強力なシクロオキシゲナーゼとしてアンドログラホリドのヒット類似体を発見 - 株式会社コーストワイズ・ベンチャーズ・グループ

Scientific Reports volume 13、記事番号: 8147 (2023) この記事を引用

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1 オルトメトリック

メトリクスの詳細

シクロオキシゲナーゼ 2 (COX-2) は、アラキドン酸から炎症促進特性を示すプロスタグランジンへの変換を担う重要な酵素であり、抗炎症薬開発の潜在的な標的タンパク質です。この研究では、アスピリンやロフェコキシブ（対照）よりも優れた薬理学的特性を有する、COX-2阻害剤としての新規の強力なアンドログラホリド（AGP）類似体を見つけるために、化学的および生物情報学的なアプローチが採用されました。完全なアミノ酸配列が決定されたヒトアルファフォールド (AF) COX-2 タンパク質 (604AA) が選択され、報告されている COX-2 タンパク質構造 (PDB ID: 5F19、5KIR、5F1A、5IKQ、および 1V0X) に対してその精度が検証され、続いて複数の配列が検証されました。配列の保存を確立するための配列アラインメント分析。 AF-COX-2 タンパク質に対する 237 個の AGP 類似体の体系的な仮想スクリーニングにより、結合エネルギースコア (< - 8.0 kcal/mol) に基づいて 22 個のリード化合物が得られました。これらは、分子ドッキング分析によってさらに 7 つの類似体に選別され、ADMET 予測、リガンド効率メトリクス計算、量子力学的分析、MD シミュレーション、静電ポテンシャルエネルギー (EPE) ドッキングシミュレーション、および MM/GBSA についてさらに調査されました。詳細な分析により、AGP 類似体 A3 (3-[2-[(1R,4aR,5R,6R,8aR)-6-ヒドロキシ-5,6,8a-トリメチル-2-メチリデン-3,4,4a, 5,7,8-ヘキサヒドロ-1H-ナフタレン-1-イル]エチリデン]-4-ヒドロキシオキソラン-2-オン) は、AF-COX-2 と最も安定した錯体を形成し、最小の RMSD 値 (0.37 ± 0.03 nm) を示します。、十分な数の水素結合 (タンパク質-リガンドの H 結合 = 11、タンパク質の H 結合 = 525)、最小 EPE スコア (- 53.81 kcal/mol)、シミュレーション前後の最低 MM-GBSA (- 55.37 および− それぞれ、56.25 kcal/mol）値を他の類似体および対照と比較した。したがって、我々は、同定された A3 AGP 類似体が、COX-2 を阻害することにより、有望な植物ベースの抗炎症薬として開発される可能性があることを示唆しています。

シクロオキシゲナーゼ (COX またはプロスタグランジン G/H シンターゼ) は、アラキドン酸からプロスタグランジン (PG)、トロンボキサン、プロスタサイリンなどの生物学的メディエーターを生成する際に重要な役割を果たします。 COX 酵素は 2 つのアイソフォームとして存在します。(i) COX-1 アイソザイムは構成的に活性があり、主に血小板凝集や胃酸性度の調節などの恒常性維持機能に関与します。 (ii) 対照的に、COX-2 異性体は炎症、痛み、発熱などの病理学的状態の際に誘発します1、2、3。抗炎症薬および鎮痛薬を開発する場合、COX-2 は実行可能な特異的な標的であり、過去数十年間にさまざまな COX-2 阻害薬が開発されてきました4。 COX-2 は、3 つの主要なドメインを含む 604 アミノ酸配列長で構成されています: (i) 上皮成長因子 (EGF) ドメイン (34 ～ 72 アミノ酸)、(ii) 膜結合ドメイン (73 ～ 116 アミノ酸)、 (iii) COX およびペルオキシダーゼ活性部位を含む触媒ドメイン [UniProt-P35354]。 COX とペルオキシダーゼの活性部位は空間的には異なりますが、機能的には関連しています 5。 Tyr371 と Ser516 の近傍は、COX-2 活性部位の重要な触媒アミノ酸です6。 COX-2 の 509 位のバリン残基は、その活性部位に疎水性 (HYD) ポケットを形成し、酵素の選択的誘導、ひいては炎症反応において重要な役割を果たしています 7,8。

COX-2 は 2 つのステップで反応を触媒します。(i) 最初のステップは、タンパク質のコアの HYD チャネルで起こるアラキドン酸が PG-G2 に変換される COX 反応、および (ii) 第 2 ステップはPG-G2 が PG-H2 (プロスタサイクリンの重要な前駆体で炎症時に発現) に還元されるペルオキシダーゼ反応は、タンパク質表面近くに位置するヘム含有活性部位で起こります9。非ステロイド性抗炎症薬（NSAID）、特にコキシブとアスピリンは、COX-2 活性部位の Ser-516 残基との共有結合相互作用を介して PG 合成を阻害することで炎症を軽減します 10,11。これらの薬剤は安全で効果的ですが、胃腸毒性を引き起こす可能性があるため、非常に敏感な患者への使用は制限されています。セレコキシブやロフェコキシブ（コキシブ）などの選択的 COX-2 阻害剤の設計は、COX-1 の代わりに COX-2 を阻害して、鎮痛および抗炎症特性を提供し、非選択的 NSAID で経験される胃の不快感を予防します12、13、14。。ロフェコキシブは、カルボン酸が存在しない（したがって胃腸刺激物質が少ない）ことと、中央の複素環に結合した 2 つの大きな芳香環が存在するため、選択性の高い NSAID です 15。 COX-2 阻害剤の使用は、選択性と有効性、薬剤の高コスト、心臓血管への潜在的な有害作用、および虚血性脳卒中リスクの増加に加えて、議論の余地があります 16、17、18。したがって、できれば天然由来で、副作用が最小限またはまったくない、COX-2 に対する治療薬が緊急に求められています 19。

アルカロイド、テルペノイド、スチルベン、フラボノイド、サポニン、脂肪酸などの二次代謝産物は、COX-2 阻害活性を有することが実証されています 20。これらの中でも、アンドログラフィスパニキュラータ植物から得られるアンドログラホリド (AGP) は、他のさまざまな薬理学的利点とともに重要な天然抗炎症剤として証明されています 21,22,23。アンドログラホリドは天然の求電子性共有結合阻害剤であり、テルペノイド経路に由来し、複数の標的との結合に必要な構造的特徴を備えています 24、25、26。構造的には、AGP は、多数の sp3 混成炭素、豊富な酸素含有量、低い窒素含有量、脂肪族側鎖を持つ多環構造を備え、芳香環を含まない複雑な 3D 構造を含んでいます。さらに、アンドログラホリドの化学的性質は、チオール含有アミノ酸残基で標的タンパク質を不可逆的かつ共有結合的に修飾できるようにする特異的な求電子性フラグメントであるα-アルキル-β-ヒドロキシ-γ-ブチロラクトン部分によって強化されています25。これにより、標的タンパク質との結合親和性が大幅に向上し、アンドログラホリドが効率的な共有結合阻害剤として機能します 26,27。

