コエンザイム A 結合部位はタンパク質ファミリー全体で近位アシル化を誘導します

Scientific Reports volume 13、記事番号: 5029 (2023) この記事を引用

1579 アクセス

37 オルトメトリック

メトリクスの詳細

アセチル化やサクシニル化などのリジン Nɛ アシル化は、タンパク質の機能を調節する翻訳後修飾です。ミトコンドリアでは、リジンのアシル化は主に非酵素的であり、プロテオームの特定のサブセットのみがアシル化されます。コエンザイム A (CoA) はチオエステル結合を介してアシル基キャリアとして作用しますが、ミトコンドリアのリジンのアシル化を制御するものはまだよくわかっていません。公開されているデータセットを使用して、CoA 結合部位を持つタンパク質はアセチル化、スクシニル化、グルタリル化される可能性が高いことを発見しました。計算モデリングを使用して、CoA 結合ポケット近くのリジン残基が、遠く離れたものと比較して高度にアシル化されていることを示します。我々は、アシル-CoA結合が近くのリジン残基のアシル化を促進すると仮説を立てました。この仮説を検証するために、CoA 結合ミトコンドリアタンパク質であるエノイル CoA ヒドラターゼ短鎖 1 (ECHS1) をスクシニル CoA および CoA と共インキュベートしました。質量分析を使用して、スクシニル-CoA が広範なリジンのサクシニル化を誘導し、CoA が ECHS1 のサクシニル化を競合的に阻害することを発見しました。特定のリジン部位における CoA 誘発阻害は、そのリジンと CoA 結合ポケットの間の距離と反比例しました。我々の研究は、CoAがCoA結合ポケットに結合することによってECHS1サクシニル化の競合的阻害剤として作用することを示した。総合すると、これは、CoA 結合部位の近位アシル化がミトコンドリアにおけるリジンアシル化の主要な機構であることを示唆しています。

アセチル化、スクシニル化、グルタリル化などのリジンのアシル化は、すべての生命界およびすべての細胞コンパートメントにわたるタンパク質の作用を阻害する翻訳後修飾 (PTM)1、2、3 です。真核細胞では、ヒストンのアシル化によりヒストンと DNA の間の静電親和性が減少し、一般に遺伝子発現の増加と関連しています 7。コエンザイム A (CoA) は、脂肪酸やケトン体の生合成、アミノ酸代謝、脂肪酸の酸化、遺伝子発現の制御など、さまざまな代謝プロセスに必要な代謝産物です 8,9。真核生物では、アセチル-CoA、スクシニル-CoA、グルタリル-CoAなどのCoAチオエステルが唯一の細胞アシル基供与体として作用し、(1) p30010などのアセチルトランスフェラーゼ酵素によって媒介される酵素転移、１１、および（２）アシル－ＣｏＡ種の高い局所濃度および高いｐＨ５、１２によって促進される非酵素的機構。細胞質ゾルおよび核では、リジンのアシル化は主に p300 などのアシルトランスフェラーゼ酵素によって駆動され、示差的なアシル化のパターンはこれらの酵素の特異性と分布に起因すると考えられています。しかし、ミトコンドリアマトリックスでは、普遍的なアシルトランスフェラーゼ酵素は同定されておらず、ミトコンドリアのアシル化はほとんどが非酵素的であると考えられています 13,14。ただし、ミトコンドリア内のアシル化リジンの分布は確率論的ではなく、部位間でアシル化に桁違いの違いが見られます 14。なぜ一部のミトコンドリアのリジン残基が他の残基よりもアシル化されやすいのかは、依然として重要な未解決の疑問です。

ミトコンドリアの代謝は、TCA サイクル (アセチル CoA、スクシニル CoA)、脂肪酸酸化 (アセチル CoA、プロパノイル CoA、長鎖アシル CoA) などの重要な経路の重要な中間体として機能する複数のアシル CoA 種に依存します。 CoA）、ケトン体異化（3-ヒドロキシメチルグルタリル-CoA、アセトアセチル-CoA）、アミノ酸異化（スクシニル-CoA、グルタリル-CoA、HMG-CoA）。これらの反応性アシル CoA 種は、ミトコンドリアタンパク質の非酵素的アシル化に対するアシル供与体として機能します 15。調節的役割は、非調節的で低化学量論である大部分のリシンアシル化と共存する、リシンアシル化の限られたサブセットについて特定されている 13,14。重要なのは、多くのミトコンドリアタンパク質のリジン残基はアシル化されておらず、その後のマウス肝臓におけるアセチル化化学量論の測定では、非常に広範囲のアセチル化が示されている14。本研究の目的は、ミトコンドリア内の特定のリジン残基のアシル化を制御する分子機構を調査することです。

普遍的なミトコンドリアアシルトランスフェラーゼは同定されていませんが、リジン残基からアシル基を除去するデアシラーゼはよく特徴付けられています。ミトコンドリアでは、ヒトサーチュイン SIRT3、SIRT4、および SIRT5 が主要なリジンデアシラーゼとして同定されています。サーチュインは、NAD を共基質として使用する保存されたタンパク質脱アシラーゼのファミリーです 16,17。 SIRT3 はタンパク質のアセチル化を制御し 18、19、SIRT5 はサクシニル化、マロニル化、グルタリル化などの酸性アシル修飾を制御します 3、20、21、22。 SIRT4 の酵素活性に関してはあまり知られていません。ただし、分岐鎖アシルリジン残基には作用します23。質量分析研究により、複数の種、組織、および細胞内コンパートメントにおける複数のアシル化マークの状況がマッピングされています。ミトコンドリアサーチュインSIRT3およびSIRT5に対するノックアウトマウス系統を用いたミトコンドリアタンパク質アシル化のプロテオミクス調査により、タンパク質のアセチル化、サクシニル化、およびグルタリル化の部位が同定された。ミトコンドリアサーチュインノックアウトマウスは表現型が正常であるため、細胞株や組織におけるアシル化リジンの高品質なプロテオームマップを作成するために使用されています 1、2、24。核内の遺伝子制御においてヒストンのアセチル化が重要な役割を果たしているにもかかわらず、細胞アシル化の大部分はミトコンドリア内で起こり、おそらく CoA チオエステルからのアシル基の非酵素的転移を介して起こることがアサイロミクス研究により明らかになりました。 CoA 濃度はミトコンドリア内で 2.2 mM から 5 mM 以上に達することがあり、サイトゾル濃度は 0.02 ～ 0.14 mM と推定されています 28。

