ポリ不足 - 株式会社コーストワイズ・ベンチャーズ・グループ

Scientific Reports volume 13、記事番号: 2800 (2023) この記事を引用

703 アクセス

2 オルトメトリック

メトリクスの詳細

アシネトバクター・バウマニは、抗薬物機構を急速に調節することによって抗生物質に耐性を持つことができる院内病原体です。多剤耐性 A. バウマニは、私たちの社会にとって最も脅威的な病原体の 1 つと考えられています。バイオフィルムの形成とバイオフィルムマトリックス内の持続細胞は、特に院内感染において、解決困難な問題として認識されています。ポリ-β-1,6-N-アセチル-グルコサミン (PNAG) は、A. バウマニのバイオフィルムの重要な構成要素の 1 つです。今回我々は、残基Ser411がリン酸化されている、PNAGデアセチラーゼであるAbPgaB1のタンパク質リン酸化制御を発見した。 AbPgaB1 のリン酸化制御は、脱アセチル化 PNAG が生成され、バイオフィルム生成に反映される生成物代謝回転速度を調節します。さらに、PgaB 欠損 A. baumannii 株は、バイオフィルム生成レベルが最も低いものの、抗生物質コリスチンおよびテトラサイクリンに対する最小阻害濃度が高いことを発見しました。我々は、抗生物質投与後の殺菌効果と抗菌薬による時間依存性殺傷アッセイに基づいて、PgaB 欠損 A. baumannii がコリスチン耐性細胞に変換すると主張します。この研究では、A. baumannii のバイオフィルム非依存性コリスチン耐性モデルを利用して、その特徴とメカニズムをさらに調査し、臨床転帰をよりよく理解します。

ここ数十年、抗生物質耐性の増加により、院内病原体感染のリスクが高まっています。カルバペネム耐性アシネトバクターバウマニは、重症患者におけるしばしば生命を脅かす日和見感染症の一般的な原因です。カルバペネマーゼの発現は、薬剤耐性病原体にカルバペネム耐性を与える最も重要な機構です 1,2。外膜ポリンの喪失 3,4、ペニシリン結合タンパク質の発現差 5、排出系の過剰産生 6 などの証拠も、A. バウマニのカルバペネム耐性に関与していると報告されています。バイオフィルムの形成により、A. baumannii はさまざまな環境で定着することができ、通常は病原性と関連しています 7,8。バイオフィルム形成を開始するための最初のステップは、浮遊細胞が生物または非生物の表面に付着する必要があることです。細胞間の接着と細胞増殖の手順を通じて、バイオフィルム構造は成熟し、新しい環境に分散すると浮遊性ライフスタイルを再開します。 A. baumannii におけるバイオフィルム形成に関連するいくつかの因子が同定されており、これには CsuA/BABCDE 線毛誘導シャペロン集合系 9,10、BfmS/BfmR 2 成分系 11、外膜タンパク質 OmpA12,13、バイオフィルム関連タンパク質 14,15 が含まれます。、自己誘導物質合成酵素 AbaI16、およびポリ-ベータ-1-6-N-アセチルグルコサミン (PNAG) 合成に必要なタンパク質複合体 PgaABCD 17。

部分的に脱アセチル化された PNAG (dPNAG) は、A. baumannii 17、Aggregatibacter spp.18、Bordetella pertussis 19,20、Klebsiella pneumonia 21、Staphylococcus aureus 22、S.epidermidis 23 などのいくつかのヒト病原体でバイオフィルムを構築するために必要なエキソ多糖であると考えられています。 A. baumannii では、エキソ多糖 dPNAG が重合し、PgaABCD システムを介して転位します 17。大腸菌における相同系は、PgaC と PgaD が PNAG 重合に必要であることを示しています 24。重合した PNAG は PgaB によって部分的に脱アセチル化され、その後 PgaA24 によって外に移動されます。大腸菌ノックアウト株のバイオフィルム検出結果から、PgaA と PgaB が PNAG 転座に必要であるのに対し、PgaC 欠失株は検出不能な重合 PNAG を持っていることが明らかになりました 17,24。 PNAG トランスポーター PgaA は、dPNAG25 に最初に結合するために、β バレル分泌孔内にいくつかの負に荷電した残基を持っていました。部位特異的変異とバイオフィルムの検出により、PgaA 分泌孔内の負に帯電した残基が正に帯電した dPNAG25 と優先的に相互作用することが明らかになりました。したがって、完全にアセチル化された PNAG は、バイオフィルム支持体外多糖として機能するために輸出されるとは考えられませんでした 25。

PNAG N-デアセチラーゼ PgaB は、PNAG のアセチルレベルの制御に重要な役割を果たし、PgaA26 による dPNAG 転座の架け橋として機能します。 PgaB の N 末端ドメインと C 末端ドメインは両方とも、PNAG の脱 N-アセチル化を処理するために必要です 26。脱 N-アセチル化の触媒領域は PgaB の N 末端ドメインに位置していますが、C 末端ドメインはグリコシル加水分解活性を有しており、PNAG の輸送に重要です 20,26。 EcPgaB の結晶構造分析に基づいて、特定の β ヘアピンループ (残基 610 ～ 623) が PNAG/dPNAG と相互作用して輸出されると主張されています 26。 PgaB は、β-1,6-グルコサミンを部分的に脱アセチル化するコバルトおよびニッケル依存性活性を示したが、β-1,4-グルコサミンオリゴマーは示さなかった 27。グルコサミン五糖の特定の脱 N-アセチル化位置は、非還元末端から 2 番目または 3 番目の単糖で発生しました 27。脱N-アセチル化位置は、エキソグリコシダーゼSpHex27処理と組み合わせた完全アセチル化β-1,6-グルコサミン五糖を用いて決定されたが、細菌から単離された天然エキソ多糖PNAGは依然として長さとその脱アセチル化位置の高い多様性を示した。

気管支敗血症菌 PgaB (BbPgaB) のグリコシルヒドロラーゼ活性により、PNAG 産生における新たな調節機構が発見され、脱アセチル化 PNAG20 のグリコシド消化が実証されました。 BbPgaB の C 末端ドメインは、グリコシド加水分解酵素ファミリー 153 (GH153) に分類され、大腸菌 PgaB20 とオルソロガスです。 PgaB の脱アセチル化活性には N 末端ドメインと C 末端ドメインの両方が必要ですが、BbPgaB および EcPgaB の切断された C 末端ドメインは dPNAG20 を加水分解できます。切断に必要な dPNAG ポリマーのモチーフは GlcN-GlcNAc-GlcNAc として同定され、完全にアセチル化された PNAG が BbPgaB20 の C 末端ドメインの基質として認識されないことが実証されました。

バイオフィルムマトリックスは細菌に対する物理的保護剤と考えられており、抗生物質耐性の向上につながります。プロテオミクスおよび突然変異誘発の研究により、OmpA、Omp33、CarO、OprD 様タンパク質、推定 DcaP 様タンパク質、およびヒスチジン代謝がバイオフィルム形成に不可欠であることが実証されました 21。しかし、PNAG 媒介バイオフィルム形成と関連する A. baumannii の薬剤耐性の研究に関する情報はほとんどありません。 A. baumannii 臨床株のトランスクリプトームにおける以前の比較では、コリスチン耐性株における PgaB (A1S_0938) の転写レベルがコリスチン感受性株よりも有意に高いことが明らかになりました 28。タンパク質の翻訳後修飾は、いくつかの生理学的反応に応答してタンパク質の機能を調節する可逆的な制御です。我々の以前の研究では、A. baumannii 臨床株 SK17 の PgaB がリン酸化されていることが明らかになりました 29。この研究により、A. baumannii ATCC15151 における PgaB 媒介バイオフィルム生成のリン酸化制御が確認されました。部位特異的変異およびN-脱アセチル化活性アッセイによると、PgaBの残基Ser411に対するリン酸修飾は、著しく高い代謝回転率を示し、その結果、バイオフィルムの構成要素として機能するdPNAGの産生が増加しました。我々は、A. baumannii において、PNAG を介したバイオフィルム生成量がコリスチン耐性と負の相関があることに気づきました。 PgaB 欠失株は、生成するバイオフィルムの量が最も少ないものの、著しく高いコリスチン耐性を持っていました。我々は、PgaB 欠損 A. baumannii 株はペリプラズムに PNAG を蓄積し、これが A. baumannii の細胞膜を標的とするコリスチンの能力を妨げる可能性があると仮説を立てています。