最近、いくつかの研究グループが、炎症反応に直接的または間接的に関与するアンドログラフォリドシグナル伝達経路の標的を理解しようと試みています28。トランら。 (2020) リポ多糖類誘発急性肺損傷モデルにおけるアンドログラホリドとそのいくつかの誘導体の抗炎症活性を報告し、α-アルキリデン-β-ヒドロキシ-γ-ブチロラクトンおよびent-ラブダン部分が抗炎症作用に不可欠であることを強調しました。活動25．ダイら。 (2011) は、AGP が血清誘導性一酸化窒素シンターゼ (iNOS) 活性、NO 産生、および PGE2 産生を低下させることにより抗炎症効果が増強されることを報告しました 29。最近、Wang ら。 (2019) は、AGP とその誘導体がマウスマクロファージにおけるリポ多糖誘導性の COX-2 発現を効果的に阻害することを報告しました 30。同様に、他の研究グループは、アンドログラホリドが COX-2 タンパク質の発現を阻害することによって抗がん活性を示すことを報告しています 31,32。アンドログラホリドの抗炎症活性を証明するために努力が払われてきましたが、薬物動態パラメータ、つまり溶解度の低さと生体利用効率の低さが、医薬品開発の成功を制限する要因となっています 33。

この研究では、アスピリンやロフェコキシブ（対照）よりも優れた効力、有効性、および選択性を有する、COX-2酵素に対する抗炎症剤としての新規な天然植物ベースのアンドログラホリド類似体を見つけるために系統的なコンピューター解析が実行されます。詳細な調査には、ケモインフォマティクスの分子力学技術と量子力学的アプローチが採用されています。ヒト AF-COX-2 タンパク質構造の完全な配列長は、利用可能な 3D 結晶構造に対して検証された後に使用されます。さらに、タンパク質のアミノ酸配列の長さについて多重配列アラインメントを実行し、生物学的活性の保存領域を見つけました。合計 237 種類の AGP 類似体がスクリーニングに使用され、その後、ヒット類似体のドッキング研究、ADMET パラメーターの予測、リガンド効率メトリクスの計算、詳細な量子力学的分析、および MM/GBSA スコアリング研究が行われます。さらに、ヒットした AGP 類似体複合体の安定性を分子ドッキングシミュレーションおよび静電ポテンシャルエネルギー (EPE) ドッキングシミュレーション解析によって評価しました。本研究の結果は、将来の抗炎症薬候補として植物ベースの COX-2 阻害剤の開発に役立ちます。

結晶化された COX-2 (5F19、5KIR、5F1A、5IKQ、および 1V0X) タンパク質の 3D 構造は PDB データベースから取得され、604 アミノ酸を含むヒト COX-2 タンパク質の予測構造は AlphaFold (AF) から取得されました。 ) (ID: AF-P35354-F1)34,35,36,37。タンパク質の構造は、SAVES v6.0 (https://saves.mbi.ucla.edu/)、ProSA、および ProQ38、39、40、41、42 によって検証されました。 AF-COX-2 ヒトタンパク質構造の精度について、検証結果を他の利用可能な結晶化 COX-2 PDB 構造、つまり 5F19、5KIR、5F1A および 5IKQ、および予測 COX-2 モデル (1V0X) と比較しました。相互作用解析を行う前に、AF-COX-2 タンパク質の構造を 3Drefine (https://3drefine.mu.hekademeia.org/) によって精密化しました 43。その後、AF-COX-2 タンパク質の考えられる結合ポケットが CASTp 3.0 によって予測され、キメラによって視覚化されました 44,45。

AF-COX-2 タンパク質に保存されたアミノ酸の存在を確認するために、PRALINE プログラム 46 を使用して多重配列アラインメント (MSA) を実行しました。同じために、10 種類の異なる哺乳類、すなわちホモ・サピエンス、ドブネズミ、ハツカネズミ、オオツノヒツジ、おうし座ボス、Oryctolagus cuniculus、Cavia porcellus、Equus caballus、Neovison vison、および Gallus gallus が選択され、それぞれの COX-のアミノ酸配列が決定されました。 2 つのタンパク質は Uniprot (http://www.uniprot.org/) から取得されました。得られた整列したアミノ酸配列は保存指数 (0 ～ 10) に基づいて色分けされ、種間で高度に保存されたアミノ酸配列がタンパク質の特定の生物学的機能に関与しています 47。

合計 237 個の AGP 類似体が PubChem データベースから取得されました。これは、生物学的相互作用中に残基と付加物を形成することによって生物学的活性を担う共通の α,β-不飽和 γ-ラクトン部分で構成されています 25,26。次に、類似体は Open Babel による仮想スクリーニング用の autodock PDBQT 形式に変換されました 48,49。 PyRx (AutoDock Vina) ソフトウェアは、AF-COX-2 タンパク質に対する AGP 類似体の部位特異的仮想スクリーニングに使用されました 50。さらに、それぞれ 5F19 および 5KIR PDB 構造内の共結晶アスピリンおよびロフェコキシブに存在する相互作用するアミノ酸残基に基づいて、アミノ酸、すなわち His75、Arg106、Val330、Tyr334、Val335、Tyr341、Tyr371、Trp373、Arg499、Phe504、 Glu510、Ser516、および Leu517 は、仮想スクリーニングのグリッドを設定するための AF-COX-2 タンパク質の活性部位残基として選択されました 35,36。グリッドボックスは、x、y、z での検索空間中心がそれぞれ 4.76、5.07、および -0.12 で 8 網羅性で設定され、寸法 (Å) が x、y、z でグリッドに設定されました。値はそれぞれ 29.54、29.74、27.37 です。ヒットした AGP 類似体を最終候補に挙げるために、結合エネルギー (BE) のカットオフ値を - 8.00 kcal/mol 未満に設定しました。

仮想スクリーニングから得られたヒット AGP 類似体は、対照としての AGP、アスピリン、およびロフェコキシブとともに分子ドッキング分析に提出されました。 AutoDock4.2 は、これらの化合物と AF-COX-251 との部位特異的ドッキングに利用されました。 COX-2のAFタンパク質構造は予測されたタンパク質構造であるため、共結晶リガンド、すなわちCOX-2タンパク質5F19および5KIRの既存の結晶構造のアスピリンおよびロフェコキシブをそれぞれドッキング分析の参照化合物として採用した。さらに、アミノ酸、すなわち、Ｈｉｓ７５、Ａｒｇ１０６、Ｖａｌ３３０、Ｔｙｒ３３４、Ｖａｌ３３５、Ｔｙｒ３４１、Ｔｙｒ３７１、Ｔｒｐ３７３、Ａｒｇ４９９、Ｐｈｅ５０４、Ｇｌｕ５１０、Ｓｅｒ５１６、およびＬｅｕ５１７が、５Ｆ１９および５Ｆ１９におけるアスピリンおよびロフェコキシブ相互作用残基に基づいて結合部位残基として選択された。 5KIR PDB 構造。ドッキング用のグリッドボックスは、0.375 Å の間隔と、x、y、z 座標に沿った寸法 (それぞれ 84、88、および 94) で生成されました。グリッドの中心は、x、y、z 軸に沿って、それぞれ 4.305、4.394、および 1.611 の寸法を持つ結合部位残基の重心に設定されました。さらに、GA (遺伝的アルゴリズム) を使用して、エネルギー評価数 25000000、世代数 27000、および RMSC (二乗平均平方根クラスター) 許容値 2.0 Å でドッキングパラメーターを計算しました。ラマルク遺伝的アルゴリズムを使用してドッキングシミュレーションを実行しました。 AutoGrid と AutoDock は、分子ドッキングを実行し、タンパク質-リガンド複合体におけるリガンドの最適な結合状態を調査するために利用されました。最後に、自由結合エネルギーが最も低いリガンドの配座異性体が、さらなる分析のために選択されました。ドッキング研究から得られた出力ファイルは、ICM-Browser と Accelrys Discovery Studio Visualizer52 によって視覚化および分析されました。