興味深いことに、反応性 CoA 種と直接相互作用する酵素を含む代謝経路 (TCA サイクル、脂肪酸酸化、ケトン体異化、アミノ酸異化、ケトン体合成など) ではアシル化が豊富です 5,29,30。多くの場合、実験的に検証された部位は 1 つ以上のアシル CoA 種に結合する酵素上に存在し、CoA 結合部位またはその近くで阻害性アシル化が見られます 2、3、30、31。しかし、CoA結合と酵素リジンアシル化が因果関係があるかどうかは報告されていない。さらに、最近の研究では、ヌクレオチド結合部位付近のアセチル化がわずかに増加していることが示され、ADP 結合ロスマンフォールドモチーフを持つ酵素がアシル CoAs32 に結合する可能性があることが示唆されました。著者らはまた、グルタミン酸デヒドロゲナーゼのヌクレオチド結合部位近くでマロニル CoA によるリジンマロニル化の増加を観察しました 32。これらの研究は、CoA 種との相互作用が CoA 結合タンパク質 (CoABP) のアシル化を特異的に強化することを示唆しています。

ここでは、ミトコンドリアにおけるリジンのアシル化を制御する因子を調査しました。公開されている腺房データセットの計算解析を使用して、ミトコンドリア内で CoABP が非 CoABP よりもアシル化される可能性が約 3 倍高いことを示しました。さらに、我々は考えられるCoA構造立体配座をモデル化し、CoABPではCoA結合ポケットに近いリジン残基がCoA結合ポケットから遠く離れたリジン残基よりもアシル化される可能性が高いことを見出した。私たちは、アシル-CoA結合が近くのリジン残基のアシル化を促進する可能性があると仮説を立て（図1）、この仮説をCoA結合ポケットを持つミトコンドリアタンパク質であるエノイル-CoAヒドラターゼ短鎖1（ECHS1）で検証しました。スクシニル-CoA とのインキュベーションにより、ほとんどの ECHS1 リジン残基の広範なスクシニル化が誘導されました。重要なことに、コハク化はCoAとの同時インキュベーションによって競合的に阻害され、特定のリジン部位でのCoA阻害は、このリジン残基とCoA結合ポケットの間の距離と逆相関していた。この発見は、タンパク質CoA結合部位の近位アシル化がECHS1、そしてより一般的にはミトコンドリアにおけるリジンアシル化の主要な機構であることを示唆している。

コンピューターモデリングと質量分析により、ミトコンドリア内の CoA 結合タンパク質のリジンアシル化のメカニズムが明らかになりました。 (a) この研究における実験的アプローチと検証された仮説の概略図。データベース注釈データを使用したプロテオーム全体の MS アシル化データセットの統計解析と、それに続くアシル化タンパク質の構造モデリングにより、CoA 結合タンパク質の過剰アシル化に関する提案されたメカニズムが生成されました。このメカニズムは、報告されているアシル化タンパク質の in vitro MS 分析によって検証されました。

CoA チオエステルは、哺乳類細胞における主要なアシル基供与体です 9,33 (図 2a)。私たちは、特にCoAチオエステルが高濃度で存在するミトコンドリアでは、CoABPのアシル化マークが豊富であるはずであると仮説を立てました（図1）。 CoA 結合がリジンのアシル化を誘導するかどうかを判断するために、すべてのアシル化リジンのうち CoABP で同定されたアシル化リジンの割合を計算しました。 CoABP のリストは、Uniprot アノテーションデータから生成されました (補足表 1)。注釈付きマウスプロテオームでは、リジン残基の 2.7% が CoABP に属します (547,206 個のうち 14,759 個)。対照的に、マウス肝臓アセチル化データセット全体では 34、アシル化残基の 26.5% がマウス CoABP 由来でした（1,934 個中 512 個）（図 2b）。相対オッズ比 (OR) を計算すると、CoABP 上のリジンは非 CoABP 上のリジンよりもアセチル化される可能性が 12.99 倍高いことがわかりました (OR = 12.99、p = 3.68E−297)。

リジンアシル化は、CoA 結合タンパク質で著しく過剰に表れます。 (a) タンパク質のリジン残基に対するアセチル化、サクシニル化、グルタリル化修飾の図。 (b) 全細胞マウス肝臓アセチロームデータセットで分析された CoA 結合タンパク質上のアセチル化リジンの濃縮を示す表。この濃縮は、データセットが非ミトコンドリアリジンとミトコンドリアリジンに分離された場合にも存在します。有意性はフィッシャーの直接確率検定を使用して計算されました。 (c) ミトコンドリアマウス肝臓データセットを使用した、CoA 結合タンパク質上のアセチル化、スクシニル化、およびグルタリル化リジンの濃縮を示す表。 (b) および (c) については、フィッシャーの直接確率検定を使用して統計的有意性を計算しました。

細胞アシル化の大部分はミトコンドリアで起こる 25,27 ため、ミトコンドリアタンパク質と非ミトコンドリアタンパク質に由来するリジンを比較しました（図 2b）。 CoABP で注釈が付けられたリジンは、ミトコンドリアタンパク質と非ミトコンドリアタンパク質の全リジンのそれぞれ 14.7% と 2.1% を占めていました。上記で参照したマウス肝臓全体のデータセットでは、ミトコンドリアのアセチル化リジンの 39.0% (1088 個中 424 個) と非ミトコンドリアのリジンの 10.4% (846 個中 88 個) が CoABP に属していました (図 2b)。 CoABP 上のリジンは、ミトコンドリア内では非 CoABP リジンよりもアセチル化される可能性が 3.72 倍高く (OR = 3.72、p = 6.61E−81)、ミトコンドリア外では 5.34 倍高かった (OR = 5.34、p = 1.96E)。 −33) (図2b)。我々は、ヒト Hela 細胞の全細胞アセチル化データセットでも、レベルは低いものの、同様の濃縮を観察しました 35。 Hela細胞では、CoABP上のリジンは非CoABPリジンよりもアセチル化される可能性が1.92高かった（OR = 1.92、p = 3.61E−61、補足図S1）。