Pga オペロンでは、N-アセチルグルコサミン脱アセチラーゼ PgaB は PNAG のアセチル化度を調節する能力を有しており、これにより PgaA β バレル内腔構造に対する PNAG の結合親和性が直接調節されます 25。次に、部分的に脱アセチル化されたPNAG（dPNAG）は、PgaAを介して細胞外多糖として輸送されました（図1a）。大腸菌における PgaA の TPR ドメインは、部分的に脱アセチル化された PNAG の輸送に重要な PgaB へのタンパク質間相互作用に関与しました 30。この情報に基づいて、我々は、A. baumannii におけるバイオフィルム形成が N-デアセチラーゼ PgaB によって制御されているのではないかという仮説を立てました。配列決定されたすべての A. baumannii 株には、A1S0938 ～ A1S0940 および A1S2162 ～ A1S2159 の 2 つの Pga オペロンが存在します (図 1a)。 N-アセチルグルコサミンデアセチラーゼの両方のコピー (A1S0938 および A1S2161) は PgaB として注釈が付けられ、現在定義されている炭水化物活性酵素データベース (CAZy) 内の炭水化物エステラーゼファミリー (CE4 ファミリー) に分類されました。この研究では、遺伝子 A1S0938 および A1S2161 のコードタンパク質をそれぞれ AbPgaB1 および AbPgaB2 として定義しました。 PgaBは外膜アンカー型タンパク質であり、AbPgaB1の残基S12〜N194およびAbPgaB2の残基H35〜W70がTMRPres2D31によって予測される膜貫通領域である（図S1）。 AbPgaB1 は、EcPgaB および BbPgaB とそれぞれ 35.68% および 41.64% の配列同一性を共有します。系統解析によれば、AbPgaB1 (A1S0938) は、C 末端ドメインでグリコシド加水分解活性を有する可能性がある気管支敗血症菌に近似しています (図 1b)。 AbPgaB1 と AbPgaB2 の配列同一性は低い (32%) ものの、大腸菌、肺炎桿菌、気管支敗血症菌、百日咳菌、ブドウ球菌由来の PgaB 内では依然としてクラスター化されていますが、シュードモナス由来の多糖デアセチラーゼ内ではクラスター化されていません。 (図1b)。

A. baumannii における 2 つの PNAG 合成オペロンの概略図。 (a) コード遺伝子 A1S-0938 ～ A1S-0940 および A1S-2162 ～ A1S-2159 は、A. baumannii の PNAG 合成オペロンとして注釈が付けられました。 PgaC (茶色) および PgaD (オレンジ) タンパク質複合体は細胞膜上に位置し、N-アセチルグルコサミンを重合させます。 PgaB は、外膜に固定され、ペリプラズムに位置する PNAG デアセチラーゼです。外膜輸送タンパク質 PgaA は、部分的に脱アセチル化された PNAG の細胞外多糖としての輸送に寄与しました。 (b) 近隣結合クラスタリング法に基づく細菌の CAZy データベースの CE4 ファミリーの多糖デアセチラーゼの系統解析。

PgaB は PNAG 上のアセチル基の比率を調節すると考えられています。しかし、バイオフィルムマトリックスとして示差的なアセチル化 PNAG を生成するための PgaB の制御はまだ不明です。 A. baumannii の単一遺伝子欠失 (ΔAbpgaB1) および二重遺伝子欠失 (ΔAbpgaB1ΔAbpgaB2) 株をエキソ多糖分析用に構築しました。 A. baumannii ATCC 15151 (Ab15151) およびその派生変異株から抽出されたアセチルレベルのエキソ多糖 (PNAG を含む) は、プロトン NMR 分析に基づいて決定されました (図 S2)。アセチル化 PNAG のシグナルは、プロトン NMR プロファイルの 2.0 ppm のピークの積分面積に基づいて相対的に定量化されました (図 S2)。抽出された多糖のアセチル化度はΔAbpgaB1よりわずかに増加し、二重欠失ではさらに増加した。 pgaB二重欠失株から抽出されたエキソ多糖は、Ab15151よりも高いアセチルレベルのシグナルを示し、AbPgaB1とAbPgaB2の両方のN-デアセチラーゼ活性がAb15151のPNAGのアセチル化レベルを調節できることが実証された。

我々は、プロテオミクス解析とリンプロテオミクス解析の両方を実行して、A. baumannii の浮遊生活様式とバイオフィルム生活様式の間で発現の異なるタンパク質を調査しました。プロテオミクスデータを組み合わせると、Ab15151 の浮遊性ライフスタイルとバイオフィルムライフスタイルの両方から 1,334 個の構成的に発現されたタンパク質を同定できました (図 S3)。 A. baumannii のプランクトン性およびバイオフィルムからのみ同定された、それぞれ 174 および 226 のユニークなタンパク質がありました (図 S3)。これらの同定されたタンパク質のうち、AbPgaB1 (A1S0938) は、「方法」に記載されている標準手順を使用したリンプロテオミクス分析により、信頼できるリンタンパク質として定義されました。 AbPgaB1 のコード遺伝子を構築し、過剰発現のために Ab15151 に形質転換し、精製された AbPgaB1 に基づいて LC-MS/MS 分析によりそのリン酸化部位 (p サイト) を確認しました。 AbPgaB1 上の 4 つのリン酸化ペプチド (p-ペプチド) から 7 つの明確な p 部位が同定されました (表 S1)。 Jpred432 による AbPgaB1 のタンパク質の二次構造予測によると、p サイト H229 は N 末端ドメインの α ヘリックス 7 (α7) に位置し、p サイト T407、D408、S411、および D413 はループ 11 に位置します。 C末端ドメイン内（図2a）。他の2つのp部位、Y482とY507がそれぞれC末端ドメインのα13とα14に位置していました（図2a）。 AbPgaB1 の構造は、大腸菌 PgaB 結晶構造を鋳型として SWISS-MODEL により予測されました (PDB: 4P7R)26。 MS/MSデータによると、AbPgaB1上の7つのp部位がNドメインおよびCドメイン上にマークされ、それぞれPNAGデアセチラーゼ活性およびグリコシル加水分解活性を有すると注釈が付けられました（図2b）。 AbPgaB1のリン酸化修飾の制御を解明するために、N-アセチルグルコサミン（4-NAG）の四糖をAbPgaB1のモデル化された構造にドッキングしました（図2b）。 p サイト S411 および D413 は、AbPgaB1 の 4-NAG に近く、これらが AbPgaB1 のリン酸化制御の研究の候補である可能性があることが明らかになりました。 p部位T407、D408、S411、およびD413を含むループ11のpペプチド「407TDPVSKDLVVTEQAK421」のMS/MSスペクトルを図2cに示します。これらの結果は、AbPgaB1 の C 末端ドメイン、特に残基 S411 および D413 のリン酸化調節がその活性を調節する可能性があることを示しています。