ADMETlab 2.0 は、AGP およびアスピリンおよびロフェコキシブ 53 とともに最終候補に挙げられた AGP アナログの物理化学的、薬効的、吸収、分布、代謝、排泄、毒物学的パラメーターを予測するために使用されました。また、AGP および候補リストに挙げられた類似体の薬物らしさを確立するためにも使用されました。

リガンド結合効率測定基準は、阻害定数 (Ki)、リガンド効率 (LE)、リガンド親油効率 (LLE)、リガンド効率スケーリング関数 (LE_Scale)、フィット品質 (FQ)、および親油性補正リガンド効率 (LELP) の観点から計算されました。式に従ってください。 (1-6)54、55、56、57、58。

Spartan 20 (wavefun.com) パッケージを使用して、最高被占分子軌道 (HOMO)、最低空分子軌道 (LUMO)、HOMO-LUMO ギャップ (HLG)、および EPE パラメーターに関する量子力学的 (QM) 記述子を計算しました。分子軌道特性、静電ポテンシャルを評価し、さまざまな種類の相互作用を解明します。すべての化合物は、Becke の 3 パラメーター交換ポテンシャルを使用した密度汎関数理論 (DFT) を使用して、地上の気体状態の平衡幾何学変数を計算するように最適化されました。さらに、Becke と 6-31G* 基底関数を組み合わせた交換関数である Lee Yang Parr (LYP) 相関関数を使用して、基底状態幾何学形状を計算しました 60、61、62。

天然の AF-COX-2 タンパク質と、ヒットした AGP 類似体 (ドッキング研究からスクリーニングされた)、AGP、アスピリン、およびロフェコキシブとのその複合体を使用して、MD シミュレーション研究を開始しました。 MD シミュレーションの実行には GROMACS 2019.2 を使用しました63。化合物のすべてのトポロジカルパラメーターは PRODRG サーバー 64 から取得されました。 GROMOS96 54a7 力場は、すべてのシミュレーション研究を実行するために使用されました65。さらに、陽的単純点電荷 (SPC) 水モデルを使用して、十二面体ボックスタイプの系を溶媒和しました。この系は、生理学的 pH 7.4 でプロトン化された残留状態を維持するために、対イオンの添加によって中和されました。その後、50,000 歩の最急降下エネルギー法によって初期の立体障害を除去し、システムを最小化しました。その後、温度 300 K、圧力 1.0 bar のリープフロッグ積分器を備えた NVT/NPT アンサンブルを使用してシステムを平衡化しました。 MD シミュレーションは、5000 フレームの平衡化システムごとに 100 ns 実行されました。統計的 MD シミュレーション分析は、WebGRO (https://simlab.uams.edu/) を通じて、RMSD (二乗平均平方根偏差)、RMSF (二乗平均平方根変動)、平均面積を計算することにより実行されました。残基あたり、SAS (溶媒接触可能表面) 面積、体積、密度、H 結合 (タンパク質内およびタンパク質とリガンド間の水素結合の数)、および Rg (回転半径) 値。

選択したペプチド長の AF-COX-2 による AGP、ヒット類似体、アスピリン、およびロフェコキシブの付加体の安定性を評価するために、Spartan 20 を使用して EPE ドッキングシミュレーション研究を実行しました。同様に、511 からのアミノ酸配列長ＡＦ−ＣＯＸ−２の５２０〜５２０（すなわち、Ｖａｌ５１１、Ｇｌｙ５１２、Ａｌａ５１３、Ｐｒｏ５１４、Ｐｈｅ５１５、Ｓｅｒ５１６、Ｌｅｕ５１７、Ｌｙｓ５１８、Ｇｌｙ５１９、およびＬｅｕ５２０）を、化合物との付加物を形成するためのペプチドとして選択した。同じために、まず、10アミノ酸残基のペプチドと1つのリガンドからなるモデルを構築した。これに続いて分子力学オプションによるエネルギー最小化が行われ、B3LYP/6-31G* 単一点計算が続きました。付加物のエネルギーは計算の出力から直接得られました。さらに、電子パラメータを計算するために、B3LYP/6-31G* 基底系に関するデータを不対電子数 (多重度) = 0、総電荷 = 中性結合、結合定数 = 経験的に取得し、安定化エネルギーを決定しました。付加エネルギーから個々の構成要素のエネルギーの合計を推定することによって。次に、化合物の表面上の電子分布を特徴付ける各付加物およびペプチドの EPE が計算されました 66。最後に、複合化合物のペプチドとの結合エネルギーは、次の式を使用して計算されました。（7）。

AGP のヒット類似体である AGP、アスピリン、およびロフェコキシブ複合体の分子力学の観点からの結合自由エネルギー (MM/GBSA) は、Fast Amber Rescoring (FAR) によって計算されました67。 ff14SB 力場は小分子に使用され、一般化アンバー力場 2 (GAFF2) はタンパク質分析に使用されました 68。さらに、AM1-BCC 法を使用して、Amber69、70 の前室モジュールを介して類似体の部分電荷を割り当てました。

この研究では、完全に配列決定された COX-2 タンパク質構造 AF-P35354-F1 (1 ～ 604 個のアミノ酸からなる) が使用されました。この構造は AlphaFold によってモデル化され、タンパク質モデリングに最先端の機械学習手法が使用されています。コンピューター解析を実行する前に、このタンパク質の構造は、タンパク質の全体的な品質を既存の 4 つの結晶化 COX-2 タンパク質構造 (PDB ID: 5F19、5KIR、5F1A、および 5IKQ) およびモデル化された構造 (PDB ID: 1V0X）。補足表 S1 は、すべてのタンパク質構造について SAVES、ProSA、および ProQ から得られた結果を要約しています。これは、ERRAT、VERIFY、PROVE、Whatcheck、Procheck、Z スコア、および LGscore を使用して、全体的な品質係数を計算することによってタンパク質の品質を評価します。、原子 3D モデルとそのアミノ酸配列、原子の体積、立体化学パラメーター、および立体化学的品質との互換性。 AF-COX-2 タンパク質構造は、最も好ましい理由として、全体の品質係数 97.74%、残基 90.9% で VERIFY および PROVE に合格しました。さらに、AF-COX-2 タンパク質の Z スコアと LG スコア値はそれぞれ -8.97 と 7.639 であることがわかり、AF-COX-2 モデルタンパク質の構造が良質であることを示しています 40,42。さらに、AF-COX-2 タンパク質構造の全体的な品質は、品質、適合性、立体化学パラメーターの点で他のすべての構造の中で最高であることが判明したため、この 3D タンパク質構造はさらなる研究に使用されました。

