ナイシンによる腸内微生物叢の調節 - 株式会社コーストワイズ・ベンチャーズ・グループ

Scientific Reports volume 13、記事番号: 7899 (2023) この記事を引用

1252 アクセス

32 オルトメトリック

メトリクスの詳細

ナイシンは、約 1 世紀前にラクトコッカスラクティスで同定された、食品保存料として広く使用されている広域スペクトルのバクテリオシンです。われわれは、経口摂取されたナイシンがブタの消化管をそのままの状態で通過し（活性と分子量測定によって証明される）、微生物叢の組成と機能の両方に影響を与えることを示す。具体的には、ナイシン処理によりグラム陽性菌が可逆的に減少し、その結果ファーミクテス属の再形成が起こり、それに対応してグラム陰性プロテオバクテリアが相対的に増加しました。これらの変化は、酢酸、酪酸（減少）、プロピオン酸（増加）の合成に関与する経路の相対的存在量の変化によって反映されており、これは便中の短鎖脂肪酸レベルの全体的な減少と相関していました。ナイシンの摂取の結果として起こるこれらの可逆的な変化は、ナイシンのようなバクテリオシンが哺乳類のマイクロバイオームを形成し、生物群集の機能に影響を与える可能性を示しています。

バクテリオシンは、多くの細菌種によって産生される抗菌ペプチドです1。ナイシンは、ラクトコッカスラクティスによって産生されるバクテリオシンで、グラム陽性菌に対して広範囲の活性を持っています2,3。ナイシン A は、米国食品医薬品局 (FDA) (米国食品医薬品局、1988 年) および欧州食品安全機関 (EFSA; E 番号 E234) によって食品保存料としての使用が承認されており、人間によって摂取されています4。ナイシン (市販のナイサプリンの形) は、体重 1 kg あたり最大 239 mg の用量でラットに与えられても副作用はありません 5。ナイシンは、クロストリディオイデスディフィシルなどのグラム陽性腸管病原体に対して in vitro で有効であり 6、シンナムアルデヒドおよびエチレンジアミン四酢酸 (EDTA) と組み合わせると、グラム陰性腸毒素原性大腸菌 (ETEC) の増殖を制御することが示されています 7。ナイシンは、マウス 8,9 およびニワトリのマイクロバイオーム 10 に対して in vivo で効果があること、またヒトのマイクロバイオーム 11 に対して ex vivo で効果があることも示されています。それにもかかわらず、これまでのところ、大型哺乳類に対する生体内での有効性を示した研究はありません。他のバクテリオシン、すなわちラクチシン 314712 およびツリシン CD13 について以前に示したように、ナイシンはそのタンパク質性の性質のため、タンパク質分解酵素への曝露により腸上部で分解されると考えられてきました。ナイシンが消化管下部にそのまま到達しない場合14,15、経口摂取しても腸内細菌叢に影響を与えることはありません。この研究では、16S シーケンス、メタゲノミクス (ショットガン)、GC-MS、および Maldi-Tof MS を使用して、腸内細菌叢に対するナイシンの影響を調べるために、離乳後の子豚に高濃度のナイシンを与えました。また、上部GIT16での分解の可能性からナイシンを保護（カプセル化）し、カプセル化されていないナイシンと比較するためのエチルセルロースベースの調製物も含めましたが、これは以前の研究ではテストされていませんでした。

今回我々は、無傷の非カプセル化ナイシンがブタの胃腸管下部に送達され、治療期間を通じて微生物組成、短鎖脂肪酸（SCFA）レベル、特定の代謝経路に重大かつ可逆的な変化を引き起こすことを実証する。

この研究の目的は、経口摂取されたナイシンがそのままの状態で腸に到達し、ブタの腸内微生物叢を調節できるかどうかを評価することでした（図1a）。ナイシンはタンパク性であるため、非カプセル化ナイシン (Nis-pdr) とカプセル化ナイシン (Nis-en) の両方を使用し、これらを豚の飼料に直接添加しました。この研究には、無治療対照群 (Ctl) とナイシンをカプセル化するために使用された物質 (Encap) を与えられた群も含まれていました。最後に、治療中止後の腸内細菌叢の組成と機能を監視し、変化がどのくらいの期間持続するかを判断しました。

実験、質量分析、メタボロミクスの結果の概要。 (a) 治療グループとサンプリングのタイムラインの概要。 (b) ナイシンを検出するための MALDI TOF 質量分光光度分析および活性アッセイ (写真)。ベースライン (BL)、初回治療の 24 時間後 (T24)、初回治療の 48 時間後 (T48)、初回治療の 72 時間後 (T72) で、ナイシン粉末治療群のブタの糞便中に無傷のナイシン (赤い矢印) が検出されました。）、最初の治療停止から72時間後（3d PT）、および最初の治療停止から10日後（10d PT）。 7 日目にはより小さなゾーンとナイシンの塊が見つかりましたが、14 日目にはゾーンや塊は見つかりませんでした (10 ディルに 1 個)。 (c) Maldi TOF 質量分光光度法を使用した、ナイシンの生物活性およびブタ糞便サンプルにおけるナイシンのピーク検出。（ d ）BL、T72、および10d PTにわたる対照（ここではCtlとEncapを一緒にグループ化）対ナイシングループ（ここではnis-enとnis-pdrを一緒にグループ化）におけるSCFA濃度（mM）（Wilcoxon Rank Sum test、*p < 0.05）、**p < 0.01、***p < 0.001)。