AbPgaB1 上の同定されたリン酸化部位は、二次構造と三次構造でマークされています。 (a) AbPgaB1 の二次構造は Jpred4 によって予測されました。アルファヘリックス構造とベータシート構造は、それぞれ紫色と黄色でマークされました。同定された p 部位は、AbPgaB1 配列上で「p」(赤色) でマークされました。 (b) PNAG の四糖、主鎖がスティック (緑色) で示されている 4-NAG を AbPgaB1 モデル構造 (漫画、SWISS-MODEL によるテンプレート PDB: 4P7R26 に基づいて予測) にドッキングし、リン酸化残基の位置を表示します。 (黄色) 3D 構造内。モデル化された構造は PyMOL を使用して編集されました。 (c) AbPgaB1 上の p-ペプチド「407TDPVSKDLVVTEQAK421」の MS/MS スペクトル。各ピークはタンデム質量分析分離後のフラグメントの m/z を明らかにし、MaxQuant によって処理されます。 N 末端 b イオンと C 末端 y イオンのフラグメントは、それぞれ青と赤で強調表示されています。

モデリング構造分析によれば、p サイト Ser411 が生成物 dPNAG の結合と放出に重要であるという仮説を立てました。次いで、ＡｂＰｇａＢ１の残基Ｓｅｒ４１１をＡｌａまたはＡｓｐで置換して、非リン酸化またはリン酸化条件を模倣した。 AbPgaB1 とその部位直接変異誘導体をそれぞれ pABCLIIa 発現ベクターに構築し、さらなるアフィニティー精製のために C 末端 His タグ融合タンパク質を生成しました。過剰発現したAbPgaB1およびその誘導体を、基質として部分的に脱アセチル化されたPNAGを使用することによる脱アセチル化活性アッセイ用に精製した。 AbPgaB1 デアセチラーゼ活性の速度論的パラメーターは、Ser411 が Asp で置換されると Km 値が 4.9 倍増加することを明らかにしました (表 1)。一方、AbPgaB1 の最大速度は、Ser411 がリン酸化されると 8.4 倍向上しました (表 1)。非リン酸化 S411A 変異 AbPgaB1 と比較して、リン模倣 AbPgaB1 (S411D) は劇的に高いターンオーバー数を有しており、より多くの脱アセチル化 PNAG 産生を示唆しています。

AbPgaB1 のリン酸化媒介制御を解明するために、GlcNAc 四糖が組み込まれた EcPgaB (PDB: 4P7R)26 結晶構造をテンプレートとして、AbPgaB1 C 末端ドメイン (残基 308 ～ 659、AbPgaB1308 ～ 659) のモデリング構造を構築しました。。モデリング構造AbPgaB1308〜659は、高度に保存されたGlcNAc四糖相互作用残基を示したEcPgaB（PDB：4P7R）および気管支敗血症菌PgaB（BbPgaB、PDB：6AU1）20と整列しました（図S4a、b）。 EcPgaB の結晶構造解析によると、残基 W552 はピラノイド環と緊密に積み重ねられた相互作用を形成し、D472 は GlcNAc の OH-3 および OH-4 に水素結合します。 AbPgaB1 の残基 W549 および D470、および BbPgaB の残基 W561 および D480 の空間的再配置は、EcPgaB の残基 W552 および D472 まで高度に保存されており、これらの残基が GlcNAc 四糖結合に関与していることを示唆しています (図 S4a)。さらに、AbPgaB1308-659 の残基 D473 は、GlcNAc 四糖と二座水素結合を形成すると考えられる EcPgaB (PDB: 4F9J) の残基 D475 と同一でした 27。したがって、AbPgaB1308-659 の W549、D470、および D473 などの近くの残基は、GlcNAc 四糖リガンドの柔軟なドッキングを可能にする活性部位として定義されました。この相互作用から生じる異なる回転異性体の中で、エネルギーが最も低い回転異性体が、AbPgaB1308-659のモデル化された構造に組み込まれたGlcNAc四糖として選択されました（図S4c）。

AbPgaB1308-659 モデリング構造における GlcNAc 四糖の還元末端は + 1 サブユニットとして定義されました (図 S4c)。 AbPgaB1308-659 では、残基 W549 はピラノイド環とのスタッキング相互作用、およびその主鎖の + 2 GlcNAc の N-アセチル部分への水素結合に関与しています。残基Y430上の主鎖の酸素は、GlcNAcの+1サブユニットの水素結合N-アセチル部分を形成しました（図S4c）。 AbPgaB1308-659 は、残基 D413、R432、E472、S469、T467 の側鎖、および Y430 の主鎖を含む水素結合ネットワークによって +1 GlcNAc に強く配位されました。残基E472と+ 1 GlcNAcの間の単一のCH-π相互作用もリガンド結合に寄与しました（図S4c）。保存されたR432-E472塩橋（図S4b）は、+ 1 GlcNAcの調節に寄与し、PNAG結合におけるそれらのループを安定化させる可能性があります（図S4b、c）。したがって、R432の近くに位置するリン酸化模倣体Ser411（S411D）は、既存のR432-E472塩橋を破壊し、ループ27（塩橋競合モデル）33の部分的な展開を引き起こすと考えられます（図S4d、e）。このイベントは、+1 GlcNAc の調節を可能にする水素結合ネットワークに影響を与える可能性があります。さらに、モデル化された野生型複合体と比較して、AbPgaB308-659のS411Dのバルクホスホリル基はPNAGの空間反発を引き起こし、その結合を妨げます（図S4d、e）。

バイオフィルム形成における AbPgaB1 に対するリン酸化媒介制御の影響を調べるために、Ab15151 およびその派生変異株を走査型電子顕微鏡 (SEM) で観察しました。野生型Ab15151からのバイオフィルムは、凝集構造と細胞付着エキソ多糖を示しました（図3a）。 AbPgaB1欠失株（ΔAbpgaB1）は、観察可能な外多糖を伴わずに、バイオフィルムマトリックス中に凝集した細胞を表示しました（図3a）。この細胞付着エキソ多糖は、AbpgaB1 が褒められたときに生成されました。さらに、我々は、補完されたリン酸化模倣体 AbPgaB1 (Δ + S411D) がバイオフィルム構造において細胞凝集と細胞付着外多糖の両方を示すことに気づきました。逆に、非リン酸化模倣性 AbPgaB1 (Δ + S411A) で補完された株からは細胞付着エキソ多糖は観察されませんでした (図 3a)。 Ab15151 およびその派生変異株からのバイオフィルム生成量は、クリスタルバイオレット染色によって定量されました。すべての定量値は、Ab15151 からのバイオフィルム量に基づいて正規化されました。 A. baumannii は、AbpgaB1 がノックアウトされた場合、バイオフィルムの生成が少なくなります (58%) (図 3b)。野生型AbpgaB1をAbpgaB1欠失株に相補した場合、バイオフィルム生成はAb15151の83％まで回復しました（図3b）。非リン酸化AbPgaB1（Δ+S411A）およびリン酸化AbPgaB1（Δ+S411D）で補完された株からの相対バイオフィルム量がそれぞれ61％および101％であったことは注目に値します（図3b）。それは、PNAG 脱アセチル化レベルが、AbPgaB1 上の残基 Ser411 におけるリン酸媒介修飾によって調節され、A. baumannii におけるバイオフィルム生成を反映していることを実証しました。

A. baumannii ATCC15151 および AbpgaB1 媒介変異株におけるバイオフィルム生成の観察と定量化。 (a) Ab15151 およびその誘導体におけるバイオフィルム形成の SEM による観察。上のパネルは 7,500 倍の倍率でのビューを示し、下のパネルは 10,000 倍の倍率でのビューを示します。バーは 1 μm の目盛りを示しました。 (b) バイオフィルムをクリスタルバイオレット染色によって定量化し、595 nm での吸光度を測定しました。 Ab15151 の OD595 値を 100% として定義し、その派生変異株からの相対バイオフィルム量を計算しました。各データポイントは少なくとも 6 回の繰り返しから平均されました。 * t 検定の p 値が 0.001 未満であった Ab15151 との有意差を示します。