細胞のアシル化部位のほとんどはミトコンドリアに存在するため、ミトコンドリア抽出物からの非シロミックデータセットを使用して、ミトコンドリアタンパク質に関する残りの研究に焦点を当てました。同じアプローチを使用して、3 つの別々の腺房データセットから、他のタイプのアシル化がミトコンドリア CoABP に富んでいるかどうかを決定しました。アセチル化1、サクシニル化30、およびグルタリル化3を含むミトコンドリアのリジンアシル化（図2a）は、これらの修飾を除去する対応するサーチュインデアシラーゼを欠くノックアウト株マウス組織サンプルでマッピングされています。ミトコンドリアタンパク質の中で、CoABP のリジン残基は全リジンの 10.1% (24,973 個中 2513 個) を占めていました。対照的に、CoABP 内のアセチル化リジンは、すべてのアセチル化リジンの 29.0% を占めていました (1788 個中 519 個、図 2c)。同様に、マウス肝臓ミトコンドリアサンプルでは、CoABP 中のコハク化およびグルタリル化リジンは、それぞれ、すべてのコハク化またはグルタリル化タンパク質の 34.5% (812 個中 280 個) および 37.2% (549 個中 204 個) を占めていました。 (図2c)。これらのミトコンドリアデータセットでは、CoABP 上のリジンは、非 CoABP 上のリジンに比べて、アセチル化、コハク酸化、またはグルタリル化される可能性が 3.66、4.70、および 5.28 倍高かった (OR = 3.66、p = 1.48E−100; OR = 4.70、p = 3.98E−75; OR = 5.28、p = 4.74E−62、それぞれ)。したがって、ミトコンドリアでは、CoABP のリジン残基は非 CoABP のリジン残基よりもアシル化される可能性が大幅に高くなります。

次に、CoA結合自体がリジンのアシル化を引き起こし、その結果、CoA結合部位近くのリジンがCoA結合部位から遠位のリジンよりも高い確率でアシル化されるのではないかという仮説を立てました（図1）。この仮説を検証するために、CoA 結合タンパク質の結晶構造と、構造的に定義された部位での CoA 結合の計算モデリングを使用して、近位リジンがアシル化に富んでいるかどうかを判定しました。

CoA分子内では、アシル基は、9個の回転可変単結合と2個の立体配座可変ペプチド結合を有する約15Åの補欠分子族によって、コアのホスホADP部分に結合したチオール基に結合しています（図3a）。この大きくて柔軟な分子の末端アシル基は、コアのホスホ ADP 部分に対して複数の位置をとることができ、リジン残基とタンパク質に結合したアシル CoA チオエステルのアシル基との間の物理的距離の計算は直線的ではありません。フォワード。多くのタンパク質活性部位に結合したCoAの結晶構造が得られており、この情報を利用して、立体的に有効なCoA立体構造の約2000モデルのアンサンブルを計算しました（図3a、補足コードテキスト）。これらのモデルは、末端 CoA 硫黄位置の可能な限り最大の広がりを達成するために選択されました。 AMP は CoA 分子の中で構造的に最も硬いサブセクションであるため、AMP 部分をターゲットとして使用し、各タンパク質モデルに対して立体的に適合する CoA アンサンブル構造のサブセットを使用して、この構造アンサンブルを CoABP の相同性モデルに合わせました (図.3a)。各タンパク質の立体的に有効な CoA 立体構造のアンサンブルは、一連のチオール硫黄位置を記述し、それがアシル化される可能性のある各リジン残基のアミン基までの一連の距離を定義します。分析された各 CoABP について、当てはめられた CoA 立体構造アンサンブルからの各リジン残基間の最小距離が計算されました。 (図3a)。

CoA 立体配座の構造モデリングにより、CoA 結合部位付近の近位の過剰アシル化が明らかになりました。 (a) タンパク質 CoA 結合ポケット内のリジン残基と CoA のチオール基の間の最小距離を計算するために使用される計算アプローチの概略図。物理的に妥当な CoA 立体構造の立体構造アンサンブルは、ホスホ ADP 部分の後の CoA 結晶構造から実験的に観察された結合回転角を組み合わせることによって作成されました。腺房データセットからの CoA 結合タンパク質の完全な構造モデルは、Swissmodel を使用して生成されました。 CoA アンサンブルを各タンパク質モデルにドッキングして、立体的にアクセス可能な CoA チオール位置のセットを生成し、モデル化された各リジン残基のアミン-チオール距離をスコア化するために使用されました。 (b) CoA結合タンパク質に見られる非アシル化リジン残基およびアシル化リジン残基の数を示す表。アシル化されている CoA 到達可能なリジン (最も近い CoA アンサンブル硫黄から < 5 Å) 対より遠位のリジン残基の相対オッズ比を、アセチル化、サクシニル化、およびグルタリル化のそれぞれについて計算しました。結果の有意性は、フィッシャーの直接確率検定を使用して計算されました。 (c) CoA アンサンブルからのリジンの距離の関数としての、CoA 結合タンパク質リジンのリジンアシル化の相対確率。データはアセチル化、スクシニル化、およびグルタリル化について示されています。