CASTp 3.0 は、AF-COX-2 タンパク質の 96 個の結合ポケットの可能性を予測しました (補足表 S2)。次に、結合ポケットの形状、内部空洞、面積、および体積の値に従って、2 番目の結合ポケットのアミノ酸 (His75、Arg106、Phe191、Val214、Val330、Ile331、Tyr334、Val335、Leu338、Tyr341、Leu345) 、Lys346、Gln358、Asn361、Tyr371、Trp373、Lys454、Arg455、Met457、Arg499、Phe504、Glu510、Phe515、Ser516、Leu517、Leu520、Met521）をさらなる検討のために選択しました。次に、研究のための結合部位残基は、それぞれ 5KIR および 5F19 PDB 構造に存在するロフェコキシブとアスピリンの相互作用に基づいて選択されました。さらに、5KIR PDB構造において、ロフェコキシブの結合部位残基は、Val344、Trp387、Phe518、Tyr385、355、Ser530、Leu531、Arg120、513、Glu524、およびHis90であることが判明した。一方、5F19 PDB 構造では、アスピリン結合部位残基は Tyr385、Ser530、Leu531、Glu524、Arg120、513、および His 90 として認識されます。したがって、ロフェコキシブとアスピリンよりも効率的な化合物を見つけるために、結合部位を検討しました。両方の化合物の残基。したがって、我々は、ロフェコキシブおよびアスピリンに存在する固有の結合残基とともに、共通の結合残基 (Tyr385、Ser530、Leu531、Arg120、および Glu524) を選択しました。したがって、本発明者らは、AF-COX-2タンパク質のこの研究における結合部位として、His75、Arg106、Val330、Tyr334、Val335、Tyr341、Tyr371、Trp373、Arg499、Phe504、Glu510、Ser516、およびLeu517残基を考慮した。興味深いことに、CASTp 3.0 分析により、選択されたすべての結合部位残基が AF-COX-2 の予測結合ポケットにも存在し、リガンド結合とタンパク質阻害にも重要である可能性があることが明らかになりました 71。

AF-COX-2 タンパク質は、共結晶化リガンドを持たないモデル化された 3D 構造を持っているため、既存の COX-2 結晶化 PDB 構造の活性部位と比較することにより、精製されたタンパク質構造における結合部位残基の予測が行われました。 PDB データベースに存在します。同様に、共結晶リガンドとしてそれぞれアスピリンおよびロフェコキシブを有する COX-2 の 5F19 および 5KIR PDB 構造が選択されました。タンパク質構造内の両方の共結晶リガンドの結合部位に基づいて、His75、Arg106、Val330、Tyr334、Tyr341、Tyr371、Trp373、Arg499、Phe504、Glu510、Ser516、および Leu517 アミノ酸が活性部位として選択されました。結合相互作用の研究。これらの残基が顕著な活性部位であることを確認するために、10の異なる哺乳類種のCOX-2タンパク質を使用して多重配列アラインメントを実行しました。これにより、Arg499を除いて、選択されたすべてのアミノ酸が完全に保存されていることが証明されました（補足図S1および表S3）。）。これはまた、これらのアミノ酸がさまざまな生物学的機能において重要であること、および医薬品開発の潜在的な標的として重要であることを意味します47。

生物活性にとって重要な共通のα,β-不飽和γ-ラクトン部分からなる237種類のアンドログラホリド類似体のセットが、植物ベースの強力な抗炎症化合物を見つけるために、完全配列が検証されたAF-COX-2タンパク質に対してスクリーニングされた25。、26。サイトディレクテッド仮想スクリーニングを利用して、計算的アプローチによってヒットする AGP 類似体を発見しました。タンパク質とリガンドの相互作用の結果から、対象となるすべての類似体の結合エネルギーを計算します。続いて、エネルギー的により有利な類似体の複合体がさらなる分析のために選択されました。仮想スクリーニング分析の結果から、最も低い結合エネルギーは PubChem ID: 132210370 で - 8.80 kcal/mol であることが判明し、最も高い結合エネルギーは PubChem ID: 59876522 で - 5.90 kcal/mol であることが判明しました (補足表) S4)。その後、結合エネルギーカットオフ値 (-8.00 kcal/mol) に基づいて、237 個のうち 22 個の AGP 類似体がさらなる分析のためにスクリーニングされました。したがって、AGP および対照薬 (アスピリンおよびロフェコキシブ) とともに強力な COX-2 阻害剤を見つけるために、これら 22 種類の AGP 類似体に対して分子ドッキング研究が行われました。

分子ドッキング分析から得られた結合エネルギー値は、-9.35 kcal/mol (PubChem ID: 132210508) から - 3.2 kcal/mol (PubChem ID: 132217538) の範囲であることが判明しました (補足表 S5)。対照的に、アスピリン、ロフェコキシブ、およびAGPは、それぞれ-5.61 kcal/mol、-8.17 kcal/mol、および-7.95 kcal/molの結合エネルギー値を示しました。 22 の AGP 類似体のうち、-8.00 kcal/mol 未満の結合エネルギーカットオフ値に基づいて、さらなる分析のために、A1 ～ A7 と名付けられた 7 つのヒット類似体が選択されました。結合エネルギーの点では、7 つのヒット類似体はすべてアスピリンおよび AGP と比較して低い値を示しましたが、5 つの類似体 (A1 ～ A5) はロフェコキシブよりも低い値を示し (表 1)、COX-2 タンパク質阻害に対するそれらの可能性を示しています。

既存の COX-2 タンパク質阻害剤、すなわちアスピリンおよびロフェコキシブ (対照) に対する AGP およびその選択された 7 つのヒット類似体の結合パターンを調べて、分子結合相互作用および結合ポーズ解析を比較しました (表 2)。この分析により、Val335、Leu338、Ser339、Phe504、Val509、および Ala513 アミノ酸が、すべての対象化合物の AF-COX-2 タンパク質との相互作用に共通していることが明らかになりました。さらに、Trp373、Gly512、および Ser516 アミノ酸はアスピリン、AGP、および A1 ～ A7 類似体によって共有されていますが、Leu78、Val102、Arg106、Tyr341、Leu345、Leu517 残基は、ロフェコキシブ、AGP、および A1 ～ A7 によって占められています。さらに、相互作用するすべてのアミノ酸のうち、Arg106、Tyr371、Arg499、Met508、Val509、Glu510、Ala513、および Ser516 残基は水素結合相互作用に関与し、一方で Leu78、Val102、Arg106、Val335、Leu338、Tyr341、Leu345、Phe504 は水素結合相互作用に関与していました。、Met508、Val509、Ala513、Leu517残基はHYD相互作用に関与していた。 AGP およびヒット類似体 A1 ～ A5 は、それぞれ 3、3、4、1、3、および 4 個の H 結合を示しましたが、A6 および A7 類似体では H 結合が形成されませんでした。興味深いことに、結合パターンから、AGP および A1-A7 類似体は、AF-COX-2 タンパク質のアスピリンとロフェコキシブの両方の結合部位の相互作用するアミノ酸残基を共有していることが明らかであり (図 1 および 2)、COX-2 類似体としての可能性を示しています。結合相互作用が改善された 2 タンパク質阻害剤。さらに、AGPとヒット類似体の結合配向は、オキサロン部分がアスピリン結合部位に面しているのに対し、ナフタレン/ナフトール部分はロフェコキシブ結合部位に向かって配置されていることを示しています（補足図S2）。

AF-COX-2 の結合部位におけるアスピリン、ロフェコキシブ、AGP、およびヒット AGP 類似体の重ね合わせ。すべての化合物はボールとスティックのモデルとして、タンパク質はリボンの表現として、相互作用するアミノ酸は 1 文字のコードとして表現されます。カラーコード: ライトグレー = AF-COX-2 タンパク質、青い点線の表面 = アスピリン結合ポケット、赤い点線の表面 = ロフェコキシブ結合ポケット、青 = アスピリン、赤 = ロフェコキシブ、黄 = AGP、緑 = A1、オレンジ = A2、マゼンタ=A3、ホットピンク=A4、ダークスレートグレー=A5、シアン=A6、プラム=A7。この図は ICM-Browser52 を使用してプロットされています。

アスピリン (a)、ロフェコキシブ (b)、AGP (c)、および AGP 類似体 (A1 ～ A7) (d ～ j) と AF-COX-2 タンパク質の結合部位との 2D 結合相互作用。すべての化合物は球と棒のモデルとして表されます。アミノ酸とその番号は 3 文字コードの円で表され、破線は化合物とアミノ酸の相互作用部位を示します。カラーコード: 緑 = 水素結合、ピンク = HYD 相互作用。

