスケールバーは 10 μm を表します。

MGS4_V8-サポリン複合体の細胞死を誘導する能力を測定した。 MGS4_V8-サポリンは、9.4 nM の IC50 で H1299 細胞を殺します。 H2009 細胞はわずかに耐性があり、IC50 は 23 nM です (図 4b)。二量体 MGS4_V9-サポリンの IC50 は、H1299 細胞および H2009 細胞に対してそれぞれ 7.2 nM および 40 nM です。 MGS4_V8単独も、サポリンなしでストレプトアビジンに結合したMGS4_V9も、200nMの濃度まで毒性を示さなかった（補足図4a）。さらに、サポリンと複合体を形成した不活性なMGS4_V6による処理は、200nMではH1299細胞およびH2009細胞において50％の細胞死には達しない。正常な対照HBEC細胞は、MGS4_V8またはMGS4_V6のいずれでも50％の細胞生存率に達しません（補足図4b）。 MGS4_V9 はどちらの細胞型でも EC50 が低いですが、二量体化によって IC50 やサポリン結合体の効力は改善されず、送達剤として単量体ペプチドの選択が有効であることがわかります。

サポリン染色 (図 4) は、以前の MGS4 染色 (図 3c) と驚くほど似ています: 点状で核周囲です。しかし、細胞死を誘導するには、内部移行したサポリンが細胞質内のリボソームにアクセスできるようにする必要があります。細胞生存率の結果は、少なくとも一部のサポリンが細胞質に到達したことを示唆しています。これはおそらく、リソソームに輸送される前にサポリンによって媒介されるエンドソーム脱出によるものと考えられます。エンドソーム脱出を観察するために、サポリンとリソソームの共局在を評価するための時間経過を実施した。ビオチン化MGS4_V8をストレプトアビジン-Qdot605またはストレプトアビジン-サポリンに結合し、その結合体をH1299細胞とともに30分間、1時間、3時間のチェイスで1時間、または23時間のチェイスで1時間インキュベートしました。サポリンと Qdot は両方とも、時間の経過とともにリソソーム (黄色) に移動し、蓄積します (図 4c)。ただし、リソソームへの輸送を回避するサポリンをロードした小胞 (赤色) の個別の集団が存在しますが、これは Qdot サンプルでは観察されません。これは特に 1 時間で顕著です。これらの非共局在性のサポリン含有小胞は、マンダー係数によって明らかです。サポリンは、1 時間 (それぞれ 0.334 対 0.549) および 24 時間 (それぞれ 0.657 対 0.758) で Qdots と比較して共局在が少ないことを示します (表 3)。これらのデータは、サポリンの一部がリソソーム輸送から細胞質ゾルへ逃れて、細胞を殺す作用を及ぼすことを示唆している。サポリンの活性は触媒作用があるため、効果的に死滅させるには少量で十分です。

送達剤としての MGS4 の使用は、動物の腫瘍を標的にするその能力に依存しています。 MGS4_V8およびMGS4_V6（コントロール）をAlexa Fluor 750に直接結合させました。各結合体を皮下H2009腫瘍を有する免疫不全マウスに静脈内注射し、ペプチドの蓄積を近赤外イメージングによって測定しました（図5a）。 MGS4_V8 腫瘍のホーミングは 12 時間で観察され、そのシグナルの 85% が 24 時間で維持されます。 MGS4_V8 シグナルは 48 時間および 72 時間でも残り、腫瘍内に色素が持続的に保持されていることを示しています。常に、MGS4_V8 のシグナルはコントロールペプチドと比較して 25 ～ 40 倍増加しています。比較すると、MGS4_V6 から生じるシグナルと未治療の腫瘍 (バックグラウンド) の間に統計的に有意な差はありません。 72 時間で ex vivo で画像化された腫瘍は、同様のパターンを示しました。腫瘍をパラホルムアルデヒドで固定し、LI-COR® Odyssey で腫瘍全体をイメージングしました（図 5b）。 MGS4_V8で治療したマウスから単離した腫瘍と、MGS4_V6対照で治療したマウスまたは未治療の腫瘍との間には、明らかな視覚的な違いが存在します。蛍光を定量化すると、MGS4_V8 で治療した腫瘍では MGS4_V6 グループと比較して 240 倍高いシグナルが得られます。皮下 H1299 腫瘍がマウスで確立された場合にも同様の結果が得られました (補足図 5)。これらのデータを総合すると、MGS4_V8 が in vivo で腫瘍を標的とするために必要な特異性、親和性、および安定性を備えていることが示されました。 72 時間でのシグナルの保持は、MGS4_V8 が腫瘍内の癌細胞に取り込まれ、NIR 色素が捕捉されたままであることを示唆しています。