A. baumannii のバイオフィルム生成能力は、その毒性と薬剤耐性に比べてプラスの傾向にありました。上記の証拠は、A. baumannii におけるバイオフィルム生成が、AbPgaB1 上の 1 残基のリン酸修飾によって調節されていることを明らかにしています。我々はさらに、AbPgaB1 の残基 Ser411 が脱リン酸化されると、A. baumannii の抗生物質耐性が低下するはずであると仮説を立てました。 A. baumannii はゲノム内に pgaB のコピーを 2 つ持つため、さらなる抗生物質感受性アッセイのために単一および二重 pgaB 欠失株を構築しました。ブロス希釈法に基づく最小発育阻止濃度 (MIC) の測定によれば、試験した A. baumannii 株間でイミペネム、シプロフロキサシン、アプラマイシン、およびバンコマイシンに対する MIC 値に有意差はありません (表 2)。これにより、バイオフィルム形成の独立性とこれら 4 つの抗生物質に対する耐性が明らかになりました。我々は、AbpgaB1とAbpgaB2の両方を欠失させると、コリスチンおよびテトラサイクリンに対するA. baumannii株のMIC値が大幅に増加することに気づきました（コリスチン2.0〜16.0 mg/Lおよびテトラサイクリン0.5〜16.0 mg/L）（表2、ΔAbpgaB1ΔAbpgaB2、ΔΔ）。これらのデータは、この研究では PgaB 二重欠失株が A. baumannii 株の中で最も少ない量のバイオフィルムを生成したが、抗生物質コリスチンおよびテトラサイクリンに対して最も高い耐性を持っていたという我々の仮説を反証します (表 2、図 S5)。ポリミキシン E としても知られるコリスチンは、細菌内のリポ多糖 (LPS) を標的にして細胞膜の完全性を破壊し、細菌を殺す可能性があります。多剤耐性病原体による感染症の最後の治療法と考えられています。私たちの知る限り、PNAG 脱アセチル化酵素 PgaB と LPS の構造との相関関係を裏付ける証拠はありません。興味深いことに、コリスチンに対する A. バウマンニの耐性は、その PNAG N-デアセチラーゼ PgaB に関連しています。そして、コリスチンが細胞質膜の LPS に影響を与えるという証拠があります 34。したがって、我々はさらに、PgaB二重欠失株は、アセチル化PNAGがペリプラズムに蓄積してコリスチン処理による破壊を妨げるPNAGポンプアウト欠損株を示したと仮説を立てた。しかし、両方の PgaB が欠失した場合のコリスチン耐性に関与する詳細なメカニズムを解明するには、さらに多くの証拠が必要です。

テトラサイクリンは、30S リボソームに結合し、タンパク質合成を阻害する抗生物質の一種です。 PgaB 二重欠失株は、より高いテトラサイクリン MIC 値を示しました (表 2)。アプラマイシンもこの研究で使用された別の抗生物質です。アプラマイシンはタンパク質合成を標的にして細菌を阻害します。アプラマイシンに対するMICは、この研究で試験したすべてのA. baumannii株の間で差異を示さなかった(表2)。したがって、我々は、PgaB 二重欠失株のテトラサイクリン耐性は、細菌細胞を透過する能力の欠如によって引き起こされると考えました。ただし、この仮説を検証するにはさらに多くの研究が必要です。 AbpgaB1相補Ab株のMICによると、ΔAbpgaB1またはΔAbpgaB1ΔAbpgaB2バックグラウンドのWT、S411A、またはS411D変異AbPgaB1のいずれも、コリスチンおよびテトラサイクリンに対して同様の感受性を示しました（表2、図S6）。これは、コリスチンまたはテトラサイクリン耐性が両方の PgaB 欠失株で発生し、AbpgaB1 相補によって回復できることを示しました (表 2)。

AbpgaB1 および/または AbpgaB2 が欠失した場合のバイオフィルム条件における抗生物質耐性を把握するために、最小バイオフィルム根絶濃度 (MBEC) を調べました (表 3)。試験したすべての菌株の MBEC は MIC よりも高く、バイオフィルムに埋め込まれた細菌細胞がより高い抗生物質ストレスを克服できることを示しています。 ΔAbpgaB1ΔAbpgaB2 株と他の試験株の MBEC に有意な差はありません。 MBEC データは、ΔAbpgaB1ΔAbpgaB2 株におけるコリスチンおよびテトラサイクリン耐性がバイオフィルム生成に寄与していないことを明らかにしています。 PgaB 二重欠失株で発生した薬剤耐性が再現可能であることを確認するために、抗菌薬の MIC を 4 継代で測定しました。我々は、ΔAbpgaB1ΔAbpgaB2株のコリスチンおよびテトラサイクリンに対するMICが、第1継代から第4継代に二次移入されたときに増加することに気づきました（図S6）。この現象は、少なくとも 3 回の独立したテストで再現可能でした。このことが私たちに、PgaB 欠損 A. baumannii が抗生物質耐性細胞に変化してコリスチンの殺菌効果を克服できるという仮説を提案するきっかけとなりました。持続細胞は、殺菌性抗生物質にさらされても生き残る細菌の集団を示しています 35。抗生物質の持続性細菌は MIC の増加を引き起こしませんが、非持続性細胞よりも低い速度で死滅します 35。 ΔAbpgaB1ΔAbpgaB2株の4継代中のコリスチンおよびテトラサイクリンに対するMICの増加は、それが持続細胞の量によって寄与されていないことを示した。飢餓ストレスは、4 継代インキュベーション中の主要な選択圧です。これは、A. baumannii における PgaB の欠損が、抗生物質ストレスを克服する進化につながる可能性があることを実証しました。

この研究では、WT 株と変異株の間の抗生物質耐性を調査するために、A. baumannii に対するコリスチンの抗生物質後効果 (PAE) を実行しました。コリスチン投与のために、一晩培養したAb株をOD600 0.1に希釈した。試験濃度でのコリスチン処理の１時間後、試験した各Ａｂ株を段階希釈し、ＬＢ寒天プレート上にスポットした（図４ａ）。 Ab15151、ΔAbpgaB1、およびΔAbpgaB2はすべて、16.0〜64.0μg/mLの濃度でコリスチンの影響を受けやすいことに気づきました（図4a）。ただし、PgaB二重欠失株（ΔAbpgaB1ΔAbpgaB2）は、16.0、32.0、または64.0μg/mLのコリスチンで1時間処理した場合に最も高い耐性を示しました（図4a）。抗生物質の持続性と耐性を区別するために、ΔAbpgaB1ΔAbpgaB2株は、16.0μg/mLのコリスチンの存在下で0〜4時間の処理で他の株よりも遅い速度で死滅しました（図4b）。 PgaB二重欠失株の感受性は、AbpgaB1で補完すると回復しました（表2、図4a、b）。用量依存性および時間依存性の PAE の両方から、pgaB 二重欠失株が高いコリスチン耐性を有することが実証されました。これは、コリスチン処理後、PgaB 欠損 A. baumannii の持続細胞がコリスチン耐性細胞に変換する能力を持っている可能性があるという我々の仮説を裏付けています。これは、ΔpgaB1ΔpgaB2 株で起こる進化の発生率が、この研究で試験された他の A. baumannii 株よりも速い可能性があることを示しています。テトラサイクリン系 PAE は、試験したすべての用量および期間において、Ab 株間で同様のプロファイルを示しました。 (図4c、d)。最初にロードされた細菌細胞（約 106 CFU/mL）は、4.0、8.0、または 16.0 μg/mL の濃度で 1 時間処理した静菌薬テトラサイクリン（図 4c）または 8.0 μg/mL 後に死滅しなかったことが明らかになりました。 μg/mL テトラサイクリンを 4 時間投与 (図 4d)。我々は、殺菌剤シプロフロキサシンまたは静菌剤アプラマイシンを投与した場合、PgaB二重欠失株における抗生物質の持続性が観察されないことに気づきました（図S7）。これは、PgaB 欠損 A. バウマニが抗生物質のコリスチンとテトラサイクリンに対して特異的に耐性があることを意味します。