AGP および A1 ～ A7 類似体の物理化学的、吸収、分布、代謝、排泄、毒物学的特性を予測し、アスピリンおよびロフェコキシブと比較して、それらの薬剤性を評価しました (表 3)。分子量 (MW)、水素結合アクセプターの数 (nHA)、水素結合ドナーの数 (nHD)、トポロジカル極性表面積 (TPSA)、n-オクタノール/水分配係数の対数などの物理化学的特性(logP) は、選択したすべての化合物について計算されました。さらに、すべての化合物について、医薬品化学特性、すなわち天然物らしさスコア（NPscore）、リピンスキー則、およびファイザー則を分析した。ロフェコキシブと A5 類似体を除いて、すべての化合物は薬物様候補の物理化学的および医薬化学的特性の基準を満たしていました。さらに、Caco-2 (ヒト結腸腺癌細胞株) の透過性、Pgp 阻害活性 (P 糖タンパク質の阻害剤)、ヒト腸管吸収 (HIA 範囲 0 ～ 0.3)、F30% (ヒト経口バイオアベイラビリティ 30%) もすべての化合物について計算されました。ロフェコキシブと A6 類似体を除いて、すべての化合物は経口活性薬剤として使用される基準を満たしました。さらに、血漿タンパク質結合 (PPB)、分布容積 (VD)、血液脳関門 (BBB) 透過、血漿中の非結合画分 (Fu) などの分布特性が、研究されたすべての分子について予測されました。 AGP および A1 ～ A7 類似体の分布特性は、薬剤のような候補として許容可能な範囲内にあることが判明しました。さらに、代謝および排泄特性の累積分析でも、潜在的な薬剤候補としてAGPおよびA1-A7類似体が支持されました。さらに、毒性学的特性の評価により、A1 ～ A7 AGP 類似体の非毒性の性質も予測されました。

選択されたリガンド結合の品質は、特定のタンパク質標的の状況に応じて分子量と親油性に基づいて計算されました。一般に、低い Ki 値は高い効力を示し、分子がヒット化合物またはリード化合物として認定されるには、その値がマイクロモル範囲にある必要があります 55。リガンド効率 (閾値 = 0.3 kcal/mol/HA) は、化合物がそのサイズに対してタンパク質とどの程度よく結合するかについてのアイデアを与えます56。リガンドの親油効率（閾値 = 3）は、選択的 LLE と最適化された化合物の不規則性の主な要因である親油性に対する分子の親和性を測定するために使用されます 54、56、57。 LE_Scale は、サイズに依存しないリガンド効率のスケーリング関数であり、特定の重原子 (HA) で観察された最大リガンド効率値に指数関数を当てはめることによって導出されます。適合品質 (しきい値 = 0.8) は、スケーリングされたリガンド効率とも呼ばれ、リガンド効率とサイズを 1 つのメトリクスに含み、観察された LE を LE_scale55、56、58 で除算した結果になります。最後に、親油性において支払われるリガンド効率の代償を示す指標を示す LELP (許容範囲 = -10 ～ + 10) が計算されました 54,55。さらに、ドッキング研究から得られた結合エネルギー (BE) (表 1)、物理化学的特性の予測から得られた HA および LogP (表 3) をすべての LE メトリクスの計算に使用しました。表４から、Ａ５および対照（アスピリンおよびロフェコキシブ）を除いて、スクリーニングされたすべての類似体が、最小閾値を超え、ＨＩＴ類似体と呼ばれるそれぞれのリガンド効率測定基準値を示すことが観察できる。また、阻害定数の観点から、類似体 A1 ～ A5 は対照 (アスピリン Ki = 75.604 μM およびロフェコキシブ Ki = 0.995 μM) および AGP (Ki = 1.440 μM) よりも小さい Ki 値を示し、 COX-2 タンパク質はコントロールおよび AGP よりも優れています。

HOMO、LUMO、HLG などのフロンティア分子軌道 (FMO) は、AF-COX-2 に対する AGP、ヒット類似体、アスピリン、ロフェコキシブの電子特性を予測するために計算されました。 AGPおよびA1-A7類似体の場合、HOMOおよびLUMO軌道はそれぞれナフタレン/ナフトールおよびオキサロン部分に位置しますが、アスピリンの場合、HOMOおよびLUMO軌道は構造の安息香酸部分に位置します。対照的に、HOMO 軌道はフェニルフラン部分に限定されますが、LUMO 軌道はロフェコキシブのメチルスルホニルフェニルフラン部分に位置します (図 3)。 2 つのエネルギー状態、つまり HOMO と LUMO の間の HLG は、分子の化学反応性を説明します。HLG 値が最も低いほど、化学反応性と生物活性が高く、電子の流れが容易になるため化合物の安定性が低いことが推測されます 72。また、タンパク質-リガンド複合体の安定化においても重要な役割を果たします73。 HLG 値は、調査したすべての化合物について 4.24 ～ 5.63 eV の範囲にあり、A6 (5.63 eV) > A7 (5.51 eV) = A5 (5.51 eV) > アスピリン (5.43 eV) > AGP ( 5.26 eV) > A4 (5.21 eV) > A2 (5.15 eV) > A3 (5.05 eV) > A1 (5.03 eV) > ロフェコキシブ (4.24 eV)。 HLG 値に基づくと、A1 と A3 は両方とも最も高い化学反応性を示しますが、A6 は最も反応性が低く、最も安定です。

アスピリン (a)、ロフェコキシブ (b)、AGP (c)、および AGP のヒット類似体 {A1–A7} (d–j) とその HLG (HOMO–LUMO-GAP) の HOMO および LUMO 分子軌道の図。上の構造はLUMOを示し、下の構造はHOMO軌道を示しています。カラーコード: 赤 = 最も負の電位。青 = 最もポジティブな可能性。

EPE マップは、化合物全体の空間電子密度分布として分子間相互作用の活性部位を予測するために使用されます 74,75。図 4 は、アスピリン、ロフェコキシブ、AGP、および A1 ～ A7 の EPE マップを示しています。青色の領域は求核相互作用の原因となる最も正の電位を表し、赤色は求電子相互作用の部位である最も負の電位を示します。。 EPE マップ分析から、アスピリンのアセチルオキシ基とカルボキシル基、ロフェコキシブのメチルスルホニル基とフラン基、AGP とヒット類似体のナフタレン部分のオキサロンとヒドロキシル基が負の電位 (赤色領域) にあることが明らかです。求電子相互作用の顕著な部位。対照的に、求核相互作用の潜在的な部位である正の電位 (青色の領域) は、アスピリンのカルボキシル基、ロフェコキシブのフェニル基、AGP および A1 ～ A7 類似体のナフタレンまたはナフトール部分の水素の周囲にあります。陽性 EPE (kcal/mol) は、ロフェコキシブ (36.24) < アスピリン (59.54) < A7 (61.75) < A3 (62.15) < A4 (64.90) < AGP (65.08) < A1 (65.50) の順であることが判明しました。 < A2 (65.79) < A6 (67.07) < A5 (68.07)。負の EPE (kcal/mol) 傾向は異なり、A7 (- 48.98) > AGP (48.97) > A3 (48.31) > A6 (-47.84) > A4 (- 46.65) > A2 (- 46.53) > の順でした。 A1(−45.97)＞A5(−43.98)＞ロフェコキシブ(−43.51)＞アスピリン(−41.70)(図4)。 EPE の負の値はより強い水素結合の形成に有利であるため 76,77、AGP とその A1 ～ A7 ヒット類似体は、アスピリンやロフェコキシブと比較して、より強力な水素結合相互作用に対する優れた可能性を示しました。