結合部位の近接性のカットオフとしてリジンアミンと CoA 硫黄の間の距離 5 Å を使用し、アシル化の観察をオッズ比として再度モデル化しました。この距離は、制限された CoA 硫黄位置のサンプリング密度と、リジンアミン原子へのファンデルワールスオーバーラップによる CoA 硫黄位置の拒否を補償するために経験的に選択されました 36。アセチル化、スクシニル化、およびグルタリル化されている CoA 到達可能リシンの OR 値は、それぞれ 1.73、2.62、および 3.03 であり、アシル化オッズ増加はすべて有意でした (図 3b)。 CoA アンサンブルの所定の距離内にあるすべてのモデル化された CoABP リジンの累積分率をプロットすることにより、CoA 結合部位に近いリジンは、遠く離れたリジンよりもアセチル化、コハク酸化、およびグルタリル化される可能性が 2 ～ 3 倍高いことが観察されました (図.3c）。距離が増加するにつれて、アシル化の確率はバックグラウンドレベルまで減少しました（図3c）。これらの結果は、我々の仮説を検証し、CoA 結合部位付近でリジンのアシル化が大幅に増加していることを示しました。

次に、CoA 結合部位付近のアシル化の増加が CoA に特異的であることを確認したいと考えました。 CoAは、関連分子（ADP、ATP、NAD、NADPなど）とコアADP部分を共有しています（図4a）。ただし、CoA 合成の最終ステップでは、CoA に特有の位置のリボース基にリン酸が付加され、これらの関連分子が使用する結合部位から CoA が立体的に排除される可能性があります。 3'-リン酸 CoA 分子は通常、高度に正に帯電した結合部位に結合するため、タンパク質配列にリジンまたはアルギニン残基のいずれかが必要となり、CoA 結合部位付近のリジンが統計的に濃縮されます 37,38。関連する分子は CoA と同様のサイズと多価の負電荷を持っているため、それらの結合部位も正電荷を帯びたアミノ酸に依存します。 CoA結合部位近くのアシル化の増加を考慮すると（図3b、c）、局所的な電荷効果が非特異的CoA結合とその後のアシル化を促進する可能性があります。この可能性を排除するために、NAD / NADP結合部位近くのアシル化とCoA結合部位を比較し、局所電荷効果が局所アシル化を駆動するのに十分であるかどうかを判断しました（図4b、c）。我々は、CoA と同じプロトコールと、NAD[P] 結合タンパク質上のリジンの結合部位近接性を決定するためのベースとして共有 ADP 部分を使用して、NAD[P] 部位に対する CoA の立体的アクセス性をモデル化しました。再び密接な結合のカットオフとして5Åを使用すると、グルタリル化リシンは実際には「CoAに到達可能」ではなかったため、NAD[P]結合タンパク質のCoAに到達可能なリジンのグルタリル化の確率が高くなることは観察されませんでした（図4b）。 CoABPとは異なり、リジンがCoA結合部位に近づくにつれてアシル化の確率が大幅に増加しましたが、NADおよびNADP結合部位に近いリジンではアシル化の有意な変化は観察されませんでした（図4b、c）。したがって、CoA 結合部位付近のアシル化の富化は CoA 結合部位に特異的であり、より一般化可能な電荷効果では説明できません。

近位の過剰アシル化は CoA 結合部位に特異的です。 (a) CoA と ADP、ATP、NAD、および NADP の間の構造的類似性の図。 CoA は、ATP、NAD、および NADP とコア ADP 部分を共有していますが、追加された 3' ホスホリル基により、これらの種の結合部位に適合することが妨げられる可能性があります。 (b) CoA結合タンパク質およびNAD[P]結合タンパク質によってグルタリル化されるCoA到達可能リシンの相対オッズ比を比較する表。 (c) [アシル-]CoA、NAD、および NADP 結合部位に組み込まれた CoA アンサンブルからのリジンの距離の関数としてのリジンアシル化の相対確率。NAD および NADP 結合部位付近でのアシル化の濃縮の欠如を示します。

我々の観察を説明する可能性の高いメカニズムは、アシル-CoA が CoA 結合部位を占有し、直接または中間体として近くのシステイン残基を使用して、そのアシル基を近くのリジン残基に転移させるというものです 39。このモデルと一致して、CoABP をアセチル CoA またはスクシニル CoA とインキュベートすると、数時間後に検出可能な過剰アセチル化が生じます 12。この仮説が正しい場合、(1) CoA 結合部位近くのリジン残基はより速い速度でアシル化されるはずであり、(2) アシル化は過剰な非アシル化 CoA によって競合的に阻害されるはずであると予想できます (図 5a)。。

スクシニル-CoAによるECHS1のインビトロでのサクシニル化は、CoAによって競合的に阻害される(a) スクシニル-CoA(Su-CoA)によるECHS1のサクシニル化とCoAによる阻害の概略図。 (b) ネイティブゲル電気泳動を使用したヒト組換え ECHS1 のウェスタンブロット。（ c ）CoAの存在下および非存在下でSu-CoAとさまざまな時間（5、15、および45分、および2時間）共インキュベートしたECHS1およびBSAにおけるスクシニルリジン（SuK）レベルのウェスタンブロット検出。 (d) ECHS1 上の個々のリジン残基から CoA までの距離。（ e ）ECHS1上の個々のリシンのサクシニル化レベルの変化を測定する質量分析時間経過実験。 ECHS1を400μM Su-CoAと0、5、15または45分間、および0、1または10 mM CoAと共インキュベートしました。各残基の SuK レベルの豊富さを ECHS1 陰性対照 (CoA または Su-CoA で処理されていない) に対して正規化しました (処理あたり N = 4)。 *P < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.001、****P < 0.0001; ns、重要ではありません。一元配置分散分析を実行しました。 CoAで治療しなかった条件では、各時点を0分のグループと比較しました。 45 分間の条件で、両方の CoA 処理グループ (1 および 10 mM) を CoA で処理しなかったグループと比較しました。