MALDI TOF質量分析法と活性アッセイの両方により、カプセル化ナイシンおよびナイシン粉末処理グループの両方において、処理期間を通じてすべてのブタの糞便中に無傷のナイシンと抗菌活性が存在することが確認されました（図1b）。この分析により、2つのナイシン処理グループ（Nis-enおよびNis-pdr）の処理日に、無傷のナイシンの分子量（3331.05 Da）に対応するピークが明らかになりました（Nis-enについては補足図5を参照）。ウェル拡散アッセイで測定した生物活性は、治療中止後 3 日間、カプセル化ナイシンおよびナイシン粉末群のすべてのブタの糞便で確認されました。ただし、ゾーンのサイズはナイシン治療日に観察されたものよりも小さかった（図1b、c）。無傷で活性なナイシンは、ベースライン (BL) サンプル、カプセル化剤グループ (Encap)、無治療対照グループ (Ctl) のいずれにも、あるいは治療終了 10 日後に採取されたサンプル (10 日間 PT) でも検出されませんでした。。

ベースライン（BL）、連続4日間の治療後（T72）、および治療終了10日後（10d PT）に採取した糞便サンプルを分析して、SCFA濃度を測定しました。ターゲットを絞った方法を使用して、10 種類の化合物 (酢酸塩、ギ酸、プロピオン酸、酪酸塩、イソ酪酸、イソ吉草酸、吉草酸、4-メチルペンタン酸、ヘキサン酸、ヘプタン酸) についてサンプルを分析しました。 4-メチルペンタン酸は 5 つのサンプルでのみ検出され、すべてのケースで検出限界に非常に近いレベルでした。ヘキサン酸およびヘプタン酸は、ベースライン (BL) サンプルのレベルがサンプルの 50% 以上で検出限界を下回っていたため、さらなる分析から除外されました。したがって、酪酸塩、酢酸塩、イソ吉草酸、イソ酪酸、吉草酸、プロピオン酸の 6 つの化合物が統計分析に含まれました (補足表 2)。被験者の治療に関連する差異を検定するために、対照群（CtlとEncapを一緒にグループ化）と治療群（nis-enとnis-pdrを一緒にグループ化）を異なる時点で比較するウィルコクソン順位和検定を実施しました。結果は、酢酸 (p = 0.004、差 40.13%)、酪酸 (p = 0.0012、差 66.15%)、イソ酪酸 (p = 0.03、差 36.47%)、およびイソ吉草酸 (p = 0.035、36.36%の差）、T72での対照群と比較したナイシン治療群における（図1d）。治療群間で他の有意差は観察されませんでした。治療中止から 10 日後、酪酸レベルのみが有意に低いままです (p = 0.048)。サンプル間のSCFAレベルの最大の変動は、処理の10日後に観察されました。

飼料転換率 (FCR) は、豚の飼料効率を測定するために使用される一般的な指標です。試験期間全体で、1 日の平均体重増加と 1 日の平均飼料摂取量が増加しました。処理グループ間で豚の生体重に差はありませんでした（補足図S1a）。研究期間が短かったことを考えると、これは予想外のことではありませんでした。ブタの成長成績を補足図S1bに示します。

ショットガンメタゲノミクスと16S rRNAプロファイリングの両方を使用して、3つの異なる時点（BL、T72、10日PT）で異なる治療グループの微生物群集組成を評価しました。ベースラインサンプル（主にバチルス属、クロストリジウム属、エリシペロトリキア属、ネガティビクテス属）の全処理群で最も豊富な門はファーミクテス属であり、次にバクテロイデス属が続いたが、放線菌とプロテオバクテリアはそれほど豊富ではなかった（図2a、b）。研究全体を通して、治療グループ間の微生物叢組成の変化が観察されました。連続 3 日間の治療後 (T72)、未治療群と治療群の間でコミュニティ全体の構成に有意な差がありました (p < 0.001、PERMANOVA)。特に、ナイシン治療群ではファーミキューテス属の構成に再形成が見られ、ネガティブビキューテス属の増加とバチルス属の種の減少が見られた。ナイシン処理グループではプロテオバクテリア（主にガンマプロテオバクテリア）の増加も観察され、Nis-pdr グループが最大の増加を示しました（BL に対して 360%）。ナイシン治療群で観察されたこの変化は、治療終了10日後にベースラインレベルと同様の組成に戻った。対照群およびカプセル化剤群の微生物叢組成は試験期間を通じて比較的安定しており、時間の経過とともに放線菌が顕著に継続的に増加し、T72 ではファーミキューテス属 (クロストリジウム属の減少を伴うバチルス属の増加) にも小さな変化が見られました。封止材グループ内。全体として、16S rRNAでも同じ結果が観察されました（補足図S2）。

マイクロバイオーム群集の構成とベータ多様性は、T72 でのナイシン治療では大きく異なりますが、アルファ多様性は異なりません。 (a) クラスレベルでの、さまざまな対照群とナイシン治療群におけるマイクロバイオームの相対存在量を示すサンキープロット。赤い矢印と点線は、サンプル中のナイシンの最高用量に対応します。 (b) 門レベルでの異なる対照群とナイシン治療群におけるマイクロバイオームの相対存在量を示すサンキープロット。赤い矢印と点線は、サンプル中のナイシンの最高用量に対応します。 (c) シャノン指数を使用して測定されたアルファ多様性は、T72 でグループ間で有意に変化します (ウィルコクソン順位和検定、*p < 0.05、**p < 0.01)。灰色とピンクの領域は、それぞれ対照群 (Encap と Ctl) とナイシン治療群 (Nis-en と Nis-pdr) を示します。 (d) シャノン指数を使用して測定されたアルファ多様性。各グループ内に表示されます。有意な差は観察されませんでした。（ e ）T72でのNis-enとNis-pdrからのサンプルがほとんどグループ化されていることを示すPCoA順序（ブレイ-カーティス距離）（それぞれ青とピンクの楕円）。楕円は、T72 での各調査領域グループのクラスター重心付近の 95% CI を表します。（ f ）T72でのNis-enとNis-pdrからのサンプルがほとんどグループ化されていることを示すPCoA順序（Unifrac距離）（それぞれ青とピンクの楕円）。楕円は、T72 での各調査領域グループのクラスター重心付近の 95% CI を表します。