H2009 腫瘍を有するヌードマウス (N = 4) に、NIR 色素 Alexa Fluor 750 を結合させた MGS4_V8 または MGS4_V6 を IV 注射しました。注射後 12、24、48、および 72 時間でマウスを麻酔し、IVIS® (Perkin Elmer) で画像化しました。 ) 各腫瘍の総放射効率を測定します。 MGS4_V8 は、対照ペプチド MGS4_V6 よりも 25 ～ 39 倍良く腫瘍に蓄積します。 MGS4_V6 の蓄積は統計的に未治療の腫瘍と何ら変わりません。実験終了時の腫瘍の ex vivo NIR イメージングは、生きた動物で観察されたデータを反映しています。ひげは最小値から最大値までを表し、25 ～ 75 パーセンタイルはボックスで表され、線は中央値を示し、+ 記号は平均値を表し、個々のデータは点として表示されます。個々の動物のデータは補足表 8 に含まれています。 b 前回の実験で切除した腫瘍を PBS + 4% ホルムアルデヒドで固定し、LI-COR® Odyssey で再度一緒に画像化しました。各腫瘍について任意の蛍光単位 (AFU) を決定し、平均値と SEM を画像の下に示します。 MGS4_V8-Alexa Fluor 750 コンジュゲートの平均蛍光強度は、MGS4_V6 コントロールコンジュゲートよりも 240 倍大きくなります。 c サポリンを標的MGS4_V8または非標的MGS4_V6のいずれかに結合させ、7.5μgの結合体を皮下腫瘍を有するマウスにIV注射した。動物には週２回、２．５週間投与した（矢印で示す）。腫瘍は一日おきに測定されました。 MGS4_V8-サポリンは腫瘍の増殖を明らかに遅らせますが、非標的サポリンは未治療の動物と比較して効果がありません。エラーバーは SEM、*p 値 < 0.05、**p 値 < 0.01、***p 値 < 0.001、****p 値 < 0.0001 (二元配置分散分析) を表します。 d 腫瘍サイズ (mm3) は、0、6、12、および 18 日目の個々の動物について示されています。平均値は水平線で表され、エラーバーは標準誤差を表します。どの日においても、MGS4_V6-サポリンと未処理の間に統計的な差はありません。 12 日目および 18 日目では、MGS4_V8-サポリンは未処理 (それぞれ p 値 0.0099 および 0.0029) および MGS4_V6-サポリン (それぞれ p 値 0.0069 および 0.0009) と統計的に異なります。

動物モデルにおける有効性を確立するために、H2009 腫瘍をメスのヌードマウスの脇腹に皮下移植しました。 H2009 腫瘍が約 100 mm3 に達したとき、マウスに 7.5 μg の MGS4_V8 サポリンまたは 7.5 μg のアセチル化 MGS4_V6 サポリン (対照ペプチド) を尾静脈から週 2 回、合計 5 回注射しました。 MGS4_V8を標的としたサポリンは、対照ペプチドと比較して腫瘍増殖を有意に遅らせた(図5c、d)。治療期間中に腫瘍が除去されるわけではありませんが、治療開始から最初の 10 日間は腫瘍体積は変化しませんでした。比較すると、非標的サポリンで治療した腫瘍はサイズが 3 倍に増加しました。 18日目までに、MGS4_V8を標的としたサポリンで治療した腫瘍は、いずれの対照群の腫瘍のサイズの半分になった。対照の非標的サポリン治療であるMGS4_V6-サポリンは、未治療の腫瘍と何ら変わりがなく、サポリンの送達にはMGS4_V8の必要性が強調されています。