我々は、大腸菌から精製した組換えエノイル CoA ヒドラターゼ、短鎖 1 (ECHS1) を使用して、この仮説を検証しようとしました。 ECHS1 は 30.6 kDa のミトコンドリア CoABP です。 ECHS1はホモ六量体を形成しており、ネイティブゲル電気泳動により、精製されたECHS1が高度に多量体化した状態で存在することが確認されました（図5b）。内因性アセチル化は細菌発現タンパク質で頻繁に発生するため 40、ほとんどの実験ではモデルアシル CoA としてスクシニル CoA を使用しました。 ECHS1 をスクシニル CoA (400 μM) とインキュベートし、インキュベーション時間の増加 (5、15、45、および 120 分) が ECHS1 のスクシニル化にどのような影響を与えるかを測定しました。ウシ血清アルブミン (BSA) を非 CoABP コントロールとして使用しました。ウェスタンブロットの結果は、スクシニル-CoAのインキュベーションによって誘導されるスクシニル化レベルが、両方のタンパク質において時間依存的に増加することを示した(図5c)。重要なことに、25 モル過剰の CoA (10 mM) との共インキュベーションは ECHS1 のサクシニル化を強く阻害しましたが、BSA のサクシニル化は阻害しませんでした。これは、スクシニル-CoAによるスクシニル化がECHS1 CoA結合ポケットとの相互作用に部分的に依存し、CoA阻害がCoABPに特異的であることを示唆しています（図5a）。

異なってスクシニル化されたリジン部位を詳細に特徴付けるために、ECHS1 のスクシニル化を、タンパク質ゲル精製およびゲル内トリプシン消化後の液体クロマトグラフィー、データ依存性取得タンデム質量分析法 (LC-DDAMS/MS) によって分析しました。 ECHS1内の24個のリジン残基のうち10個（図5d）が、スクシニル-CoAとインキュベートすることによってスクシニル化されたことが観察されました。同じジスクシニル化ペプチド内の K284 と K288 は区別できないことに注意してください。ウェスタンブロットの結果と一致して、スクシニル-CoA インキュベーションによって誘導されるサクシニル化のレベルは、これらのリジン残基 (K282、K284/K288、K43、K204、K234、K273、K127、K261、K118) のそれぞれで一度に増加しました。 0、5、15、および45分での依存性様式（図5e）。さらに、ECHS1 のサクシニル化は、これらのリジン残基で CoA によって阻害されました。したがって、ECHS1 上の個々のリジン残基のスクシニル化は、CoA によって濃度依存的に阻害されました。

CoA 阻害に対する個々のリジン残基の感受性を決定するために、組換え ECHS1 をスクシニル CoA (400 μM) および増加する濃度の CoA (0 ～ 10 mM) とインキュベートしました。タンパク質の消化と LC-MS/MS 分析の後、7 つのリジン残基 (K282、K284/K288、K43、K204、K234、および K118) について堅牢な MS データを取得しました。重要なことに、コハク化はCoA濃度の増加によって競合的に阻害され(図6a)、これらの阻害曲線のそれぞれのIC50は331〜1924μMの範囲でした。次に、各スクシニル化リジン残基について、CoA 誘発阻害が CoA 結合ポケットまでの距離によって影響を受けるかどうかを調べました。 CoA結合ポケットまでのリジンの距離は、ECHS結晶構造（PDB ID：2HW5）を使用し、CoAの立体的にアクセス可能な立体構造のセットを計算することにより、上記と同じ方法で計算されました（図3a）。 CoA 結合ポケットからのリジンの距離を IC50 値でプロットし、線形回帰分析を実行しました。 CoA結合ポケットからのリジンの距離と各残基のIC50との間に正の関係があることを観察しました（R2 = 0.8235）（図6b）。これは、CoA 結合ポケットに近いリジンは、遠くにあるリジンよりも CoA 阻害に対してより感受性が高いことを示しました。まとめると、これらの実験は、ECHS1 CoA 結合ポケット付近のリジンのコハク化がアシル CoA 結合によって媒介され、CoA による競合阻害を受けることを示しています (図 1)。

特定のリジン部位での CoA 阻害は、CoA 結合ポケットまでの距離と逆相関します。 (a) ECHS1 上の個々のリジン残基のサクシニル化を阻害する CoA の阻害曲線および残基ごとの IC50。 ECHS1 をスクシニル CoA および増加する濃度の CoA とともにインキュベートしました。用量反応曲線は、CoA 濃度と SuK 阻害の対数として表されました。各残基の阻害パーセントは、ECHS1をCoA処理の存在下および非存在下で45分間スクシニル-CoAと共インキュベートしたときのサクシニル化レベル間のパーセント変化を測定することによって計算した。治療ごとに N = 4。 (b) リジン残基の距離と IC50 (μM) の相関関係を示すプロット (N = 5、R2 = 0.8235)。 MS 分析では、K284 と K288 のスクシニル化レベルは、両方の残基がトリプシン処理後の共有ペプチド上に排他的に見つかったため、組み合わされました。結果として、これらのサイトは R2 値または傾向線の生成には使用されず、グラフに赤い点として含まれています。

このサクシニル化実験に加えて、アセチル-CoAおよびCoAとインキュベートした組換えECHS1タンパク質を使用して同様のアセチル化実験を実施しました。内因性アセチル化は細菌で発現したタンパク質で起こるため 40、CoA 結合ポケット近くの 3 つのリジン部位でのアセチル化のみを分析しました。同様に、MS 分析の結果は、アセチル CoA インキュベーションによって誘導される ECHS1 の CoA 結合ポケット (K282、K284、および K204) 付近のリジン残基のアセチル化が、25 モル過剰の CoA によって阻害されることを示しました (図 7)。これらの結果は、CoA が複数の異なるアシル化種の CoA 結合ポケット付近のアシル CoA 誘導性リシンアシル化をより一般的に阻害することを示唆しています。

インビトロでの ECHS1 のアセチル CoA によるアセチル化は、CoA 結合部位の近位のリシンで CoA によって競合的に阻害されます。 (a) 細菌で産生された組換え ECHS1 の 3 つの部位のアセチル化は、アセチル CoA の添加後に in vitro で増加し、これらの部位は CoA 結合部位の近くで見られます。外因性アセチル CoA を介したこのアセチル化は、モル過剰の CoA を添加することによって阻害されます。