シャノン指数を使用して測定されたアルファ多様性は、ベースラインでは治療グループ間に有意差がないことを示しています（図 2c）。無治療対照群と比較して、ナイシン治療群間には治療期間終了時（T72）に有意な差があった（Wilcoxon Rank Sum test、Nis-en 群と Nis-pdr 群ではそれぞれ p < 0.05 および p < 0.01）。）。しかし、T72をベースラインおよび10日PTと比較した場合、この差は各グループ内で観察されず、ナイシン治療がアルファ多様性に有意な影響を与えなかったことを示唆しています（図2d）。連続３日間の治療後、対照群とカプセル化剤群との間に有意差は観察されなかった。

治療グループと時点の多様性の違いをさらに調査するために、Bray-Curtis（図2e）およびUnifrac（図2f）距離に基づくベータ多様性を評価しました。すべての治療グループのベースラインサンプルがクラスター化されました。連続 3 日間 (T72) の処理餌を与えた後、ナイシン処理群では非ナイシン処理群と比較して多様性に変化が見られました (BH adj. p < 0.01、Bray-Curtis および Unifrac 距離の PERMANOVA)。治療薬の給餌を停止してから 10 日後、ナイシン治療群のベータ多様性は再び非ナイシン治療群のベータ多様性と同等になりました。

連続 3 日後にナイシン粉末処理グループ内でどの種が相互に最も変化したかを特定するために、相対存在量に基づいて差分ランキング (DR) 法を使用した差分存在量分析を使用しました。差分ランキングは、種レベルでの差分存在量を対数倍率変化に基づく多項回帰として再定式化します。係数が高い種（図3a）（陽性（青）または陰性（赤）、比較の基準はT72のナイシン治療群）は、T72の治療期間中にナイシン治療群の種を最もよく区別することができました。

ナイシン治療中にグラム陽性菌は大幅に減少しますが、グラム陰性菌は大幅に増加します。 (a) Songbird で作成された多項回帰分析のモデル係数 (モデル: 種 ~ ナイシン治療 x 日) は、T72 で nis-pdr に従ってランク付けされました。係数が高い種（陽性で nis-pdr T72 が豊富、青、または陰性で nis-pdr T72 が少ない、赤、ピンク、グラム陽性、紫、グラム陰性）を持つ種は、nis-pdr を最もよく区別できました。 T72で治療中のグループ。 (b) 正の係数を持つ上位 10 種の個体レベルでの群集構成 (灰色、対照群、ピンク、ナイシン処理)。 (c) 負の係数を持つ上位 10 種の個体レベルでの群集構成 (灰色、対照群、ピンク、ナイシン処理)。（ d ）nis-pdrベースラインおよびnis-pdr 10日PTの両方と比較して、nis-pdr T72中にのみ有意に減少した種の相対存在量を示す箱ひげ図（Wilcoxon Rank Sum test、* p < 0.05、 ** p < 0.01）、***p < 0.001)。 Prevotella sp CAG 520 (ピンク) を除き、すべてグラム陽性 (紫) です。

T72のナイシン治療群で示差的に減少した20種の細菌のうち、16種がグラム陽性であった（図3a、c）。特に、Anaerostipes hadrus、Bifidobacterium pseudocatenulatum、および Dorealongicatena は、すべての豚でナイシン処理中に検出されず、したがってナイシンに対して最も反応性が高いです。 T72で治療群で有意に減少したグラム陰性菌はすべてプレボテラ属に由来していた。カテニバクテリウム・ミツオカイ、コリンセラ・エアロファシエンス、ラクトバチルス・ジョンソニー、ラクトバチルス・ロイテリなどの他のグラム陽性種は、T72のNis-pdrでより有意に減少するか、または減少するだけでした（図3c、d）。個人レベルではかなりのばらつきがあるにもかかわらず、Nis-pdr 処理によりサンプル間のばらつきが説明されました。 Nis-pdrに焦点を当てると、T72で大幅に減少した種はすべて10日後に治療前のレベルに戻ったことが明らかになりました（図3d）。

T72のナイシン治療群で差次的に増加した20種の細菌のうち、17種はグラム陰性菌でした（図3a、b）。アシダミノコッカス・ファーメンタンス、大腸菌、ファスコラルクトバクテリウム・サクシナトゥテンス、プレボテラ・コプリなどの種は、T72 でナイシン治療を受けたほぼすべての個体で差次的に増加しました。 T72 でナイシン治療を受けた個体に特異的に多く存在した唯一のグラム陽性菌種は、Dorea foricigenerans、Eubacterium callanderians、および Ruminococcus sp. でした。 CAG624。

まとめると、結果は、特にナイシンを与えた日の Nis-pdr グループでは、グラム陽性菌がナイシン投与群では過小評価され、一方、グラム陰性菌が過剰に存在したことを示しています。しかしながら、治療の中止後、ナイシン治療群におけるこれらの微生物群集は、10日間のPTで見られるように、治療前のレベルと同様のレベルに戻った。