腫瘍標的リガンドは、がんの薬物送達システムの重要なコンポーネントです。モノクローナル抗体は臨床的に利用可能な標的薬剤の中で最も先進的ですが、ペプチドが実行可能な代替手段として浮上しています 19、20、21。抗体と比較して、ペプチドは容易に合成され、安定性、親和性、特異性、溶解性、疎水性を迅速に繰り返し最適化できるため、開発時間が短縮され、生産コストが低くなります。ペプチドも小さいため、固形腫瘍の治療においてより深く浸透することが可能になります22。ほとんどのターゲティングペプチドは、ボンベシン、黄体形成ホルモン放出ホルモン、トリペプチド RGD など、がんで上方制御される受容体に結合する天然ペプチドリガンドまたは関連類似体に焦点を当てています。放射性標識ソマトスタチン誘導体である 177Lu-Dotatate は、2018 年初めに FDA の早期承認を受け、最初に承認されたペプチド薬物結合体です 23。パクリタキセルに結合した LDL 受容体関連タンパク質 1 を標的とするペプチドである ANG1005 は、脳転移の治療のための臨床試験中 24 であり、ソルチリン結合ペプチドと結合したドセタキセルである TH1902 は最近第 I 相臨床試験に入った 25。

ファージディスプレイされたペプチドライブラリーのバイオパニングにより、癌細胞に特異的に結合して内部移行を開始するペプチドの迅速な選択が可能になります11。ほとんどの化学療法薬には細胞内標的があるため、薬物送達用途では内部移行をスクリーニングする能力が鍵となります。内部移行しない、または細胞への取り込みが遅いリガンドおよび/または受容体は、適切な候補となる可能性は低いです。このアプローチは強力であり、高い細胞特異性を備えた多数のペプチド標的薬剤の同定につながりました 10。選択プロセスには偏りがなく、細胞表面レパートリーの知識は必要ありません。 MGS4 の細胞受容体は依然として不明ですが、ペプチド結合は、その細胞標的に関する知識がなくても、代替バイオマーカーとして機能する可能性があります。細胞受容体を特定し、正常組織におけるその発現レベルを確立するための研究が進行中です。

これらの選択からの最初のヒットはリード化合物であり、糸状ファージ上の pIII コートタンパク質への融合物として選択されます。ここで我々は、MGS4 の最小結合ドメインを特定し、それを化学的に最適化して親和性と安定性を向上させました。ペプチドは、血清安定性が限られており、親和性が低いため、抗体候補と比較して標的化剤として不十分であることがよく挙げられます。しかし、我々は、単量体ペプチドがその標的細胞に対してナノモルの低い親和性を持ち、そのサイズは1/100でありながら抗体に匹敵することを実証しました。両末端の修飾により、血清中のペプチドが安定化します。重要なのは、MGS4_V8 が細胞への急速な内部移行を引き起こすことです。これは、内部移行速度が遅い受容体に対して開発された多くの治療用抗体とは対照的です26,27。驚くべきことに、単量体バージョンは二量体および四量体ペプチドと同程度に内部移行し、同じ細胞内位置に移動します。細胞の種類に応じて、細胞あたり 40,000 ～ 100,000 分子のペプチドが 1 時間以内に取り込まれ、細胞内濃度は 40 ～ 100 nM に達します28。ペプチドの細胞内濃度が時間とともに増加するかどうかを確認するために、追加の速度論的研究が進行中です。注目すべきことに、腫瘍特異的標的に対するさまざまな親和性とさまざまな内在化速度を備えた一連のリガンドがあることは、親和性障壁に対処する方法として価値がある可能性があります 14。この現象は、リガンドが最初に遭遇した腫瘍細胞によって急速に隔離されるため、腫瘍への浸透を妨げることがあります。