この研究におけるコリスチンおよびテトラサイクリンの A. バウマンニ株に対する時間依存性の抗生物質投与後の効果。一晩培養物を、コリスチン投与の場合はＯＤ６０００．１、テトラサイクリン投与の場合は０．０１まで希釈した。コリスチン (a) またはテトラサイクリン (c) で 1 時間処理した後、培養物を 10 倍段階希釈して LB 寒天プレート上にスポットしました。 32 μg/mL コリスチン (b) または 8 μg/mL テトラサイクリン (d) を 4 時間以内に投与し、すべての試験株を 10 倍に希釈し、生存率を評価するために一晩インキュベートしました。

抗生物質持続細胞の特有の特徴は、抗生物質の存在下での複製速度が非持続細胞よりも低いことです 35。抗生物質耐性細胞とヘテロ耐性細胞を区別するために、抗生物質投与下での A. baumannii 株の時間依存性死滅アッセイを実施しました。試験したすべての A. baumannii 株は抗生物質投与なしで同様の増殖曲線を示し、この研究では pgaB 欠失株と補体株が複製に影響を及ぼさないことが明らかになりました (図 5)。 16.0 μg/mL テトラサイクリンを含む Ab 株の培養物では、試験したすべての株の中で増殖の停滞が示されました (図 5)。 16.0 μg/mL コリスチンを投与したすべての試験した Ab 株の増殖曲線も、PgaB 欠損株 (ΔAbpgaB1ΔAbpgaB2) を除いて停滞しました (図 5)。 ΔAbpgaB1ΔAbpgaB2株の複製もコリスチンで処理すると阻害されましたが、一定のラグタイム後に増殖が回復しました（図5）。我々は、PgaB欠損バックグラウンドで生き残った細胞がコリスチン耐性細胞に変換し、一晩のインキュベーション中に成長する可能性があると仮説を立てています。

WT および PgaB 媒介 A. baumannii 変異株の時間依存性殺傷アッセイにより、そのコリスチン耐性が実証されました。この研究では、増殖曲線を決定するために、A. baumannii 株の一晩培養物を OD600 0.05 まで希釈しました。抗生物質のコリスチン (赤) とテトラサイクリン (青) を、2 時間のインキュベーション後に最終濃度 16.0 μg/mL で投与しました。 27 時間のインキュベーション中に、各培養物の光学密度をマイクロプレートリーダーによって 600 nm で測定しました。黒で描いた成長曲線は対照として抗生物質を投与しなかった状態である。

この研究の pgaB 変異株の構築は、Ab15151 ゲノム上の AbpgaB1 または AbpgaB2 をノックアウトするための相同組換え領域に基づいていました。下流の pgaC および pgaD 発現に対する極性変異の影響を排除するために、pgaBCD (A1S0938 ~ A1S0940) を発現ベクター pABCLIIb に構築し、次に AbpgaB1 相補株 (+ WT、+ S411A) として pgaB 欠失 Ab15151 (ΔAbpgaB1 または ΔAbpgaB1ΔAbpgaB2) に形質転換しました。、または + S411D)。バイオフィルム形成アッセイは、AbpgaB1補体株(Δ+WT)がバイオフィルム生成を回復できることを示した(図3b)。 MIC測定は、AbpgaB1補体株（S411AまたはS411D変異AbpgaB1を含む）がΔAbpgaB1ΔAbpgaB2バックグラウンドでコリスチンおよびテトラサイクリンに対する感受性を回復できることも示しました（図S4）。我々のこれまでの経験によれば、ブロス希釈 MIC 測定において IPTG によって誘導される相補タンパク質は、構成的に発現されない可能性があります 36。また、ウェスタンを使用して相補されたAbPgaB1上のHisタグ融合シグナルを検出することにより、ブロス希釈MICアッセイでPgaB1発現を確認しました（図S8）。相補されたAbPgaB1は、ΔAbpgaB1バックグラウンドでバイオフィルム生成を回復し、ΔAbpgaB1ΔAbpgaB2バックグラウンドでコリスチンとテトラサイクリンの両方に対する感受性を回復することができた。私たちのデータは、構築した Ab 株に極性突然変異の影響がなかったことを裏付けています。

この研究では、ニンヒドリンを使用して、PNAG が AbPgaB1 によって脱アセチル化されたときに露出した遊離アミンを定量します。 AbPgaB1 の基質は、A. baumannii 臨床株 SK17 から単離された PNAG です。両方の PGA オペロンは配列決定されたすべての A. baumannii 株に存在するため、PNAG はそれらのエキソ多糖の成分の 1 つであるはずです。特定の脱 N-アセチル化位置は、完全にアセチル化された五糖 PNAG を基質として使用することによって明らかにされました 27,37。細菌から単離された天然の PNAG は、アセチル化レベル、脱アセチル化位置、分子量の多様性が依然として高かった。 AbPgaB1 の残基 Ser411 のリン酸化制御を解明するために、ネイティブ抽出 PNAG を基質としてニンヒドリンアッセイを使用して、AbPgaB1 とその部位直接変異誘導体間の速度論的パラメーターを決定しました。天然抽出 PNAG の異なるバッチ間の変動を制限するために、この研究ではすべてのニンヒドリン活性アッセイ用に天然抽出 PNAG の 1 バッチを採取しました。抽出された PNAG はすでに部分的に脱アセチル化されているため、この研究における AbPgaB1 の比活性は、同じベースラインで公開されている他のデータと比較できない可能性があります。ただし、この研究では、同じバッチから単離された PNAG を使用して、AbPgaB1 とその変異体の動態パラメータを比較することが適切です。 AbPgaB1 および部位特異的変異体 S411A または S411D の活性アッセイに基づいて、リン酸化 AbPgaB1 (S411D) は WT および非リン酸化 AbPgaB1 (S411A) よりも高い生成物 dPNAG ターンオーバー数を有すると結論付けます (表 1)。これは、AbPgaB1_S411D がバイオフィルム構築ブロックとしての PgaA ポンプアウトのために PNAG を脱アセチル化する高い有効性を持っていることを明らかにしています。この結果は、Ab15151 およびその派生株におけるバイオフィルムの定量化および SEM 観察とも一致しています (図 3)。