インビトロ実験によって検証された計算モデリングを使用して、我々は、CoABP の活性部位近くでアシル化が豊富であることを示しました。特に、我々の結果は次のことを示しています: (1) CoABP は、特にミトコンドリアでアシル化される可能性が大幅に高い、(2) CoA 結合部位に物理的に近いリジンは、遠くにあるリジンよりもアシル化される可能性が高い、(3) -CoABPのインビトロアシル化はアシル-CoA結合に依存し、(4)CoA結合部位近くのリジンは遠位のリジンよりも阻害に対して感受性が高い。この研究は、タンパク質CoA結合部位の近位アシル化がミトコンドリアにおけるリジンアシル化の主要な機構であることを示唆している。

リン酸化、アシル化、グリコシル化などのタンパク質修飾反応は、通常、反応遷移状態を安定化し、修飾タンパク質と低分子前駆体を結び付ける専用のトランスフェラーゼ酵素によって実行されます41、42、43。結合部位媒介の近位アシル化の場合、反応では CoA のあらかじめ形成された結合部位が使用されます (標準的な酵素触媒と同様) が、特異的な遷移部位の安定化は行われません (非酵素反応と同様)。 CoA媒介の近位アシル化は酵素反応と非酵素反応の両方の特徴を持ち、化学的に選択的かつ立体的に拘束された方法で関連する副反応のクラスを強化する「半酵素的」反応機構として認定される可能性がある。これらの半酵素反応は、細胞代謝の調節において重要な役割を果たす可能性があります。特に、CoA 結合結合部位には、負に荷電した CoA の結合に重要な役割を果たすリジン残基が含まれることが多く、我々のグループや他の研究者らによる過去の研究では、これらの残基が生体内でアシル化され、アシル化を模倣する変異により酵素機能が低下することが示されています 30,44 。半酵素的アシル化は、CoA結合酵素が自己アシル化を介して時間の経過とともに自己阻害するメカニズムを提供する可能性があり、その速度は裸のCoA対アシルCoAの局所レベルに敏感です。半酵素的アシル化がタンパク質の機能を調節し、代謝プロセスにどの程度寄与するかは、今後の研究で取り組む興味深い問題となるでしょう。

CoA チオエステルは、(1) プロテオーム全体のさまざまな結合部位を占有することができる共通の結合部分と、(2) アシルペイロードを近くの共通の化学基に移動させる反応性の高い末端結合の両方を共有します。これら 2 つの要因により、プロテオーム全体にわたって多数の検出可能な PTM が生成され、上記のコンピューター分析が可能になります。ただし、他の反応性代謝産物も、タンパク質の数は少ないものの、同じ挙動を示す可能性があります。 1,3-ビスホスホグリセレート 45 などの他の PTM 生成反応は、PTM 前駆体代謝物の結合部位付近で同様の速度上昇パターンを示します。他の反応性代謝産物に対して得られた一連の PTM は、プロテオミクス LC-MS/MS ベースの検出および分析には十分に普及していない可能性がありますが、より焦点を絞った技術では、より広範囲の代謝酵素が触媒する反応の副作用として、より広範囲の代謝酵素の阻害が発見される可能性があります。私たちは、ここで使用された計算と実験のアプローチの組み合わせにより、アシル化の分野における新しいメカニズムが明らかになったと信じており、それが反応性代謝産物または薬物によって誘導される他のPTMのメカニズムも明らかにすることを期待しています。

2020 年に、James らは私たちの観察と同様に、ADP 結合ロスマンフォールドを組み込んだ酵素が自動アシル化に関与していることを報告しました 32。特に、NADおよびATP結合酵素グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（GDH）による自動マロニル化が、（1）モル過剰の裸のCoAによって阻害され、（2）GDHのヌクレオチド結合部位に近いリジン残基ではより強く阻害されることを示した。彼らは、構造的にモデル化されたCoAアンサンブルではなく直線距離関数を使用して、平均して、酵素表面のヌクレオチド結合部位近くのリジン残基のアセチル化化学量論が若干高いことも発見した。私たちの研究は、彼らの発見の妥当性を確認し、拡張しました。まず、複数のアシル化サブタイプを並行して検討することにより、アセチル化よりもグルタリル化やサクシニル化などの多価酸性修飾の濃縮が増加することが観察されました。これらの多価修飾では、より高いリシンアシル化率が以前に報告されていますが 15 、我々の研究は、この効果が局所的なタンパク質構造、特に CoA 結合ポケットの周囲によってさらに増幅されることを示しています。第二に、James et al。は、GDH の NAD 結合部位による自動マロニル化を報告しましたが、プロテオーム全体のレベルではこの効果は観察されませんでした。彼らは、NAD が裸の CoA と比較して、ミトコンドリアタンパク質抽出物における自己アシル化の阻害剤として劣っていること、および他の ADP 誘導体は NAD[P][H] と裸の CoA の中間的な効果があることを示しました。 NAD結合部位の一部のサブセットはアシルCoA種による自動アシル化のために効率的にCoAに結合するが、他の多くは結合しないのではないかと我々は考えている。したがって、GDH の抑制的アシル化傾向は、NAD 結合酵素の中で異常値である可能性があります。対照的に、標準機能のために CoA に結合できるすべてのタンパク質はある程度の自動アシル化を示すはずですが、構造の結果としての酵素間の速度の違いをよりよく理解するにはさらなる研究が必要です。

最後に、公開されているデータセット内の数百のタンパク質のデータを計算機で分析し、単一の CoA 結合タンパク質を使用して計算モデルを検証することにより、ミトコンドリア CoA 結合タンパク質のアシル化が、CoA 結合ポケットに結合するアシル CoA 種を通じて起こることを示しました。私たちの発見の妥当性を広げるにはさらなる研究が必要ですが、この出版により、アシル化に興味のある研究者が、タンパク質の生化学的および構造的特性が蓄積するさまざまなアシル化に及ぼす影響を定量的に分析できるようになることを願っています。最終的には、より詳細な機構モデルは、これらの PTM が生物学に最も影響を与える代謝条件の特定にも役立つはずです。