MGS4_V8 は、細胞結合や特異性の特性を変えることなく、さまざまなカーゴを細胞内に運ぶように改変できます。これは、MGS4 がタンパク質 (ストレプトアビジン、サポリン)、色素、および量子ドットを送達したことから、この研究で明確に示されています。標的を絞った送達のための理想的な治療法には、いくつかの重要な特徴が備わっている必要があります。第一に、治療薬は送達剤と結合した場合を除いて細胞不透過性である必要があり、担体から早期に放出された場合の潜在的なオフターゲット効果を制限する必要があります。第二に、受容体を介した取り込みは細胞透過性小分子治療薬で達成可能な細胞内濃度に達する可能性が低いため、低用量で効果があるはずです。第三に、標的に到達するには細胞内小胞を回避する必要があります。サポリンはこれらの基準をすべて満たしています。これは、哺乳動物細胞に対する本来の指向性を持たないタイプ 1 RIP であり、送達媒体なしでは細胞膜を通過できません。 rRNA N-グリコシダーゼ酵素として、サポリンはリボソームの大きなサブユニットを触媒的に不活性化し、その標的を不活性化するのに化学量論量を必要としません。この活性は、静止細胞および活発に分裂している細胞におけるタンパク質合成を妨害します。サポリンは細胞内小胞を逃れて細胞質や他の細胞内小器官に到達することができます29。最後に、サポリンの N-グリコシダーゼ活性とは独立した追加の作用機序が特定され、潜在的な細胞毒性を増加させています 30、31、32、33。内部移行を引き起こす細胞特異的標的物質とサポリンの結合により、その治療の可能性が開かれます。

ビオチン化MGS4_V8をサポリン-ストレプトアビジン複合体に結合させると、細胞毒性物質が生成されます。サポリンの触媒的性質により、IC50 はペプチド結合および内部移行の EC50 よりも低くなります。潜在的な懸念の 1 つは、サポリンがリソソームに閉じ込められ、分解される可能性があることです。 MGS4_V8 ペプチドのエンドサイトーシスによりリソソームの蓄積が生じ、これは時間の経過とともに増加します。 30 分では、標識された MGS4_V8 はリソソームと共局在していませんが、おそらくエンドソームコンパートメントである点状小胞に見られます。 1 時間までに、ペプチドの 70% がリソソームに局在化します。しかし、MGS4_V8-サポリン複合体は細胞毒性を示しており、これはおそらくサポリンの一部がリソソーム輸送を回避しているためであると考えられます。我々の顕微鏡データは、リソソームと共局在していない別個の亜集団MGS4_V8-サポリンが存在することを示しており、これはサポリンのエンドソーム脱出能力と一致している。びまん性の細胞質染色は観察されないため、この集団は小さいと考えられますが、細胞の生存率に影響を与えるには十分な量です。サポリンのエンドソーム/リソソーム回避をさらに促進するアプローチにより、MGS4-サポリン複合体の有効性が向上する可能性があります 34、35、36。重要なことは、MGS4_V8 は、薬物結合体のリソソーム輸送により、薬物を放出するための酸不安定性リンカーまたはカテプシン切断可能なリンカーの使用を可能にする、ペプチド-薬物結合体としての可能性を持っていることです 21。

サポリン結合体は有用な生物学的ツールとして機能しているだけでなく、臨床治療薬としての可能性も秘めています 16、17、18。サポリンはさまざまな標的部分に結合されており、その大部分は抗体ベースです 37。我々は、MGS4_V8-サポリンがマウスモデルにおいて抗腫瘍効果を有することを実証する。非ターゲティング MGS4_V6 ペプチドを使用すると、未処理の対照と比較して腫瘍サイズは減少しません。完全な薬物動態および毒性プロファイルはまだ実施されていませんが、重大な毒性は観察されませんでした。オフターゲット効果に対処するには、完全な生体内分布研究と毒性学が必要です。さらに、MGS-サポリンリンカーの改良も必要です。しかし、これらのデータは、MGS4_V8 を静脈内に送達すると活性サポリンを動物の腫瘍に送達できることを示しており、前臨床モデルでのさらなる探索をサポートします。