私たちの知る限りでは、配列決定されたすべての A. baumannii 株で高度に保存された 2 つの PGA オペロンが存在します。タンパク質の翻訳後リン酸化は、AbPgaB2 (A1S_2161) ではなく PNAG N-デアセチラーゼ AbPgaB1 (A1S_0938) で見つかりました。バイオフィルム生成と抗菌薬耐性への寄与を解明するために、個々の AbPgaB1 または AbPgaB2 欠失株 (ΔAbpgaB1 または ΔAbpgaB2) および PgaB 二重欠失株 (ΔAbpgaB1ΔAbpgaB2) を構築しました。 AbPgaB1欠失Ab15151株（ΔAbpgaB1）は生成するバイオフィルムが少なく、AbpgaB1_WTで補完されたΔAbpgaB1（Δ+WT）または残基Ser411にリン酸化模倣変異体を含むAbpgaB1（Δ+S411D）ではその表現型が逆転した（図3）。高アセチルレベルの PNAG は、エキソ多糖の輸出に対してより少ない程度で PgaA に結合すると思われます 30 。これは、ΔAbpgaB1ΔAbpgaB2 におけるバイオフィルム生成の減少を反映しています (図 S5)。ＰｇａＢ欠損株（ΔＡｂｐｇａＢ１ΔＡｂｐｇａＢ２）は、試験したすべての株の中でコリスチンおよびテトラサイクリンに対する高い耐性を有していた（表２および図４）。この結果は、抗生物質ストレスを克服するための A. baumannii のバイオフィルム非依存性戦略を実証しました。以前の研究では、PgaB 欠損大腸菌はペリプラズムに蓄積した PNAG によりバイオフィルムを形成できないと述べられています 24。気管支敗血症菌における BbPgaB の研究では、BbPgaB とその脱アセチル化活性が PNAG 転座に必要ではないことが示されました 38。気管支敗血症菌における BbPgaB 非依存性 PNAG 転座を引き起こす可能性は 2 つあります 38。 1 つは、BbPgaA の TPR ドメインが EcPgaA よりも小さく、PgaB と相互作用してその PNAG 転座活性に影響を与える能力を持っています。これは、PgaA の TPR ドメインと PgaB30 の間のタンパク質間相互作用のさらなる研究によって確認されました。もう 1 つの可能性は、BbPgaA TPR ドメインの欠損残基が、PNAG 転座に対して構成的に開いたポーリン構造を引き起こす可能性があるということです 38。 AbPgaA (A1S-2162、812 aa) と EcPgaA (807 aa) の配列アラインメントは 55% の配列同一性を示し、AbPgaA と EcPgaA の間で高度に保存された TPR ドメインおよびポリン構造を示しました。 PDB 4y25をテンプレートとしてSWISS-MODELによって構築されたAbPgaAモデリング構造は、AbPgaAのポリン構造がいくつかの負に荷電した残基を有することを示しています（図S9）。この構造的特徴は、AbPgaA がアセチル化 PNAG よりも脱アセチル化 PNAG を優先して転位する可能性があるという EcPgaA 研究で記載された仮説と一致しています。我々は、この研究におけるPgaB欠損株（ΔAbpgaB1ΔAbpgaB2）は、細胞膜上のLPSを中和するコリスチンを妨げるペリプラズムにPNAGを蓄積し、その結果コリスチン耐性が高くなる可能性があると考えました（表2および図4）。

コリスチンには腎毒性と神経毒性があるため、この抗菌薬の使用はまれになってきています。しかし、コリスチンは依然としてグラム陰性菌、特にカルバペネム耐性 MDR 病原体感染症に対する最後の手段の抗生物質と考えられています。最近の報告では、コリスチンの副作用のリスクが再評価され、MDR グラム陰性病原体感染に対するコリスチンの安全性と高い有効性が実証されています 39,40,41,42。分離された臨床的カルバペネム耐性 MDR 病原体の増加により、コリスチンは検討すべき最後の手段の抗生物質となっています。現在、コリスチン治療におけるヘテロ耐性および治療上の失敗がますます増えており、これはコリスチン耐性のメカニズムを特定する必要があることを意味します43、44、45。コリスチン耐性に関する現在の研究は、染色体媒介およびプラスミド媒介の研究に関与しています。バイオフィルム生成に関与する、mrkC、mrkD、modA、modB、modC、modD、および ppk を含むゲノム領域の喪失が、コリスチン耐性 A. baumannii 株で観察されました 46。プラスミド由来のコリスチン耐性を媒介する mcr-1 および mcr-2 遺伝子が報告されています 47,48。 2 成分系 PmrA/PmrB および PhoP/PhoQ は、LPS 修飾の制御に関連しています 40,42。これらの報告は、ほとんどのコリスチン耐性メカニズムが LPS 修飾と線毛集合媒介バイオフィルム生成に焦点を当てていることを実証しました。この研究では、A. baumannii がバイオフィルムの構成要素としての PNAG 輸送を阻害することでコリスチンを克服する新たな可能性を発見しました。そしてどういうわけか、A. バウマニのこの表現型は、殺菌性抗生物質コリスチンで刺激されたときに生存するコリスチン耐性細胞に変換される可能性があります。

結論として、PNAG 関連バイオフィルムの生成は、A. baumannii に一般的に存在する PNAG 脱アセチラーゼ、PgaB によって制御されていました。 A. baumannii のバイオフィルム生成には 2 つの PgaB コピーが関与しています。 AbPgaB1 は、dPNAG 代謝回転数を調節するために残基 Ser411 でリン酸化調節されており、バイオフィルム生成と直接関係しています。この研究では、MIC 測定と抗菌薬死滅アッセイの両方により、PgaB 欠損 A. baumannii 株 (ΔAbpgaB1ΔAbpgaB2) が野生型および他の派生株よりも抗生物質のコリスチンおよびテトラサイクリンに対して高い耐性を持っていることが明らかになりました。 4 継代中の MIC 測定に応じて、PgaB 欠損 A. baumannii 株 (ΔAbpgaB1ΔAbpgaB2) は、抗菌薬投与なしで 4 継代継代培養中に他の株よりも容易にコリスチン耐性細胞に変換されると考えられました。この研究は、コリスチン耐性 A. baumannii の移行を解明するための新しい表現型モデルを発見しました。 PNAG の産生は A. baumannii 株ごとに異なる可能性があり、すべての臨床株間でバイオフィルム産生レベルの増加に寄与しない場合があるためです。この研究は、臨床における A. baumannii のコリスチン耐性を解明するための可能なメカニズムを提供する可能性があります。

A1S-0938 および A1S-2161 の配列は国立バイオテクノロジー情報センター (NCBI、https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) からダウンロードされ、それらのアクセッション番号はそれぞれ ABO11370 および ABO12588 でした。配列同一性は、NCBI 上の Needleman-Wunsch アライメントによって分析されました。細菌由来の多糖デアセチラーゼは、ClustalW によってアライメントされ、分子進化遺伝学解析バージョン 6.0 (MEGA6) を使用して、近隣結合クラスタリング法に基づいて系統樹が描画されました49。この研究で使用したタンパク質配列の他のアクセッション番号は次のとおりです:大腸菌由来の pgaB (AWY89024)、肺炎桿菌 (AUH99166)、気管支敗血症菌 (AUV49813)、黄色ブドウ球菌由来の IcaB (AAD52057)、表皮ブドウ球菌(AAZ78359)、緑膿菌由来の多糖脱アセチラーゼ (AAG04906)、L. モノサイトゲネス (NP_463944)、枯草菌 (API95827)、および C. ディフィシル (AYD08208)。 A1S-0938 (AbpgaB1) および A1S-2161 (AbpgaB2) の膜貫通領域は、TransMembrane タンパク質 Re-Presentation in 2Dimensions ツール (TMRPres2D) によって予測されました 31。

A. baumannii 株 15151 を LB 培地中で 37 °C で振盪しながら定期的に培養しました。 pgaB欠失Ab株を構築するために、A1S_0938の上流600 bp（全長A1S_0937およびA1S_0938プロモーターを含む）およびA1S_0938の下流1300 bp（全長A1S_0939を含む）を含むフラグメントをdpgaB1と定義しました。 dpgaB1 のフラグメントを pK18mobsacB ベクター (ATCC87097™) にクローニングしました。次に、構築したプラスミドを大腸菌 S17-1 に形質転換し、A. バウマンニ株 15151 に結合させました。構築した dpgaB1 は、選択マーカーとしてのカナマイシン耐性遺伝子との相同組換えに基づいて染色体に組み込まれました。ノックアウト変異体は、抗生物質処理を行わずに10%スクロースを含む培地上で細胞を増殖させることによって選択した。 AbpgaB1 および AbpgaB2 二重欠失 Ab 株は両方とも、AbpgaB2 (A1S_2161) フラグメントの構築に同様の戦略に従い、結合標的は AbPgaB1 欠失 Ab 株 (ΔAbpgaB1) でした。イントランス相補の場合、遺伝子 A1S_0938、A1S_0939、および A1S_0940 を含むフラグメントを、pABYM250 由来のシャトルベクター pABCLIIc にクローニングして、AbpgaB1 相補 Ab 株 (Δ + WT) を生成しました。リン酸化および非リン酸化 AbPgaB1 を模倣する変異体は、AbpgaB1 補体株を鋳型として使用する部位特異的突然変異誘発によって生成されました。さらなるアフィニティーカラム精製のために、AbpgaB1 WT およびその派生変異体を、LacI、LacO、および標的の C 末端の 6 × His タグ融合体からなるシャトルベクター pABCLIIa にサブクローニングしました。