アスピリン (a)、ロフェコキシブ (b)、AGP (c)、およびヒット AGP 類似体 {A1 ～ A7} (d ～ j) の静電ポテンシャルエネルギーマップ。 EPE 等高線マップのカラーコードは、最も負の値が赤、最も正の値が青で表示されます。ポテンシャルの順序は、青 (最も + ve) > 緑 > 黄色 > オレンジ > 赤 (最も -ve) です。

構造的には、スクリーニングされたすべての AGP 類似体は、エチレンジン部分に結合した 2 つの環状基 (すなわち、ナフタレン/ナフトールおよびオキサロン) からなる主な化学骨格を共有しています。化合物を含む二環式基は、無数の生物学的活性を示します78。薬物を含むこれらの二環式基は、主に疎水性および芳香族残基を介してタンパク質と相互作用します。さらに、二環式化合物はヒドロキシルやアミノ酸のアミドなどの極性基と相互作用することも実証されています79。この研究では、スクリーニングされた AGP 類似体の中には、2 つの立体異性体 A1 (6S)/A3 (6R) および A2 (6S)/A4 (6R) が存在しますが、類似体 A5、A6、および A7 は互いに異なります。 AGP と比較すると、類似体 A1 ～ A5 はナフタレン部分の 5 位と 6 位で構造的に異なりますが、化学的足場の残りの部分は同じです。ナフタレンの代わりに、類似体 A6 および A7 はナフトール部分を持ち、ナフトール環の 3 位に異なる基を持っています。さらに、分子相互作用分析により、スクリーニングされた類似体の中で、ナフタレン部分含有化合物は、結合エネルギー、水素結合、およびHYD相互作用の点で、ナフトールと比較してCOX-2タンパク質に対してより高い親和性を示すことが明らかになりました（表1および2）。分子相互作用解析の図 2 および表 2 から、オキソラン部分が主に水素結合相互作用に関与し、ナフタレン/ナフトール部分が主に HYD 相互作用に関与していることが明らかです。これは、量子力学的記述子分析によってさらに確認されました。構造的には、AGP と比較して、アナログ A1 ～ A4 はナフタレン部分の 5 位の -OH 基が 1 つ少なく、これによりこれらのアナログの作用持続時間が延長されます。これは ADMET 予測によって証明されています (表 3)。これにより、これらのタイプの類似体の HYD 相互作用が COX-2 タンパク質とさらに増加し、受容体との親和性も増加します 80。したがって、化学構造の特徴と、分子ドッキングおよび DFT 分析から得られた結果との間の上記の関係に基づいて、スクリーニングされた AGP 類似体は、AGP および参照薬物 (アスピリンおよびロフェコキシブ) と比較して抗炎症活性が向上していると結論付けました。

MD シミュレーション分析は、AGP およびヒット類似体の AF-COX-2 タンパク質との複合体と、適切な対照 {AF-COX-2 タンパク質単独 (中立対照) およびそのアスピリンおよびロフェコキシブとの複合体 (陽性対照)} とともに実施されました。 AGP およびヒット類似体の複合体の MD シミュレーション軌跡分析は、RMSD、RMSF、残留面積、Rg、SAS 面積、SAS 体積、SAS 密度、タンパク質の観点からネイティブ AF-COX-2 タンパク質、アスピリン、およびロフェコキシブ複合体と比較されました。水素結合、およびタンパク質-リガンド複合体水素結合。

RMSD は、シミュレーション中にタンパク質の主鎖原子間の平均距離を計算し、構造安定性を評価することにより、タンパク質の立体構造を測定します。 AGP およびヒット類似体の平均 RMSD 値は、中立対照 (天然タンパク質) よりも低いことが判明しました。陽性対照と比較して、類似体 A2、A3、および A4 では平均 RMSD 値が低いことが観察されました。最小値のRMSD値は、AF-COX-2タンパク質と安定した付加物を形成する能力を示す類似体A3で観察されました（図5aおよび補足表S6）。 RMSF は、各タンパク質 - リガンド複合体および天然タンパク質の残留移動度について計算されます。すべての複合体の残留変動プロファイル間に目立った違いは見つかりませんでした（図5b）。これは、アミノ酸残基とリガンド間の水素結合およびファンデルワールス相互作用の形成に起因すると考えられます。図5bに示すように、活性結合部位領域の変動は小さく、AF-COX-2タンパク質における安定性を示しています。さらに、平均 RMSF は、A1、A3、A6、および A7 複合体の方が、中立対照および陽性対照よりも低いことが観察されました (補足表 S6)。各シミュレーション複合システムにおける相互作用するアミノ酸残基の個々の RMSF が計算され、シミュレーションシステムのそれぞれの平均 RMSF 値と比較されました。さらに、補足表 S6 から、調査されたすべてのシミュレーションシステムの平均 RMSF 範囲は 0.16 ± 0.10 ～ 0.21 ± 0.18 nm であることがわかりました。また、Arg106、Ser339、およびPhe 504を除いて、相互作用するアミノ酸の残りの部分が0.21 nm未満のRMSF値を示したことは明らかです（これは、すべてのシミュレーションシステムの中で最も高い平均RMSF値です）（補足表S7）。これは、相互作用する結合残基が MD シミュレーション中に非常に安定していることを意味します。さらに、類似体 A1、A2、A3、A6、および A7 の平均 RMSF 値がタンパク質よりも低いことは、類似体が MD シミュレーション中にタンパク質と安定した相互作用を形成できることを示しています。このRMSF研究は、シミュレーション期間中にAF-COX-2タンパク質との安定した相互作用の形成に対するこれら4つのAGP類似体の能力を示唆した。

天然AF-COX-2タンパク質およびその対象リガンドとの複合体のRMSD（a）、RMSF（b）、各残基のSAS面積（c）、およびRg（d）に関するMDシミュレーション解析結果の図表示。

溶媒がアクセス可能な各残基の面積を計算するために、シミュレーション中の各残基の SAS 面積も計算されました (図 5c)81。残基あたりの SAS 値は 0 ～ 2.49 nm2 の範囲であることがわかりました。ロフェコキシブと A2 複合体の Asn181、A7 複合体の Lys237 など、AF-COX-2 タンパク質のいくつかの残基が溶媒にアクセスできないことは明らかです。さらに、研究されたすべての類似体および対照化合物の中で、残基あたりのSAS面積の平均値はA3で最も高いことが判明した。また、残基あたりのSAS面積(nm2)の最大値は、A4(2.49)＞A5(2.44)＞A3(2.27)＞A6(2.22)＞ロフェコキシブ(2.21)＞A7(2.19)の順であることがわかった。 > A2 (2.18) > A1 (2.11) > AGP (2.06) > アスピリン (2.06) > タンパク質 (2.05) これは、類似体 A3 ～ A6 が他の複合体や天然タンパク質よりも溶媒へのアクセス性が優れていることを意味します (補足)表S8）。

Rg 分析を実行して、リガンドの存在下および非存在下での AF-COX-2 タンパク質構造のタンパク質の折り畳みおよびアンフォールディングに関するコンパクト性のレベルを計算しました。類似体 A3 および A6 の平均 Rg 値は、天然タンパク質 (中性対照) の Rg 値と同等ですが、陽性対照よりは低いことが判明しました。これは、他の類似体およびポジティブコントロールと比較して、より安定でコンパクトなタンパク質-リガンド複合体形成を示唆しています（図5dおよび補足表S8）82。