免疫サポリン結合体の 2 つの第 I/II 相臨床試験が完了しました。最初の研究者は、難治性ホジキンリンパ腫の治療にマウス抗 CD30 抗体とサポリンの結合体を使用しました 38。有望な臨床反応にもかかわらず、患者は抗体と毒素の両方に対する免疫反応を発現しました。血管漏出症候群 (VLS) が用量制限毒性として観察されました。 CD22 とサポリンに対する二重特異性抗体を使用した 2 番目の試験では、VLS の低下や抗サポリン免疫応答の無さなど、副作用が少ないことが実証されました 39。どちらの試験も初期世代のマウス抗体を使用して実施されました。がん治療のためのサポリン結合体の最近の臨床試験は行われていないが、疼痛管理のためのサブスタンス P と結合したサポリンは第 I 相臨床試験 (NCT02036281) で安全であることが判明し、骨がんの犬の疼痛管理に使用することに成功した 40。

がんバイオマーカーに対する標的薬剤の数が増加することにより、免疫毒素への関心が高まっています41、42、43、44、45、46、47。免疫原性エピトープと VLS 活性を除去するための毒素の操作は、引き続き進歩しています 48、49、50、51。サポリンに加えて、植物由来の RIP 毒素ゲロニン、リシン、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質も免疫毒素に利用されており、これには難治性骨髄性悪性腫瘍の治療のための抗 CD33 ゲロニン免疫複合体の第 I 相試験の完了も含まれます 53。さらに、シュードモナス外毒素 A やジフテリア毒素などの細菌源由来の毒素は、免疫毒素の治療部分として利用されています 54、55、56、57。インターロイキン-2-ジフテリア毒素融合タンパク質である Ontak は、皮膚 T 細胞リンパ腫の治療薬として FDA に承認されましたが、製造上の問題によりその後販売中止になりました。 Tagraxofusp は、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍の治療のため、2018 年に臨床使用が承認された IL-3 標的ジフテリア毒素です 58。 CD22-PE38 複合体である Lumoxiti は、再発または難治性の有毛細胞白血病に対して 2018 年に FDA の承認を受けました 59。第 III 相試験では、患者の 30% で持続的な完全奏効が達成されました。

要約すると、我々は、活性タンパク質毒素をインビトロおよびインビボでNSCLC細胞に送達する能力を備えた、高親和性の癌特異的ペプチドを開発した。このペプチドは従来の ADC における抗体の代替として機能し、コストと生産時間を削減します。化学的に定義された方法でカーゴを化学的に結合できることは、ADC に比べて利点です。親MGS4ペプチドはNSCLCを超えて複数の癌細胞タイプに結合するため、MGS4_V8は他の癌タイプでも拡張された用途が見つかると予想されます。 MGS4 ペプチド変異体は、遺伝子工学または化学結合によってさまざまな異なるタンパク質毒素に組み込むことができ、その価値が広がります。

NovaPEG Rink Amide 樹脂および FMOC-Glu(ビオチニル-PEG)-OH は、NovaBiochem® (Millipore Sigma, Billerica, MA) から購入しました。 2-(6-クロロ-1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルアミニウムヘキサフルオロホスフェート (HCTU)、N,N-ジメチルメタンアミド、N-メチルモルホリン、2,2,2-トリフルオロ酢酸、およびすべてのFMOCアミノ酸はGyros Protein Technologies (アリゾナ州ツーソン) から購入しました。 FMOC-NH-(PEG)11-COOH (C42H65NO16) は、Polypure (ノルウェー、オスロ) から購入しました。トリイソプロピルシランと 1,2-エタンジチオールは、Sigma Aldrich (カリフォルニア州リバモア) から購入しました。ピペリジンはAlfa Aesar (マサチューセッツ州テュークスベリー) から購入し、アセトニトリル、ジクロロメタン、ジエチルエーテルは VWR (ペンシルベニア州ラドナー) から購入しました。