微生物群集の機能プロファイルは、ショットガンメタゲノミクスを使用して評価されました。遺伝子数（100万あたりの数）の主座標分析（PCoA）により、T72でのナイシン処理グループの微生物機能プロファイルが他のグループとは有意に異なることが明らかになりました（PERMANOVA、BH adj. p < 0.01）（図4a）。さらに、ナイシン治療群は、メタゲノミクスデータで見つかった経路のほとんどについて、T72での治療期間中に分岐した代謝経路プロファイルを示しました（MetaCYC経路、ウィルコクソン順位和検定、p < 0.01）（図4b）。アミノ酸 - 酸 - 生合成やヌクレオチド - 生合成などの経路は、治療グループや時点によって変化しませんでした。これらの経路はすべての細菌によって使用されており、細菌組成の変化は細菌に影響を及ぼさないと考えられます。逆に、ビタミン生合成、脂質生合成、硫黄代謝、脂肪酸と脂質の分解、芳香族化合物の分解などの経路の相対的な存在量はすべて、T72 のナイシン治療群で増加し、一方呼吸経路は減少しました ( p < 0.01 は、BL を基準とした log2 倍率変化の Wilcoxon 順位和検定に基づいています)。細胞構造生合成経路などの一部の経路は、ナイシンが細胞膜に作用するため、おそらく直接ナイシンの影響を受けると考えられます。この経路存在量の違いは、ナイシン処理後の細菌組成の変化も反映しています。これをさらに調査するために、以前に説明したツール Songbird を使用して、種ごとに階層化された、より低い階層で最も差次的に豊富な代謝経路を調べました（図 4c）。ナイシン治療群は、ベースラインと 10 日目の PT の両方で同様の異なる存在量プロファイルを示しました。 T72でナイシン処理グループとより関連性の高い経路（図4cの青）は、これらの時点でこれらのグループでより豊富であることが以前に判明したグラム陰性細菌（すなわち、大腸菌およびミツオケラ・ジャラルディーニ）に属します。同様に、ベースラインおよび10日間のPTでナイシン治療群とより関連していた経路（したがって、T72ではほとんど存在しない）は、これらの群およびこれらの時点でより豊富であることが以前に同定されていたグラム陽性菌（すなわち、Lactobacillus johnsoniiおよびRoseburia）に属する。 sp CAG 471)、以前に同定されていなかった Butyricicoccus porcorum を除く。注目すべきことに、2つの経路（L-アルギニン生合成とガラクトース分解）は両方とも、T72でのナイシン処理群とベースラインおよび10日PTでのナイシン処理群に関連していたが、異なる細菌によって運ばれており、おそらくグラム陽性種が細菌によって置き換えられたことを反映している。グラム陰性種は、少なくとも部分的に同様の機能を実行します。それにもかかわらず、いくつかの機能は、T72 でナイシンで処理されたグループに特有であるように思われる。例えば、T72 でナイシン処理群と最も関連していた経路は、主にグラム陰性菌に見出されるシデロフォアであるエンテロバクチン生合成でした。

対照群と治療群の機能分析。（ a ）T72におけるNis-enおよびNis-pdrと他のグループのHUMAnN遺伝子数（100万あたりの数）のPCoA順序（ブレイ-カーティス距離）。（b）さまざまな時点でのさまざまなグループのMetaCyc経路レベルの最高階層における機能組成（log（HUMAnN count per million））を示すヒートマップ（灰色のエリア、コントロールグループ、ピンクのエリア、治療グループ、赤い矢印が対応）サンプル中のナイシンの最高用量まで)。経路はユークリッド距離を使用して階層的にクラスター化されます。（c）ベースライン対T72（左）および10日におけるナイシン（Nis-enおよびNis-pdr）グループのSongbirdスコア（モデル：パスウェイ〜ナイシン治療x日）に応じて、最も差次的に豊富なHUManNパスウェイの上位30を示すヒートマップPT 対 T72 (右)。これらの経路は種ごとに階層化されています (右側のバーに表示)。ここでは、最もポジティブな上位 15 経路（つまり、ベースライン (左) または 10 日間 PT (右) でナイシンとの関連性が高い) と、最もネガティブな経路上位 15 位 (つまり、T72 でナイシンとの関連性が高い) を示します。（ d ）さまざまな時点でのさまざまなグループにおけるSCFA産生に関与する経路の豊富さ（100万あたりのHUMAnN数）とそれらの差異（Wilcoxon Rank Sum test、*****p < 0.0001、***p < 0.001、 **p < 0.01、*p < 0.05、ns: 有意差なし)。（ e ）それぞれのベースラインと比較した、ナイシン処理群における遺伝子存在量が最も高いおよび最も低い上位20種のlog2倍変化。

次に、異なるグループにおける異なる時点での SCFA 産生に関与する遺伝子の発現を評価しました。カプセル化ナイシン群およびナイシン粉末処理群では、ベースラインとT72の間で酪酸の生成に関与する遺伝子の量が大幅に減少しました（ウィルコクソン順位和検定、それぞれp < 0.0001およびp < 0.01）（図4d））。 10 日 PT では、これらの遺伝子の発現が大幅に増加しました (Wilcoxon Rank Sum 検定、p < 0.05)。同様に、このパターンは酢酸生成に関連する遺伝子でも観察されました。 Nis-en では、ベースラインと T72 の間でプロピオン酸生成に関与する遺伝子の有意な増加が観察されました。治療の中止後、これらのレベルはベースラインレベルに戻りました。また、SCFA産生に関与する遺伝子の豊富さを、それらを保有する種によって階層化して調べました（図4e）。 BLに関連するナイシン処理における遺伝子存在量のlog2倍変化の最高および最低の上位10種は、SCFA産生に関与する種が、ナイシン処理中に酢酸塩および酪酸塩の大部分がグラム陽性から大部分がグラム陰性へと変化したことを示した。特に、ファーミクテス属は、酢酸菌やプレボテラ属の大腸菌などのグラム陰性菌に置き換えられます。酪酸塩の場合。驚くべきことに、プロピオン酸では反対のことが観察され、ナイシン処理中にグラム陽性種、すなわちルミノコッカス属によってもたらされる遺伝子量が増加した。これは、以前に示したナイシン処理中の一部のルミノコッカス種の増加に関連している可能性があります（図4a）。全体的に、これらの結果は、主にグラム陽性菌のグラム陰性菌による置換により、ナイシン処理中に群集構造が機能的に変化したことを示しています。、治療薬の供給が中止されると回復します。