タンパク質内の水素結合の数、およびタンパク質とリガンド間の水素結合の数は、複合体の安定性に重要な役割を果たすため、天然の AF-COX-2 およびその AGP、ヒット類似体、アスピリンとの複合体について水素結合分析を実施しました。、ロフェコキシブ。図6aから、アナログA3複合体はタンパク質内で最大数のH結合を示したのに対し、AGPおよびA3複合体は他のアナログと比較して最大数のタンパク質-リガンドH結合を示し、陽性であることが明らかです（図6b））。これは、アナログ A3 と AF-COX-2 タンパク質のより強力かつ効率的な結合を示唆しており、RMSD および RMSF 分析から得られた結果とよく一致しています (補足表 S6)。

天然 COX-2 タンパク質、およびそのアスピリン、ロフェコキシブ、AGP、およびヒット AGP 類似体との複合体の MD シミュレーション研究のグラフ図。 (a) タンパク質内の水素結合の数、(b) タンパク質とリガンド間の水素結合の数、(c) SAS 面積、(d) SAS 体積、(e) SAS 密度。

SASA (水溶媒がアクセスできる複雑な表面の領域) は、タンパク質とリガンド間の相互作用によって発生する構造変化のレベルを予測するために使用されます。図 6c は、すべてのヒット類似体、AGP、ニュートラル、およびポジティブコントロールの SASA プロットを示しています。 AGP を含むすべてのヒット AGP アナログの平均 SASA 値は、中立対照 (天然タンパク質 SASA = 273.57 nm2) よりも高いことが判明しました。一方、ポジティブコントロール（ロフェコキシブおよびアスピリン複合体SASA = 273.13および279.12 nm2）と比較して、AGP、A2、A3、A4、およびA5はより大きなSASA値（つまり> 279.12 nm2）を示しました（補足表S9）。すべてのヒットしたアナログと AGP の中で、A3 は最も高い SASA 値 = 284.59 nm2 を示しました。最終的に、A3 類似体は相互作用後に AF-COX-2 タンパク質と比較的安定した複合体を形成します。さらに、タンパク質の周りを転がる溶媒プローブの中心によって囲まれた体積である溶媒接触可能表面体積（Vsas）も、複合系の安定性を示すすべての研究対象リガンドについて計算されました83。通常、溶媒によってタンパク質表面に及ぼされる力の影響、その後のタンパク質と溶媒の相互作用を測定します。また、Vsas は、タンパク質の内部に対する溶媒の効果の影響を含め、またタンパク質と溶媒の間の相互作用を定義するために、SASA 用語を改良するための代替法です 84。これは、タンパク質の幾何学的体積を検査するための正確かつ高速なアプリケーションです。さらに、タンパク質-リガンド複合体と溶媒の相互作用によって変化する体積の計算にも使用できます85。 Vsas と SASA は、タンパク質に対する暗黙的および明示的な非極性溶媒の力と、タンパク質の折り畳みに対するその影響をよりよく黙認します 86。図6dおよび補足表S9に示すように、AGP、A3、A4、およびA5アナログ複合体は、すべての対照と比較してより大きなVsas値を示しましたが、最高値はA3アナログ複合体（119.24nm\s3\n）で観察されました。）。これらの結果は、A3 アナログが他のすべてのアナログおよびコントロールと比較して、AF-COX-2 タンパク質と最も安定な複合体を形成することを示しています。さらに、SASA に反比例する SAS 密度を決定して、タンパク質のフォールディングにつながるタンパク質コア内の埋没 HYD アミノ酸の近傍密度を計算しました 87。近傍密度は、溶媒がアクセスできるタンパク質の表面積の座標を使用して、正確な分子量と原子量を計算します。アミノ酸密度の疎水性効果を測定するだけでなく、タンパク質の折り畳みと安定性に対する溶媒の静電効果も捕捉します88。図6eおよび補足表S9に示されているように、A3アナログはSAS密度の最小値を有し、AF-COX-2タンパク質との相互作用後の他のヒットアナログおよびすべてのコントロールと比較してタンパク質の折り畳みが良好であることを示しています。 3 つの溶媒アクセス可能な表面分析 (面積、体積、密度) をすべて合わせると、タンパク質の折りたたみに関する類似体の複雑な安定性に関連する MD シミュレーション分析がより強調され、参照を含む他の研究対象化合物よりも類似体 A3 の安定性が高いことが明らかになりました。分子。全体として、MD シミュレーション分析から、A3 アナログは他のヒットアナログ、AGP、ネイティブタンパク質、アスピリン、およびロフェコキシブよりも優れたタンパク質安定性を示すことが推測できます。

さらに、ヒット類似体の分子相互作用も MD シミュレーション後に分析されました (補足図 S3 および表 S10)。興味深いことに、A7 を除いて、すべてのヒット類似体の結合部位はシミュレーションの前後で一貫していることが観察されました。さらに、アミノ酸残基、すなわち Val102、Arg106、Val335、Leu338、Ser339、Tyr341、Leu345、Phe504、Val509、Ala513、および Ser516 は、シミュレーションの前後で一貫しているため、シミュレーションの前後で重要な残基であることがわかりました。さらに、アスピリンタンパク質の MD シミュレーション前後の比較解析により、シミュレーション前にはそれぞれ 3 つであった 2 つの疎水性相互作用 (Val509、Ala513) と 2 つの H 結合 (Arg106 および Arg499) がシミュレーション後に形成されることが明らかになりました。ロフェコキシブの場合、シミュレーション後には 3 つの疎水性相互作用 (Leu338、Tyr371、および Trp373) のみが観察されましたが、シミュレーション前には 1 つの H 結合 (残基) と 6 つの疎水性相互作用 (残基) が観察されました。次に、AGP タンパク質複合体は、シミュレーション後、H 結合のない 6 つの疎水性相互作用を示しましたが、シミュレーション前には 6 つの疎水性相互作用を伴う 3 つの H 結合が観察されました。次に、アナログ A1 タンパク質複合体は、シミュレーション後に 7 つの疎水性相互作用を持つ 2 つの H 結合を示しましたが、シミュレーション前には 5 つの疎水性相互作用を持つ 3 つの H 結合が見つかりました。類似体 A2 タンパク質複合体では、シミュレーション後、H 結合のない 9 つの疎水性相互作用が明らかになりましたが、シミュレーション前には 6 つの疎水性相互作用を持つ 4 つの H 結合が観察されました。類似体 A3 タンパク質複合体は、シミュレーション後に 1 つの H 結合と 8 つの疎水性相互作用を示しましたが、シミュレーション前には 7 つの疎水性相互作用と 1 つの H 結合が観察されました。 A4 タンパク質複合体は、シミュレーション後に 1 つの H 結合と 7 つの疎水性相互作用を示しましたが、シミュレーション前には 3 つの H 結合と 6 つの疎水性相互作用が観察されました。 A5 タンパク質複合体は、シミュレーション後は 2 つの H 結合と 7 つの疎水性相互作用を示しましたが、シミュレーション前は 4 つの H 結合と 5 つの疎水性相互作用が明らかになりました。 A6 タンパク質複合体は、シミュレーション後は 1 つの H 結合と 4 つの疎水性相互作用を示しましたが、シミュレーション前には疎水性相互作用のみが観察されました。最後に、A7 タンパク質複合体は、3 つの疎水性相互作用を持つ 1 つの H 結合を明らかにし、シミュレーション前には疎水性相互作用のみが主に関与していました (補足表 S10)。全体として、比較分析から、A7を除くヒット類似体は分子ドッキング分析によって同定された結合部位の近くに留まることが観察され、これはヒット類似体とAF-COX-2との複合体の効率的な結合安定性を示している。また、アナログ A1、A3、および A5 複合体は、シミュレーションの前後で一貫性を維持しました。