以下のＧＦＰ標識構築物を利用した：細胞膜標識Ｓｒｃ－ミリシル化－ＧＦＰ、ｐｍｙｒＧＦＰ（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド＃５０５２８）はＫｅｎｎｅｔｈＹａｍａｄａからの贈与である。ゴルジラベルベータ-1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ 1-GFP、PA-GFP (Addgene プラスミド # 57164)、リソソームラベル Lamp-1-GFP、Emerald-リソソーム-20 (Addgene プラスミド # 56476)。 ER ラベル SigPep-eGFP-KDEL、mEGFP-小胞体 (Addgene プラスミド # 56455)、ミトコンドリアラベル外膜のミトコンドリア輸入受容体サブユニットトランスロカーゼ 20 kDa サブユニット - GFP、mEmerald-TOMM20-N-10 (Addgene プラスミド # 54282)、核ラベル SV40 NLS-GFP、mEmerald-nucleus 7 (Addgene プラスミド # 54206)、および細胞質ラベル Argonaut 3 アイソフォーム A-GFP、mEmerald-EIF2C3-C18 (Addgene プラスミド # 54078) は、Michael Davidson からの贈り物でした。ゴルジ標識チロシルタンパク質硫酸転移酵素 2、TPST2-EGFP は、David Stephens から寄贈されました (Addgene プラスミド # 66618)。選択は、G418 中で、または限界希釈によって実行されました。

ペプチドの合成、切断、精製、および多量体化は、以前に発表されたように固相合成によって達成されました60。多量体ペプチドは、リジン (二量体) またはトリリジン (四量体) コア上で合成されました。ペプチド構造 (補足図 1) は補足資料で提供されます。ペプチドの質量はMALDI/TOF質量分析法で確認され、分析用HPLCで測定した純度>95%でした。

細胞株は、John Minna および Adi Gazdar (UT Southwestern Medical Center) から提供されるか、ATCC® から購入し、グルタミン + 5% ウシ胎児血清 (Gemini Bio-Products、カリフォルニア州サクラメント) を補充した RPMI で維持しました。細胞の遺伝子型を特定し（生合成、テキサス州ルイスビル）、同定を確認し、マイコプラズマ感染について毎月評価しました。

ビオチン化ペプチドをストレプトアビジン-R-フィコエリトリンまたはストレプトアビジン-Alexa Fluor 647 (1:1 モル比) に 30 分間結合させました。ストレプトアビジン上の開いた結合部位をRPMI 1640でクエンチし、指定の濃度に希釈しました。腫瘍細胞を12ウェルプレートで90%コンフルエンシーまで増殖させ、その後500μlのペプチド-色素複合体とともに37℃でインキュベートしました。 1 時間後、ペプチドを除去し、細胞を PBS (137 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na2HPO4、1.8 mM KH2PO4、pH 7.4) で 3 回、0.9% 中の 0.1 M HCl-グリシン pH2.2 で 2 回洗浄しました。 NaCl、および 1x PBS でリンスします。細胞をトリプシン処理により除去した。フローサイトメトリーは BD FACSCelesta で実行され、データは Flowing ソフトウェアで分析されました。生細胞のみを含むように前方散乱光と側方散乱光に基づいて細胞をゲートし、最低 10,000 個のイベントをカウントしました。ネガティブコントロール内の細胞の 5% 未満を含む領域が確立され、その集団の平均蛍光強度による相対的なペプチドの取り込みが決定されました 11。細胞あたりの絶対ペプチド取り込みについては、Quantum™ Alexa Fluor 647 ミクロスフェア (Bangs Laboratory、フィッシャーズ、インディアナ州) を使用して標準曲線を作成しました。分子等価可溶性蛍光体（MESF）と平均蛍光強度（MFI）の相関関係を示す代表的な線形回帰を補足図6に示します。細胞は、生存細胞のみと最小10,000個を含むように前方散乱光と側方散乱光に基づいてゲートされました。イベントがカウントされました。 MFI はピーク高さの 50% で測定されました。細胞ごとに内部移行した分子を、MESFとMFIを関連付ける標準曲線によって決定し、色素分子/MGS結合体の数で割った。例を補足の図 7 に示します。GraphPad Prism® を非線形回帰曲線フィッティングに使用して、EC50 を計算しました。パラメーターと統計分析が提供されます (補足表 2 ～ 6)。実験は最低 3 回繰り返されました。