われわれは、無毒性量（NOAEL）17をはるかに下回る濃度で使用したナイシンが、腸管通過中に無傷のままであり、ブタの腸内微生物叢を改変することに成功し、多くのグラム陽性微生物の相対存在量を減少させることに成功したことを明らかにした。私たちは、ナイシンなどのランチビオティックに存在する翻訳後修飾が腸内環境でこれらのバクテリオシンを保護していると仮説を立てています。対照的に、これらの修飾なしで合成されたプレナイシンペプチドは、トリプシンおよびキモトリプシンによって容易に消化されます（補足図S4）。私たちの研究結果は、バクテリオシン研究における主要な定説、つまりバクテリオシンは腸内でプロテアーゼによって分解されて不活性になり、したがってカプセル化されない限り経口送達には適さないという概念に疑問を投げかけるものである。それどころか、我々は、ナイシンが大型動物に摂取された場合に腸内マイクロバイオームを改変するのに十分な量で胃内通過を生き延びることができることを実証し、腸内マイクロバイオームを改変するツールとしてランチビオティックを使用できる可能性を強調しています。

ナイシン治療群の腸内微生物叢の組成は治療中に影響を受けたが、治療終了後3日以内に未治療群と同様のレベルに戻り、多様性には大きな影響はなかった。さらに、ナイシン粉末の方がカプセル化されたナイシンよりも効率的であることも観察しました。ナイシンによる治療により、治療中に乳酸菌などのグラム陽性菌が減少し、大腸菌などのグラム陰性菌が相対的に増加しました。ナイシン処理はグラム陽性菌に選択的な効果をもたらし、これらの菌はグラム陰性菌に置き換わる可能性があります。興味深いことに、一部のグラム陰性菌、特にプレボテラは、ナイシン Z18 で以前に示されたように、ナイシン処理に感受性がある一方、一部のグラム陽性菌、例えばルミノコッカスはナイシンに対して免疫があるようです。さらに、対照群およびナイシン粉末群と比較して、カプセル化剤対照群およびカプセル化ナイシン群の両方で高レベルのカテニバクテリウムが見出された。これは、カテニバクテリウムがセルロースカプセル材料を潜在的に分解し、それをエネルギー源として使用していることを示唆しています。

また、ナイシン治療中にナイシン治療群の機能レベルでの変化も観察され、分類学的組成の変化を反映して、最も異なって増加した経路はすべてグラム陰性菌に関連し、最も異なって減少した経路はすべてグラム陽性菌に関連していた。グラム陽性種（例：ローズブリア）の一部の経路は、グラム陰性種（例：大腸菌）に存在する同じ経路に置き換えられており、生態学的ニッチの置き換えの可能性が指摘されています。しかし、グラム陰性菌に特有の他の経路（例、大腸菌に関連するエンテロバクチン）も増加しており、グラム陽性菌によるグラム陰性菌による置換は機能的に完全に同等ではないことが示されており、これは高次にも見られることである。階層経路はほとんどBLとは異なっていました（図4b）。さらに、グラム陽性菌とグラム陰性菌の両方によるナイシン誘発性ストレスへの適応に潜在的に関連する経路の増加が観察されました。たとえば、ビタミンに関連する経路の増加が観察されました（特にメナキノン、補足図S3を参照）。多くの細菌では、細菌の細胞膜に挿入される脂溶性分子であるメナキノンの合成が細胞膜の状態によって影響を受ける可能性があり 19、ナイシンがその作用機序に応じて微生物叢に与える影響についての洞察が得られるこれにはリピド II への結合が含まれます。

我々は、T72 でナイシン治療群の SCFA レベルの全体的な減少を観察しました。ナイシン治療群では治療終了から 10 日後にこれらの値は回復したが、カプセル化材料を与えた群または無治療の対照群よりも低いレベルに戻った。ラクトバチルスとカテニバクテリウムは、オリゴ糖やデンプンなどの炭水化物を代謝することが示されており、これらは大腸内で発酵して SCFA となり、ブタによって利用されます 20、21、22、23。それらの減少はおそらく、SCFA の減少を少なくとも部分的に説明します。これは、酢酸塩に対するカテニバクテリウムの減少に特に当てはまり、大腸菌などのグラム陰性種によって完全には補われません（図4e）。酪酸塩の場合、グラム陽性ファーミキューテス属はオシリバクター属とプレボテラ属に置き換えられますが、他のグラム陽性菌は依然として酪酸塩生産において重要な役割を果たし続けているものの、相対的に存在量は減少しているため、酪酸塩の全体的な濃度は減少します。興味深いことに、プロピオン酸塩の場合、グラム陰性菌はナイシンに耐性があると思われるグラム陽性菌ルミノコッカスに置き換えられるようです。腸内細菌叢は、管腔 SCFA に影響を与えることにより、腸内インクレチンの排泄を調節することができ、その結果、グルコース制御に別の影響を与えることができます 24、25、26。

この研究は、ナイシンが経口摂取された場合にマイクロバイオームを調節する可能性を強調しています。マイクロバイオームに対する一時的な影響は、グラム陽性とグラム陰性の比率を再構築し、それによって SCFA 産生を減少させることでした。この研究で使用されたナイシン A は広域スペクトルですが、ペプチド工学的アプローチによってランチビオティックの特異性を変更することができました 27,28 これに加え、異なる特異性をもつ I 型翻訳後修飾バクテリオシンの数が急速に増加しているため、機会が開かれています。それらをマイクロバイオーム編集アプリケーションに使用します（補足図S4）。さらに、ナイシンは病原性連鎖球菌やクロストリジウム菌を含むさまざまな望ましくない細菌を殺すため、場合によっては抗生物質の代替品として使用できる可能性があります。この研究で強調されているナイシンのさらなる利点は、一部の抗生物質治療の影響が治療後最大 2 年間持続する可能性があるのと比較して、微生物叢が治療前の組成に戻る能力である29。