以前の MS 研究から公開された補足情報から観察されたペプチドのリストを使用して、UniProt ID を生成しました。タンパク質の酵素活性が何らかのCoA誘導体に関与する場合、リガンドとして注釈が付けられた任意のCoA誘導体を有する場合、または注釈が付けられたCoA誘導体結合部位または活性部位を有する場合、そのタンパク質はCoA結合であるとみなされた。同様の手順を NAD 結合タンパク質および NADP 結合タンパク質に対して実行しました。

CoA または NAD[P] 結合タンパク質ごとに、Swissmodel の対話型モデル構築ツールを使用して相同性モデルを生成しました 46。相同性モデルを持つタンパク質は、アライメントの設定と比較に Python スクリプトを使用して、CoA が結合した実験的に決定された結晶構造セットに対して PyMOL (The PyMOL Molecular Graphics System、バージョン 2.0 Schrödinger, LLC) による構造アライメントを受けました。アシル化タンパク質相同性モデルと構造的に類似した CoA 結合タンパク質の上位ペアを使用して、CoA リン酸原子の 20 Å 以内の CoA 局所タンパク質残基のみを構造アラインメントのターゲットとして使用して、アシル化相同性モデルのコンテキストで CoA 配置を生成しました。

配置後、CoA の塩基リン酸 AMP 部分をアライメントターゲットとして使用して、自己回避型 CoA 立体配座アンサンブルを配置します。各 CoA 確認は、タンパク質モデルと 1 Å3 を超える衝突体積を共有する場合、そこから除外されます。この共有入力 CoA 立体構造アンサンブルは、RCSB47 の既存の CoA リガンド構造からバックボーン二面角を適用して、理想的な CoA リガンド構造を回転させることによって生成されました。個々の立体構造は、実験的に測定された骨格のランダムサンプリングによって生成され、末端チオールがセット内の他のモデルからファンデルワールス半径で硫黄原子 1 個以上離れている場合、2000 個の立体構造が選択されるまで繰り返し最終モデルに受け入れられました。

NAD[P]結合部位については、CoAとNAD[P]の両方に共通する共有AMPコアを使用してCoA立体構造アンサンブルを配置しました。それ以外の場合は、CoA 結合タンパク質の場合と同様にモデリングを実行しました。

構築された CoA アンサンブルを含むすべての相同性モデル上のリジン残基には、各リジンの末端第一級アミン原子の中心から、モデルの立体的に有効な CoA 立体構造のセットのうち最も近いチオール硫黄原子の中心までの距離スコアが割り当てられました。

考慮した各リジンアシル化サブタイプ（アセチル化、スクシニル化、およびグルタリル化）について、対応するプロテオミクス MS 研究で少なくとも 1 つのモデル化されたリジン残基が観察されたすべての相同性モデルからリジン残基を評価しました。これらのアシル化タンパク質の中でアシル化された個々のリジン残基とアシル化されていないリジン残基を上記の距離スコアと組み合わせて使用し、CoA アンサンブルの X オングストローム内でのアシル化の相対濃縮度を計算しました。また、Scipy.stats48 で実装されているフィッシャーの直接確率検定を使用しました。濃縮の統計的有意性を評価するために使用されます。

この研究用に開発されたコードは、https://github.com/ccarrico/CoABindingSiteAnalyses で入手できます。

組換えエノイル CoA ヒドラターゼ短鎖 1 (ECHS1) (0.3 μg/μL) を Novus Biologicals から購入し、さまざまな濃度の CoA (0 ～ 10 mM) を含む 50 mM Tris、pH 8、150 mM NaCl に 37 °C で溶解しました。。反応は、スクシニル-CoA またはアセチル-CoA を 37 °C で添加することによって開始されました。反応は液体窒素中で急速冷凍することによって停止され、処理されるまで-80℃で保存されました。

ECHS1 または BSA の分離には、ポリアクリルアミドゲル (10 ～ 15%) を使用しました。 BioRad ブロッティングシステムを使用して、タンパク質をニトロセルロース膜に転写しました。膜をトリス緩衝生理食塩水（20 mM Tris、150 mM NaCl、0.1% Tween 20、pH 7.4）中の5% BSAでブロックし、抗スクシニルリジン（PTM Biolabs）でプローブし、次にトリス中の牛乳中の二次抗体でプローブしました。 - 緩衝生理食塩水、抗体とインキュベート。化学発光強度は、ChemiDocイメージングシステム(BioRad、カリフォルニア州ハーキュリーズ)を使用して検出した。

MS 実験では、3 μg の ECHS1 を 400 μM スクシニル-CoA と 0、5、15 または 45 分間、および 0、1、または 10 mM CoA (緩衝液: 50 mM Tris、pH 8.0、および 150) と共インキュベートしました。 mM NaCl)。各条件には 4 つの反復が含まれていました。

3 μg の ECHS1 ストックタンパク質を含む各サンプルを、50 mM ジチオスレイトール (DTT) および Laemmli サンプルバッファーサンプルバッファー中で 70 °C で 10 分間インキュベートしました。サンプルは、プレキャスト 4 ～ 12% Bis-Tris スタックゲルで 20 分間泳動されました。翌日、ゲル内消化を実施した。ゲルバンドをさいの目に切ってチューブに集め、脱水緩衝液（５０％アセトニトリルおよび水中の２５ｍＭの重炭酸アンモニウム）で脱水した。ゲルサンプルをスピードバックで乾燥し、10 mM DTTで還元し、撹拌しながら56℃で1時間インキュベートし、次に55 mM ヨードアセトアミドでアルキル化し、暗所で室温で45分間インキュベートしました。角切りにしたゲルを２５ｍＭ重炭酸アンモニウム水溶液で洗浄し、次いで脱水緩衝液で再度脱水した。サンプルを再度スピード真空で乾燥させた後、タンパク質を 250 ng のトリプシン中で 4 ℃で 30 分間インキュベートし、撹拌しながら 37 ℃で一晩消化しました。翌朝、消化物を水にさらし、次に50% アセトニトリルおよび5% ギ酸の水溶液にさらした。溶液を添加するたびに、各サンプルからの水性消化物を新しいチューブに収集しました。これらのプールされたペプチド抽出物をスピード真空で 2 時間乾燥させて乾燥させ、その後 0.2% ギ酸に再懸濁しました。