GFPで標識された細胞小器官特異的マーカーを有するプラスミドをAddgene（マサチューセッツ州ケンブリッジ）から購入し、H1299細胞にエレクトロポレーションしました。 GFP 標識腫瘍細胞を 8 ウェルチャンバースライド上にプレーティングしました。ビオチン化ペプチドをストレプトアビジン-Alexa Fluor 555 (1:1)に室温で30分間結合させ、RPMIでクエンチし、その後50 nMでウェルに添加しました。 1時間のインキュベーション後、細胞を記載どおりに洗浄しました。細胞は 2% ホルムアルデヒドで固定されました。 DAPI を含む EverBrite™ (Biotium、Freemont、CA) 封入媒体を使用しました。指示されている場合、Alexa Fluor 488 で標識した小麦胚芽凝集素 (WGA) を使用して細胞表面を対比染色しました。顕微鏡検査は、Pln Apo 63x/1.4 オイル DIC III 対物レンズを備えた Zeiss LSM 700 で取得しました。画像は Zen ソフトウェアを使用して処理されました。

リソソーム蓄積の時間経過は、ストレプトアビジン-Alexa Fluor 555、ストレプトアビジン-Qdot605、またはストレプトアビジン-サポリンに結合したビオチン化ペプチドを使用して、指定された時点でイメージングすることによって実行されました。サポリンは、抗サポリンウサギポリクローナル抗体 AB-41AP (1:100 希釈) (Advanced Targeting Systems Bio、カリフォルニア州サンディエゴ) を使用して検出しました。閾値は、赤色チャンネルのペプチドを表す Ch1 (75)、および緑色チャンネルのリソソームを表す Ch2 (55) に対して確立されました。単一スライスの各ピクセルは、赤 (ボックス 1)、緑 (ボックス 2)、または両方 (ボックス 3) で共局在化のしきい値を通過するかどうか評価されました。マンダー係数はスライスごとに計算されます。0 は共局在化がないことを示し、1 は完全な共局在化を示します。

ビオチン化ペプチドをストレプトアビジン-サポリン(Advanced Targeting Systems Bio、カリフォルニア州サンディエゴ)に1:1のモル比で結合させた。漸増用量のペプチド-薬物結合体を3回繰り返し、細胞上で37℃で6時間インキュベートした。薬物を除去し、完全な増殖培地に置き換えた。 72時間後、CellTiter-GLO(登録商標)(Promega、ウィスコンシン州マディソン)を使用して細胞生存率を測定した。細胞生存率は未処理の細胞に対して正規化しました。 IC50 は、GraphPad Prism® を使用し、対数 (アゴニスト) 対応答 - 変数の傾き (4 つのパラメーター) を使用して計算されました。個々の実験からのデータ、パラメータおよび統計分析は補足資料に記載されています。各変異体および細胞株について、少なくとも 4 つの生物学的複製が実行されました。