以下の 4 つの食餌療法グループがありました：（i）標準的な非薬用リンク食（対照グループ; Ctl）。 (ii) 150 mg/kg 体重のナイシン粉末 (Nis-pdr) を添加したリンク食 (ハンダリー、ブリュッセル、ベルギー、高含量粉末ナイシン ZP (含量 95%/超純度、% 重量/重量、含水力価 ≥ 38,000) IU/mg)); (iii) 850 mg/kg 体重のカプセル化ナイシン ZP (Nis-en) (Sublimity Therapeutics、アイルランド、ダブリン) を添加したリンク食。 (iv) 110 mg/kg 体重のカプセル化材料 (Encap) を補充したリンク食。封入材料はエチルセルロース（98％）（イギリス、ステーンズのDOW Chemical Company Limited、Sublimity Therapeuticsより寄贈）であった。カプセル化されたナイシンで投与されたナイシンの用量（処置３）は、ナイシン粉末処置群（処置２）の用量と同等であった。治療 4 で投与したカプセル化剤の量は、治療 3 のカプセル化ナイシン製剤の量と等価でした。粉末状の治療薬は、朝、少量の飼料に 5 ～ 10 ml の水で追肥し、すべてのカプセル化剤が確実に摂取されるようにしました。トリートメントは毎日消費されました。

この研究は、アイルランド、コーク、ファーモイ、ムーアパーク、ティーガスクの豚開発局で実施されました。試験構造を示す概略図を図 1 に示します。子豚 (ラージホワイト X ランドレース) を 28 (± 3) 日目に離乳させ、無傷の同腹仔のグループで飼育し、各豚の耳にタグを付けたスターター食を 6 日間与えました。識別のために固有の番号が付けられます。 150 頭のこのグループから 40 頭の雄を選択し、体重と産子の起源をブロックし、上記で詳述した 4 つの食餌療法の 1 つにランダムに割り当てました (N = 10 頭/治療)。ブタは、完全にすのこを備えた囲い (1.2 m × 0.9 m) に個別に収容され、7 日間の順応期間の間、それぞれ非薬用リンク食が与えられました。離乳後の最初の 1 週間は室温を 28 ～ 30 °C に維持し、その後は部屋の温度が 22 °C に達するまで毎週 2 °C ずつ下げました。飼料と水は自由に与えられ、照明は 1 日あたり 8 時間以上確保され、環境強化が提供されました。７日間の順応期間の後、食事療法が開始された。食事療法は 4 日間提供され、その後、試験が終了するまで 10 日間、ブタに再び一般的な非薬用リンク食が与えられました。使用した飼料の概略分析とアミノ酸組成を補足表1に示します。試験開始前（ベースライン（BL））、0日目（D0）にすべてのブタの体重を個別に測定しました（図1）。発育成績は、さらに 2 回、(i) 試験の途中 (6 日目、治療終了から 2 日後) と (ii) 試験の終了時 (14 日目、治療の 10 日後) にすべての豚の体重を量ることによって評価されました。やめていました）。自発的な飼料摂取量は試験の開始から終了まで毎日記録され、これを 1 日の平均増加量で割った値を使用して飼料転換率 (FCR) を計算しました。

ベースライン（D0; BL）微生物叢を決定するために、治療を開始する前に糞便サンプルを採取しました。さらに、最初の治療の給餌から 24 時間後 (T24)、最初の治療の給餌から 48 時間後 (T48)、および最初の治療の給餌から 72 時間後 (T72) に糞便サンプルを採取しました。これらのサンプルは、ブタの腸内微生物叢に対する治療の即時的な影響を評価するために採取されました。試験の終わり近く、治療中止の 3 日後 (3d PT) と治療中止の 10 日後 (10d PT) に糞便サンプルも採取されました。これらのサンプルは、治療を中止したときの腸内微生物叢の回復を観察するために採取されました。摂取されたナイシンの運命もこれらのサンプルから決定されました。糞便サンプルは、入手可能な場合には排尿されたばかりの状態で収集されました。それ以外の場合は、直腸刺激後に収集されました。サンプルを滅菌ポットに収集し、氷上で短時間（< 2 時間）保管し、滅菌 2 ml エッペンドルフチューブにサブサンプリングしました。その後、サンプルを液体窒素中で直ちに急速冷凍し、DNA 抽出および SCFA 分析のために -80 °C で、またはナイシンの存在と活性のスクリーニングのために -20 °C で保存しました (ウェル拡散アッセイ (WDA) および MALDI TOF 質量の場合)。分光分析 (MALDI TOF MS))。

メーカーの仕様書に従って、Zymo Research ZR 糞便 DNA キット (Cambridge Biosciences、ケンブリッジ、英国) を使用して、BL、T24、T48、T72、3d PT、および 10d PT の各ブタの糞便 200 mg から DNA を抽出しました。

BL、T24、T48、T72、3日間のPTおよび10日間のPTで採取した糞便サンプルからDNAを抽出しました。 16S rRNA 遺伝子アンプリコン (V3 ～ V4 領域) は、Illumina MiSeq™ プラットフォームを使用して生成および配列されました。 16S rRNA 遺伝子の V3-V4 可変領域は、16S メタゲノム配列決定ライブラリープロトコール (Illumina San Diego, CA) を使用して 240 の糞便 DNA サンプルから増幅されました。サンプルは定量され、以前に記載されているように配列決定用にライブラリーが準備されました 35。簡単に言うと、16S rRNA アンプリコン配列決定ライブラリーは次のように調製されました。鋳型 DNA 上で 2 つの PCR 反応が完了しました。まず、16S rRNA 遺伝子の V3 ～ V4 領域に特異的なプライマーを使用して DNA を増幅しました。これにはイルミナオーバーハングアダプターも組み込まれています (フォワードプライマー 5'TCGT CGGC AGCG TCAG ATGT GTATAAGA GACA GCCT ACGG GNGG CWGCAG; リバースプライマー 5'GTCT CGTG GGCTCGGA) GATG TGTA TAAG AGAC AGGA CTAC HVGG GTAT CTAATCC）。これに続いて、多重分離を可能にするために追加された 2 つのインデックスプライマー (Illumina Nextera XT インデックスプライマー) を使用して 2 回目の PCR 反応を実行しました。サンプルは、Miseq 600 サイクル v2 キットを使用し、標準的な Illumina シーケンスプロトコルに従って、アイルランド、コーク州ファーモイ、ムーアパークの Teagasc Sequencing Centre にある Illumina MiSeq で分析されました。配列決定に続いて、腸内細菌叢の組成に対するナイシン治療の効果を確立するためにデータが分析されました。サンプルあたりの平均 OTU 数は 123,814 +/- 34,649 で、範囲は 24,578 ～ 231,778 でした。