A. baumannii 株 (WT、ΔAbpgaB1、ΔAbpgaB1ΔAbpgaB2) を LB 培地で 37 °C で振盪培養しました。各菌株の合計 1 L の培養物を採取し、50 mL の脱イオン水に再懸濁しました。細胞外多糖類 (EPS) の粗抽出物を脱イオン水に溶解し、懸濁培養物を 100 °C の再沸騰水で 30 分間インキュベートしました。室温まで冷却した後、4℃、12,000 rpmで1時間遠心分離して不溶性マトリックスを除去した。 EPS の全抽出物を、最終濃度 75% のエタノールを用いて 4 °C で一晩沈殿させました。沈殿物を12,000 rpm、4℃で1時間の遠心分離によって収集し、緩衝液（25 mM Tris、pH 8.0、5 mM MgCl2、5 mM CaCl2）に溶解しました。サンプルを DNase (Roche) および RNase (Sigma) で 37 °C で 8 時間処理し、次にプロテイナーゼ K (Bioscience) で 37 °C で一晩処理して、汚染された核酸とタンパク質を除去しました。全抽出物を 100 °C の再沸騰水で 30 分間インキュベートして、残っている可能性のあるすべてのタンパク質を変性させた後、12,000 rpm、4 °C で 1 時間遠心分離しました。上清を、1 KDa 膜により 4 °C で 100 倍量の DI 水に透析しました。サンプルはさらなる分析のために凍結乾燥されました。 EPS のアセチル化レベルを相対的に定量するために、凍結乾燥 EPS を D2O で分解し、プロトン NMR 分析を行いました (Bruker UltraShield、600 MHz/54 mm、14.1 テスラ超電導磁石)。

プロテオームおよびリンプロテオームサンプル調製のために、A. バウマンニ株 15151 を LB 培地中、初期 OD600 0.1 で 30 °C で定期的に培養しました。この研究では浮遊細胞の指数関数期中期と定義される OD600 が 0.4 に達した 6 時間後に培養物を回収しました。 24 時間の継代培養後にバイオフィルム細胞を回収し、液体成分を廃棄し、壁に付着したバイオフィルムを PBS で 3 回洗浄しました。ウェルにＰＢＳを添加し、マイクロプレートを１５分間振盪することによって、バイオフィルム細胞を振盪した。浮遊細胞とバイオフィルム細胞の両方の全抽出物を超音波処理によって得ました。タンパク質濃度は、Bradford アッセイ (Bio-Rad) に基づいて定量されました。

抽出されたタンパク質 5 ミリグラムを、ゲルベースの手順とゲルを使用しない手順の両方でトリプシン (1:40 w/w) を使用して消化しました 51,52。トリプシンペプチドは、さらなるプロテオミクス分析のために SDB-XC StageTip を通じて脱塩されました。浮遊細胞およびバイオフィルム細胞からのリンペプチドは、10 μL C8-StageTips46 に詰められた 0.5 mg TiO2 ビーズ (GL Sciences) を使用して調製されたカスタムメイドの HAMMOCK チップを使用して濃縮されました。得られたリンペプチドは、さらに液体クロマトグラフィー - エレクトロスプレーイオン化質量分析 (LC-ESI-MS、Fusion) 分析 (Thermo Scientific) を行うために凍結乾燥されました。 MS および MS/MS の生データは、A. baumannii 株 1515153 のデータベースに基づいて MaxQuant ソフトウェア (バージョン 1.5.1.2)50 を使用して分析されました。ペプチド、タンパク質、および修飾部位の誤検出率は 0.1% に設定され、リン酸化部位の最小 MaxQuant スコアは 40 で、局在化確率は少なくとも 75% でした。同定された各タンパク質の遺伝子オントロジーは、Uniprot データベース (www.uniprot.org) に基づいて注釈が付けられました。 MS プロテオミクスデータとリンプロテオミクスデータは、PRIDE54 パートナーリポジトリを介して、それぞれデータセット識別子 PXD010140 および PXD010172 で ProteomeXchange コンソーシアムに寄託されました。

この研究における AbPgaB1 のタンパク質構造は、テンプレート PDB: 4f9j を使用してソフトウェア SWISS-MODEL によってモデル化されました。モデリング構造はPyMOLにより表示されました。モデリング構造はリガンドとタンパク質の間の信頼できる情報を提供できると考えられました。 Discovery Studio 3.5 (Accelrys Software, Inc.、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国) に実装されたスケッチ分子およびリガンド準備モジュールを使用して、すべての化合物の分子構造を構築しました。ドッキング解析に使用する化合物は、(1) 二次元構造を三次元構造に変換、(2) 電荷計算、(3) H 原子の付加の 3 つのステップで調製しました。分子モデリングを使用して、AbPgaB1-PNAG 複合体の複雑な構造を再現しました。 AbPgaB1 残基 V410、S411、K412、D413、L414、A422、G423、E424、H425、L426、W427、M428、G429、L431、R432、D444、T467、L468、S469、E472、W549、および Y550 を構成要素として定義しました。ティンタンパク質とリガンドの柔軟なドッキングにおける結合部位。これは、GoldScore スコアリング機能を備えた GOLD ドッキングプログラム (Cambridge Crystallographic Data Center (CCDC)、バージョン 5.1) を使用して達成されました。結合部位残基の側鎖は、ドッキング解析中に柔軟になるように設定されました。構築され、エネルギーが最小化された N-アセチルグルコサミン四糖は、修正されたドッキングパラメーター設定 (操作数 = 1,600,000 および集団サイズ = 1000、他のパラメーターにはデフォルト設定が使用されました) に従って、定義された結合部位にドッキングされました。最も可能性の高い方向と最も有利な自由エネルギー位置が分析されました。

Ｃ末端Ｈｉｓタグと融合したＡｂＰｇａＢ１の過剰発現を可能にするプラスミドを有するＡ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ１５１５１の単一コロニーをＬＢ培地に接種した。一晩培養したものを、1:100 (v/v) の比率で 1 L の新鮮な LB 培地に希釈しました。 AbPgaB1 発現は、培養物の A600 が 0.7 に達したときに 0.5 mM IPTG を添加することによって誘導されました。 12 時間のインキュベーション後、細胞を回収し、高圧ホモジナイザー (Nanolyzer) を使用して破砕し、標準手順に従ってニッケルチャージアフィニティー樹脂 (GE Healthcare) でさらに精製するために全タンパク質を得ました。精製されたタンパク質は、Amicon Ultra 遠心フィルターを使用して濃縮され、その濃度はブラッドフォードアッセイに基づいて定量されました。精製されたタンパク質は、12% アクリルアミドゲル (Tools、HR 勾配ゲル、TFU-GG420) 上の SDS-PAGE によって分離されました。