動物実験は、SRI インターナショナルの施設内動物管理使用委員会によって承認されました (動物福祉保証番号 A3025-01、プロトコル 14008)。Ｈ２００９細胞（１０６個）またはＨ１２９９細胞（１０６個）を雌Ｎｕ／Ｎｕマウス（メイン州バーハーバーのＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｙ）の脇腹に皮下移植した。腫瘍が 100 mm3 に達したとき、in vivo 実験が開始されました。イメージングのために、示されたペプチドは Alexa Fluor 750 近赤外色素に直接結合されました (補足図 1)。１グループあたり４匹の動物を使用した。ペプチドを外側尾静脈に注射し、総用量15μgs/マウスを100μLで送達した。設定された時間で、動物に麻酔をかけ、IVIS® (Perkin Elmer) で画像化しました。腫瘍の周囲に関心領域を描画し、総放射効率を測定しました。治療実験では、H1299 モデルよりも腫瘍の生着率が高く、成長速度がより安定しているため、H2009 腫瘍モデルを使用することを選択しました。ビオチン化 MGS4_V8 (N = 9) または MGS4_V6 (N = 8) をストレプトアビジンサポリンに結合させ、尾静脈注射 (7.5 μg/100 μl) を週 2 回、2.5 週間、合計 5 回の治療で投与しました。未処理の動物 (N = 8) を対照として使用しました。腫瘍のサイズをキャリパーで隔日測定し、体積を(π/6)(l*w)3/2として計算した。統計分析は GraphPad Prism® で実行されました。

すべての EC50 測定では、各ペプチド変異体を指定の細胞株で少なくとも 3 つの生物学的複製でテストし、フローサイトメトリーで個別に分析しました。各濃度の標準誤差測定値は、図中の誤差バーで示されています。内部移行した分子の絶対数をさまざまな濃度で測定する実験では、対数（アゴニスト）対応答変数の傾き（4 つのパラメーター）の非線形回帰曲線フィッティングを使用して、GraphPad Prism® によって EC50 を決定しました。切断実験では、1 部位特異的結合を使用して EC50 を決定しました。同様に、IC50 は、GraphPad Prism® を使用して、対数 (アゴニスト) 対応答 - 変数の傾き (4 つのパラメーター) を使用して計算されました。各変異体および細胞株について、少なくとも 4 つの生物学的複製が実行されました。個々の実験のデータは補足ファイルに含まれています。パラメーターと統計分析は補足表 2 ～ 7 に示されています。

インビボ治療実験では、MGS4_V8 については N = 9、MGS4_V6 については N = 8、未治療については N = 8 の動物グループサイズを使用しました。腫瘍は、治療グループについての知識を持たない独立した研究者によって測定されました。 SEM は図上に誤差バーとして表示されます。腫瘍の画像化には、グループあたり 4 匹の動物を使用し、エラーバーは標準誤差測定値を表します。すべての in vivo 実験について、個々のマウスのデータは補足表 9 に含まれています。統計的有意性は、Tukey の多重比較検定を使用した二元配置 ANOVA によって決定されました。 P 値 < 0.05 は有意とみなされ、図では *p 値 < 0.05、**p 値 < 0.01、***p 値 < 0.001、****p 値 < 0.0001 として表されます。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

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Emily Miller さんの技術支援に感謝いたします。この研究は、国立衛生研究所 [IRO1CA164447-01] および SRI インターナショナルの内部研究開発資金によって支援されました。

SRI International、バイオサイエンス部門、140 Research Drive、ハリソンバーグ、バージニア州、22802、米国

カーティス・A・アルレッド、クレア・ゴームリー、インドゥ・ヴェヌゴパル、シュンジ・リー、マイケル・J・マクガイア、キャスリン・C・ブラウン

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研究のコンセプトと設計は CAAMJM および KCB によって実行されましたデータの取得は CAA、CG、および IV によって実行されましたペプチドの合成と特性評価は SL によって実行されましたデータの分析と解釈は CAA、CG、IV、MJM、および KCB によって実行されました製図原稿の執筆は CAA によって行われ、KCB 資金は KCB によって獲得されました。

キャスリン・C・ブラウンへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Communications Biology は、この研究の査読に貢献してくれた Manish Charan 氏、Andrea Bolognesi 氏、およびその他の匿名の査読者に感謝します。主な編集者: Marina Holz と Karli Montague-Cardoso。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

Allred, CA、Gormley, C.、Venugopal, I. et al. 腫瘍特異的細胞内送達: 触媒毒素のペプチド誘導輸送。 Commun Biol 6、60 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s42003-022-04385-7

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受信日: 2021 年 6 月 1 日

受理日: 2022 年 12 月 20 日

公開日: 2023 年 1 月 17 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-022-04385-7

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