Illumina Nextera XT ライブラリー調製キット (Illumina) を使用して、120 サンプル (BL、T72、および 10d PT) から抽出した DNA からペアエンドシーケンシングライブラリーを調製し、続いて高出力化学反応 (2 × 150 bp)、Teagasc Sequencing Centre の製造元の指示に従ってください。

ナイシンは次のように糞便サンプルから抽出されました。サンプルを 0.1% トリフルオロ酢酸 (TFA) および (IPA) を含む 70% イソプロピルアルコール 1 mL に懸濁し、十分にボルテックスし、室温で 30 分間放置し、5 分間遠心分離しました。 16,000 g で 1 分間反応させ、上清を保持しました。遠心分離ステップをさらに３回繰り返し、毎回上清を保持した。ナイシンのピークに対応する分子量は、以前に記載されているように、Axima TOF2 (島津バイオテック、京都、日本) を備えた MALDI TOF MS を使用して観察されました 25。

凍結した糞便物質 400 ミリグラムを、滅菌した 2 ml 微量遠心分離管に入れた。 800マイクロリットルの滅菌水を2mlの微量遠心管に加えた。サンプルを 30 秒間激しくボルテックスして、糞便スラリーを生成しました。次にサンプルを 4 °C、12,000 g で 30 分間遠心分離しました。上清を除去し、新しい2ml微量遠心管に移した。このステップを繰り返した。次に、上清を再度 12,000 g、4 °C で 30 分間遠心分離しました。この上清を 0.2 μM コスタースピン遠心管 (Sigma-Aldrich、英国) に移し、4 °C、12,000 g で 10 分間遠心分離して濾過しました。フィルターをチューブから取り外し、糞便水をメタボローム分析まで -20 °C で保存しました。サンプルは、SCFA を含む代謝産物レベルを決定するために、デンマーク、フレデリクスバーグの MS-Omics ApS によって分析されました。

ブタ糞便サンプル中の抗菌活性は、以前に詳述したように、ラクトバチルス・デルブリュッキー亜種ブルガリクス LMG6901 を播種した寒天プレートにおけるウェル拡散アッセイ (WDA)30 を使用して推定されました 31。上記のように調製した糞便水をアッセイに使用しました。サンプルを播種した寒天のウェルに 50 μL ずつ分注し、寒天プレートを嫌気的に 37 °C で一晩インキュベートしました。抗菌活性により、ウェルの周囲に阻害領域が生じました。ナイシンを摂取しなかった動物からのサンプルを陰性対照として使用して、阻害ゾーンがナイシン阻害によるものであることを確認した。

ペアエンドリードはトリミングされ、PRINSEQ バージョン 0.20.432 を使用して品質フィルタリングされました。得られた配列の平均品質スコアは 20 を超えました。次に、fastq-join33 を使用して、順方向および逆方向のペアエンド配列を 10 bp の最小オーバーラップで結合しました。配列は、USEARCH バージョン 7.034 のクローズドリファレンスアルゴリズムを使用して操作分類単位 (OTU) にクラスター化され、RDP Gold リファレンスデータベースを使用してキメラが削除されました。

メタゲノムショットガンシーケンシングリードは修飾およびトリミングされ、ヒトリード (hg19 ヒト参照ゲノム) はデフォルトオプションの KneadData v0.10.0 でフィルタリングされました。次に、適格なシーケンシングリードを、MetaPhlAn v3.0.135 およびデフォルト設定のその他のオプションによって種レベルで分類学的にプロファイリングしました。 MetaPhlAn は、約 100,000 の参照ゲノム (約 99,500 の細菌および古細菌、および約 500 の真核生物のゲノム) から同定された一連の固有のクレード特異的マーカー遺伝子 (約 110 万個) に依存しており、細菌、古細菌、微生物真核生物およびウイルス35、36。 MetaCyc 経路や遺伝子ファミリーの存在量などの機能的アノテーションは、HUMAnN v3.0.035,37 によって実現されました。遺伝子ファミリーファイルは、「humann_regroup_table」関数を使用して、HUMAnN から「go_uniref90」 (Gene Ontology)、「level4ec_uniref90」 (Enzyme Commission)、「ko_uniref90」 (KEGG Orthology)、および HUMAnN 経路 (100 万あたりの数) および HUMAnN 遺伝子 (100 万あたりの数) に再グループ化されました。 100万) の用語をそれぞれ使用します。

MetaPhlAn v3.0.1 で得られた分類マトリックスは、R パッケージ「PhyloSeq」v1.34.038 を使用したアルファ多様性 (シャノン指数) および Bray-Curtis ベータ多様性分析に使用されました。アルファ多様性については、R パッケージ「Stats」を使用した一対の Wilcoxon 順位和検定を使用して、グループ間の対比較を実行しました 39。 Songbird v1.0.440 を使用して、差分存在量分析を実行しました。つまり、Songbird は、対象の共変量に関する対数倍変化に基づいて特徴量のランキングを提供する、組成を意識した差分存在量法です。これは、差分存在量分析を多項回帰問題として再定式化する差分ランキング (DR) メソッドを使用します。この場合、式とパラメータ「songbird multinomial –formula "C (Group,treatment ('nis_T72'))" –epochs 10,000 –fferential-prior 0.5 –summary-interval 1 –min-sample-count 1」を使用しました。「nis_T72」はグループ Nis-en T72 および Nis-pdr T72 に対応します。

我々は、T72 における Nis-en および Nis-pdr に関連する最高ランクの 20 種と最低ランクの 20 種の Metaphlan3 種を選択し、これらの分類群セットの対数比を計算しました。この方法で分類群の比率を比較すると、各サンプルの未知の総微生物量によるバイアスが軽減され、この比率の対数を取得すると、分類群の相対的な増加と減少に等しい重みが与えられます。 T72 における Nis-en および Nis-pdr の Songbird モデルをベースラインモデルと比較して評価すると、Q2 値 0.323 が得られました。