以前の研究で、我々は、A. バウマンニ SK17 株由来のエキソ多糖の主成分が部分的に脱アセチル化された PNAG (dPNAG) であり、これが AbPgaB1 の基質として抽出されたことを示しました。 AbPgaB1 の脱 N-アセチル化活性は、ニンヒドリンアッセイによって実施されました 55。簡単に説明すると、脱 N-アセチル化反応混合物には、50 mM NaCl、10 μM CoCl2、および 50 mM HEPES 緩衝液 (pH 7.5) で調製された 0 ～ 4.0 mg の抽出 PNAG/mL が含まれていました。 AbPgaB1またはその誘導体の添加により反応(最終反応量100μL)を開始した。 37℃で1時間インキュベートした後、100℃で10分間インキュベートして反応を停止させた。着色は、50 μL の上清を 25 μL のニンヒドリン (Sigma) と 100 °C で 10 分間インキュベートすることによって達成されました。混合物を125μLの95%エタノールを加えて希釈し、570nmでの吸光度を測定し、続いてグルコサミン標準曲線と比較することによって遊離アミン(脱N-アセチル化グルコサミン)の量を検出した。

一晩培養物を１％グルコースを含むＬＢ培地で希釈して、０．０５の初期ＯＤ６００を得た。 180 rpmで振とうしながら30℃で12時間インキュベートした後、得られたバイオフィルムを水で3回洗浄しました。バイオフィルム形成を定量化するために、ポリプロピレン製 96 ウェルプレートのウェルに付着したバイオフィルムをクリスタルバイオレット (CV) で 20 分間染色し、水で 3 回洗浄し、95% エタノールで 10 分間可溶化し、595 での吸光度を測定しました。 nmが決定されました。走査電子顕微鏡 (SEM) 観察のために、同じ条件下でカバースリップ上に形成されたバイオフィルムを 2.5% ホルムアルデヒド/4% グルタルアルデヒド溶液で固定し、その後脱水しました。

A. baumannii 株の一晩培養物を、600 nm での初期光学密度 0.005 の新鮮な Mueller-Hinton ブロスで希釈しました。抗生物質は、Ab 株に投与するために段階的に希釈されました。段階希釈した抗生物質を接種した細胞を 37 °C で 16 時間インキュベートしました。インキュベーション後、試験した培養物の 600 nm での光学密度をマイクロプレートリーダーで測定しました。 MIC 測定の数回の継代中に、一晩 (16 ～ 20 時間) 培養した Ab 株を LB 培地に 1:1000 の比率で二次移入しました。この試験では、標準対照として緑膿菌 ATCC 27,853 の MIC 検出を実行しました。

A. baumannii ATCC15151 およびその AbpgaB1/AbpgaB2 媒介変異株の最小バイオフィルム除去濃度は、プロトコル 56 によって決定されました。簡単に言うと、一晩培養物をミューラー・ヒントンブロスでOD600 0.005まで希釈しました。各株を、各ウェルにペグ蓋を配置した96ウェルプレートで培養した。 24時間のインキュベーション後、各菌株のバイオフィルムを有するペグ蓋を、2倍希釈した抗菌溶液を含むミューラー・ヒントンブロスを含む96ウェルプレートに移した。次にプレートを 24 時間インキュベートして抗生物質で刺激しました。次に、ペグ蓋を、新鮮なミュラー・ヒントンブロスの入った新しい 96 ウェルプレートに置きました。試験した各菌株のバイオフィルムに埋め込まれた細菌細胞は、1 分間の超音波処理後に新鮮な培地に放出されます。 96 ウェルプレートをさらに 24 時間インキュベートし、目に見える増殖を妨げた抗生物質の最低濃度を MBEC として定義しました。

A. バウマンニを殺菌剤コリスチンまたは静菌剤テトラサイクリンで処理した場合の生存細胞を調査するために、A. バウマンニ株の第 3 世代培養物を OD600 0.1 (107 CFU/mL) および OD600 0.01 (106 CFU/mL) に希釈しました。それぞれコリスチンおよびテトラサイクリン投与用。用量依存性コリスチン死滅アッセイのために、Ab 株の培養物を 16.0、32.0、または 64.0 μg/mL のコリスチンで 1 時間処理しました。テトラサイクリンの場合、用量依存性殺傷アッセイは、4.0、8.0、または 16.0 μg/mL のテトラサイクリンを使用して実行されました。 1時間の処理後、培養物を10倍段階希釈し、LB寒天プレート上に2μLスポットし、さらに37℃で一晩インキュベートしました。時間依存性殺傷アッセイは、32.0 μg/mL のコリスチンまたは 8.0 μg/mL のテトラサイクリンを 4 時間投与して実行されました。抗生物質刺激中、培養物を0、2、および4時間の時点で10倍連続希釈し、LB寒天プレート上にスポットして一晩インキュベートした。

コリスチン耐性細胞をヘテロ耐性細胞から区別するために、増殖曲線決定のために第3世代のAb株をMHBによってOD600 0.05に希釈した。接種したA.バウマンニ細胞を37℃で振盪しながら2時間インキュベートし、その後16.0μg/mLのコリスチンまたはテトラサイクリンを投与してさらに25時間インキュベートした。抗生物質を使用しない増殖条件を対照として決定した。各 Ab 培養物の 600 nm での光学密度を、27 時間のインキュベーション中のいくつかの時点で検出しました。

この研究で同定されたリンタンパク質およびリンペプチドの詳細なリストは、表S2として提供されました。 MS プロテオミクスおよびリンプロテオミクスの生データは、PRIDE パートナーリポジトリを介して、それぞれデータセット識別子 PXD010140 および PXD010172 で ProteomeXchange コンソーシアムに寄託されました。この研究中に生成または分析されたすべてのデータは、この原稿とその補足情報ファイルに含まれています。

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このプロジェクトに最初に取り組んでいただいた Yun-Ting Tseng 氏と Chia-Yu Chen 氏に感謝します。中央研究院生物医科学研究所の SEM 技術のご支援に感謝いたします。

科学技術省 (MOST 110-2320-B-039-058) からの財政的支援、および中国医科大学 (CMU110-MF-98; CMU110-N-31) からの資金援助に感謝します。

中国医科大学生物医科学大学院大学、台中、404333、台湾

シュー・ジュン・ライ

中国医科大学癌生物学研究センター、台中、404333、台湾

シュー・ジュン・ライ

中央研究院生物化学研究所、台北、11529、台湾

イ・ファン・トゥ & シーシュン・ウー

国立中興大学分子生物学研究所、台中、台湾

ツェン・ティエンシェン

分子生理学研究所、深セン湾研究所、深セン、518132、中国

ツァイ・ユーシュアン

国立台湾大学化学科、台北市、106、台湾

ウー・シーシュン

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SJL と SHW が研究を発案し、指揮しました。 SJL は、A. baumannii プロテオームおよびリンプロテオームの研究を設計しました。 SJL と IFT は A. baumannii 変異株を構築しました。 IFT と TST はモデリング構造解析を設計および計算しました。 YHTの計算とNMRデータの分析。 SJL は、他のすべての実験 (配列分析、タンパク質の発現と精製、活性アッセイ、バイオフィルム定量、MIC 測定、抗生物質死滅アッセイ、増殖試験など) を設計し、実施しました。図と原稿は SJL によって作成され、著者全員が最終原稿をレビューして承認しました。

Shu-Jung Lai または Shih-Hsiung Wu との通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

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転載と許可

ライ、SJ.、トゥー、IF.、ツェン、TS. 他。ポリ-β-1,6-N-アセチル-グルコサミンデアセチラーゼの欠損は、A. バウマニをバイオフィルム非依存性コリスチン耐性細胞に変換するきっかけとなります。 Sci Rep 13、2800 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-30065-5

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受信日: 2022 年 11 月 2 日

受理日: 2023 年 2 月 15 日

公開日: 2023 年 2 月 16 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-30065-5

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