EPE マップは、分子表面上の電子の分布、分子の HOMO および LUMO エネルギーを記述します。この研究では、AF-COX-2 タンパク質の選択された配列と、その AGP、ヒット AGP 類似体、天然タンパク質、アスピリン、およびロフェコキシブとの付加物の EPE、HOMO、および LUMO を計算しました。次に、付加物の結合エネルギーが計算されました。結合エネルギーの値が負であるほど、タンパク質-リガンド複合体の安定性が高いことを示します89。この研究では、アスピリン、ロフェコキシブ、AGP、および A1 ～ A7 AGP 類似体がリガンドとして選択され、AF-COX-2 の 511 ～ 520 アミノ酸のタンパク質配列、つまり Val511、Gly512、Ala513、Pro514、Phe515、Ser516 が選択されました。、Ｌｅｕ５１７、Ｌｙｓ５１８、Ｇｌｙ５１９、Ｌｅｕ５２０を、ＥＰＥ３５を計算することによりドッキングシミュレーション研究用のペプチドとして選択した。その後、付加物の計算された結合エネルギー値は、-53.81 kcal/mol (A3) から - 34.53 kcal/mol (アスピリン) の範囲であることが判明しました (表 5)。さらに、すべてのAGPおよび7つの類似体すべてがロフェコキシブおよびアスピリンよりも低い結合エネルギーを示しましたが、最も低い結合エネルギー値はA3で観察され、最も安定なタンパク質-リガンド複合体であることを示唆しています。

相互作用するヒット AGP 類似体、AGP、アスピリン、およびロフェコキシブの AF-COX-2 タンパク質に対する結合自由エネルギーを、シミュレーション分析の前後で MM/GBSA 法によって計算しました。その結果、シミュレーション解析の前後でMM/GBSAスコアに微妙な違いがあることが明らかになりました（図7）。また、図 7 から、調査したすべての化合物の中で、A3 類似体が MM に関して最も負の結合自由エネルギー (シミュレーション前 = − 55.37 kcal/mol、シミュレーション後 = − 56.25 kcal/mol) を示したことがわかります。 /GBSA は、AF-COX-2 タンパク質との強い相互作用を示します。 MM/GBSA スコアは、結合親和性の降順で、A3 > A1 > A5 > Rofecoxib > A2 > A4 > A6 > A7 > AGP > アスピリンであることが判明しました。さらに、AGP とともにヒットしたすべての AGP 類似体は、アスピリンと比較してより負の自由エネルギー値を示しましたが、類似体 A3、A1、および A5 は、ロフェコキシブ、アスピリン、AGP、およびその他の類似体よりも優れた結合親和性を示したことが観察されました。。さらに、類似体 A3、A1、および A5 とタンパク質の複合体は、シミュレーション分析後により安定していることが観察され、また、類似体 A3 が参照化合物および他の研究対象類似体と比較して COX-2 タンパク質に対してより良好な結合を示したことも示唆されています。 MM/GBSA の結果は、ドッキング、MD シミュレーション、および DFT 分析の結果も裏付けており、A3 類似体が AF-COX-2 活性を阻害する有望な化合物であり、有望な天然抗炎症剤として使用できることを確立しています。薬。

MD シミュレーション前後のロフェコキシブ (1)、アスピリン (2)、AGP (3)、および選択された類似体 A1 ～ A7 (それぞれ 4 ～ 10) の MM/GBSA エネルギースコア。

全体として、我々の結果は、アンドログラホリド類似体 A3 が COX-2 タンパク質に対して最も強力かつ効果的な植物ベースの天然薬物分子であることを明らかにしています。この類似体の有効性は、COX-2 阻害に関して他の天然化合物および合成化合物と比較されました。ドッキング分析による A3 の結合エネルギーは、-8.56 kcal/mol であることが判明しました。これは、バージンココナッツオイル誘導体 (誘導体の BE 範囲: - 5.65 kcal/mol ～ - 7.58 kcal/mol)、アリイン (- 4.90 kcal) よりも優れています。 /mol)、ピノレジノール (− 8.38 kcal/mol)、およびシリンガレシノール (− 8.23 kcal/mol)90,91,92,93。さらに、A3 の複雑な安定性については、MD シミュレーションと EPE ドッキングシミュレーション解析が実行されました。さらに、参照化合物との詳細な比較分析結果は、同定された類似体 A3 が COX-2 タンパク質に対する効果的な薬剤のような候補であることを裏付けています。我々の知る限りでは、現在までに、アンドログラホリド類似体 A3 が COX-2 を阻害することによる抗炎症活性については研究されていません。したがって、本研究は、COX-2阻害を介して作用する潜在的な抗炎症薬様候補としてのアンドログラホリド類似体A3の開発の基礎を提供する。私たちは、潜在的な COX-2 阻害剤としてアナログ A3 を同定および検証するために無数のケモインフォマティックツールを採用してきましたが、創薬プロセスを促進するために科学界からのさらなる実験的認証が必要です。

本研究では、分子および量子ドッキングシミュレーション研究を含む複合計算アプローチを採用することにより、COX-2に対する有望な植物ベースの抗炎症化合物が同定された。検証された全配列決定されたヒト AF-COX-2 タンパク質構造を複数の配列アラインメントに使用して、抗炎症活性の活性部位残基を見つけました。 AF-COX-2 タンパク質に対する 237 個の AGP アナログの仮想スクリーニングとそれに続く対話型ドッキング研究により、ADMET 予測分析からも薬剤のような候補を示した 7 つのヒット AGP アナログがスクリーニングされました。さらに、リガンド効率測定基準、DFT 記述子、つまり HOMO、LUMO、HLG、および EPE によって、それらの良好な化学反応性が確立されました。さらに、MD シミュレーション、EPE ドッキングシミュレーション、および MM/GBSA 研究により、A3 アナログ (3-[2-[(1R,4aR,5R,6R,8aR)-6-ヒドロキシ-5,6,8a-トリメチル- 2-メチリデン-3,4,4a,5,7,8-ヘキサヒドロ-1H-ナフタレン-1-イル]エチリデン]-4-ヒドロキシオキソラン-2-オン) は、AF-COX-2 と最も安定な錯体を形成し、有望な天然の抗炎症剤となるでしょう。近い将来、これらの発見を実証するために追加の実験的検証が必要となります。

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著者らは、この研究を実行するための施設を提供してくれたヴェールール工科大学の経営陣に感謝します。

School of Biosciences and Technology、Vellore Institute of Technology、Vellore、Tamil Nadu、632014、インド

プリヤンカ・ジェイン & C. スダンディラドス

ナノバイオテクノロジーセンター、ヴェールール工科大学、ヴェールール、タミル・ナドゥ、632014、インド

ジテンドラ・サティヤ

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PJ: 研究の概念化と設計。計算分析と最初の草稿の作成。 CSD 博士: 概念化、監督、データのキュレーション、レビュー、編集。 JS: 概念化、レビュー、編集。著者全員が最終原稿を読んで承認しました。

C. スダンディラドスへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

シュプリンガーネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

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転載と許可

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受信日: 2022 年 11 月 10 日

受理日: 2023 年 5 月 14 日

公開日: 2023 年 5 月 19 日

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