SCFA に関連する遺伝子は、go_uniref90gene テーブルから種ごとに層別および非層別の両方で抽出され、100 万あたりの数 (cpm) に正規化されました。以下の遺伝子が異なる SCFA に使用されました: 酢酸については酢酸キナーゼ (ackA)、酪酸キナーゼ (buk) およびブチリル CoA: 酪酸については酢酸 CoA トランスフェラーゼ (but)、およびメチルマロニル CoA デカルボキシラーゼ (mmdA)、ラクトイル CoA デヒドラターゼ ( lcdA)、およびプロピオン酸の CoA 依存性プロピオンアルデヒドデヒドロゲナーゼ (pduP)。分析に使用される代表値を得るために、異なる遺伝子からの読み取りが各 SCFA に追加されました。 BL に関連する各グループの Log2 倍率変化を計算しました。 HUMAnN 経路 (層化および非層化の両方) の差分存在量分析も Songbird を使用して実行されました。前述の分類学的差異存在量分析と同じ式とパラメーターを使用しました。 T72 における Nis-en および Nis-pdr の Songbird モデルをベースラインモデルと比較して評価すると、Q2 値 0.154 が得られました。

統計的有意性は、ペアオプションを使用した Wilcoxon 順位和検定 (R 4.0.2 で実装された関数 "wilcox.test" を使用) を使用して計算されました。 p 値は、Benjamini-Hochberg 手順を使用して誤った発見のために調整されました。

Bray-Curtis 距離を使用して評価された各糞便メタゲノムにおける細菌種の相対存在量と HUMAnN 遺伝子数 (100 万あたりの数) に基づいて、主座標分析 (PCoA) が実行されました。変数によるクラスタリングの有意性（すなわち、ナイシン治療対対照群）は、1000 個の順列（R パッケージ「PhyloSeq」、「vegan」、および「pairwiseAdonis」）を使用した順列多変量分散分析（PERMANOVA）によって決定されました。

統計分析と結果の視覚化には、R バージョン 4.0.2 が使用されました。

この研究は Teagasc 動物倫理委員会 (TAEC185-2018) によって承認され、実験ライセンス番号 (AE19132/P083) はアイルランド健康製品規制当局 (HPRA) から取得されました。すべての手順は、科学目的での動物の保護に関する欧州連合指令 2010/63/EU に従って実行されました。この研究は、ARRIVE ガイドライン (https://arriveguidelines.org) に従って報告されています。

バイオインフォマティクスと統計分析に使用されるコードは、原稿が出版に受理されると Github に保存されます。一方、リクエストに応じてコードを共有することもできます。現在の研究中に生成および/または分析されたショットガンメタゲノミクスデータは、NCBI でプロジェクト名 PRJNA906489 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/PRJNA906489) で入手できます。

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リファレンスをダウンロードする

著者らは、試験前および試験期間中、助言、技術的支援、サンプリングをしていただいた Tomás Ryan 氏と David Clarke (Teagasc 豚開発部) に感謝します。著者らは、試験に先立ってアドバイスをくれた Beatriz Gomez Sala (Teagasc 食品生物科学部) と Gillian Gardiner (South East Technological University, Waterford, Ireland) に感謝します。著者らはまた、サンプリング期間中の支援については Matthew Aijuka と Cecilia Soria (Teagasc 食品生物科学部)、配列決定については Fiona Crispie (Teagasc Sequencing Centre) に感謝しています。有益な提案をくださった匿名の査読者に感謝いたします。

この研究は、アイルランド科学財団からセンター補助金の形で資金提供を受けました (APC Microbiome Ireland 補助金番号 SFI/12/RC/2273)。

Ghjuvan M. Grimaud と Mairéad Coakley の著者も同様に貢献しました。

APC Microbiome Ireland、University College Cork、Co. Cork、アイルランド

キャサリン・オライリー、ギュヴァン・M・グリモー、マイリード・コークリー、ポーラ・M・オコナー、ハーシュ・マーサー、ヴェロニカ・L・ピーターソン、シアラ・M・オドノヴァン、ポール・D・コッター、キャサリン・スタントン、メアリー・C・レア、コリン・ヒル& R. ポール・ロス

食品生物科学部門、ティーガスク食品研究センター、ムーアパーク、ファーモイ、コロラド州コーク、アイルランド

キャサリン・オライリー、ギュヴァン・M・グリモー、マイリード・コークリー、ポーラ・M・オコナー、ハーシュ・マーサー、ヴェロニカ・L・ピーターソン、シアラ・M・オドノヴァン、ポール・D・コッター、キャサリン・スタントン、メアリー・C・レア

アイルランド、コーク州、ユニバーシティ・カレッジ・コーク、微生物学部

キャサリン・オライリー、ポーラ・M・オコナー、コリン・ヒル、R・ポール・ロス

豚開発部、ティーガスク動物・草地研究・イノベーションセンター、ムーアパーク、ファーモイ、コロラド州コーク、アイルランド

ピーター・G・ローラー

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PR、CH、CS、MR、COR が研究を設計しました。 COR、MC、POC、HM、VP、PL が実験と配列決定を実施しました。 GG と COD はバイオインフォマティクスと統計分析を実施しました。 COR、GG、PR は、他の著者全員の協力を得て原稿を執筆しました。すべての著者が現在の原稿の出版を承認します。

R・ポール・ロスへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

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転載と許可

オライリー、C.、グリモー、GM、コークリー、M. 他ナイシンによる腸内微生物叢の調節。 Sci Rep 13、7899 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-34586-x

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受信日: 2022 年 11 月 21 日

受理日: 2023 年 5 月 3 日

公開日: 2023 年 5 月 16 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-34586-x

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