再懸濁したペプチドサンプルを、C18ディスクを含むZipチップで脱塩し、濃縮し、質量分析「ハイパーリアクションモニタリング」保持時間ペプチド標準(iRT、Biognosys、シュリーレン、スイス)を含む0.2%ギ酸水溶液に再懸濁した。

簡単に説明すると、四重極時間測定器に直接接続された cHiPLC システム (Eksigent) を備えた Eksigent Ultra Plus nano-LC 2D HPLC システム (カリフォルニア州ダブリン) を使用して、逆相 HPLC-ESI-MS/MS によってサンプルを分析しました。 - フライト (QqTOF) TripleTOF 6600 質量分析計 (SCIEX、カリフォルニア州コンコード)。注入後、ペプチド混合物を C18 プレカラムチップ (200 µm × 0.4 mm ChromXP C18-CL チップ、3 µm、120 Å、SCIEX) にロードし、ローディング溶媒 (H2O) で 2 µl/min で 10 分間洗浄しました。 /0.1%ギ酸）脱塩用。続いて、ペプチドを 75 µm × 15 cm ChromXP C18-CL チップ、3 µm、120 Å (SCIEX) に移し、水性溶媒とアセトニトリル溶媒を使用した 2 時間の勾配で流速 300 nL/min で溶出しました。バッファー。

データ依存取得 (スペクトルライブラリ構築用): ペプチドとタンパク質の同定の場合、質量分析計はデータ依存取得 (DDA) モードで操作され、サーベイ MS1 スキャン (250 ミリ秒) から最も豊富な 30 個の前駆体イオンが分離されました。合計サイクルの Analyst 1.7 (ビルド 96) ソフトウェアを使用した、衝突誘起解離タンデム質量分析 (CID-MS/MS、MS/MS あたり 100 ミリ秒、「高感度」プロダクトイオンスキャンモード) の 1 m/z 分解能で記載されているように、時間は 3.3 秒です49。

データ非依存取得: 定量化のために、すべてのペプチドサンプルは、64 個の可変幅分離ウィンドウを使用して、データ非依存取得 (DIA、たとえば SWATH) によって分析されました 50,51。可変ウィンドウ幅は、DIA の「可変ウィンドウ法」アルゴリズムを使用して、特定の m/z 範囲内で観察される典型的な MS1 イオン電流の複雑さに応じて調整されます (「ビジー」m/z 範囲ではより狭いウィンドウが選択され、広いウィンドウが選択されます)溶出前駆体イオンがほとんどない m/z 範囲内)。 DIA 取得により、選択された各 Q1 m/z ウィンドウ内のすべての分析物の複合である複雑な MS/MS スペクトルが生成されます。 3.2 秒の DIA サイクル時間には、250 ミリ秒の前駆体イオンスキャンと、それに続く 64 の可変 SWATH セグメントのそれぞれに対する 45 ミリ秒の蓄積時間が含まれます。

質量分析 DDA は、データベース検索エンジン ProteinPilot (SCIEX 5.0、リビジョン 4769) を使用し、Paragon アルゴリズム (5.0.0.0.4767)52 を使用し、「サクシニル化」の検索に重点を置いて分析されました。これらのデータベース検索エンジンの結果を使用して、Skyline Daily v20.2.1.404 で MS/MS スペクトルライブラリが生成されました。 DIA/SWATH データは相対定量化のために処理され、さまざまな条件からのアシル化ペプチドのピーク面積を比較しました。 DIA/SWATH MS2 データセットの場合、スペクトルライブラリに存在する特定のペプチドと一致する 6 ～ 10 個の MS/MS フラグメントイオン (通常は y イオンと b イオン) の XIC に基づいて定量化されました。有意な変化は 5% FDR で認められました (q 値 < 0.05)。

質量分析の生データは MassIVE リポジトリ (MSV000089448) に保管されており、ProteomeXchange (PXD033787) からも入手できます。この研究用に開発されたコードは、https://github.com/ccarrico/CoABindingSiteAnalyses で入手できます。

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我々は、NIDDK Grant R24 DK085610 (Verdin) を承認し、NCRR 共有計測助成金 1S10 OD016281 (Buck Institute) からの計測のサポートを承認します。さらに、ラリー L ヒルブロム財団の支援に感謝します。原稿と図の編集を手伝ってくれたゲイリー・ハワーズとジョン・キャロルにそれぞれ感謝します。

マリウス・ウォルター

現在の住所：米国ワシントン州シアトル、フレッド・ハッチがんセンター、ワクチン・感染症部門

著者 Chris Carrico と Andrew Cruz も同様に貢献しました。

バック老化研究所、ノバト、カリフォルニア州、94945、米国

クリス・キャリコ、アンドリュー・クルーズ、マリウス・ウォルター、ジェシー・マイヤー、キャメロン・ウェーフリッツ、サマ・シャー、レイ・ウェイ、ビルギット・シリング、エリック・ヴァーディン

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

CC、AC、EV が研究を計画し、データを分析しました。 CC は計算モデリングを実行しました。 CC、ACは分子生物学の実験と分析を実施しました。 JM、CW、SS、LW、BS は質量分析実験と分析を実施しました。 CC、AC、MW、EV は、すべての著者からのフィードバックを得て原稿を執筆しました。 BS と EV は研究を監督し、資金を提供しました。

エリック・ヴァーディンへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

シュプリンガーネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

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転載と許可

Carrico、C.、Cruz、A.、Walter、M. 他。コエンザイム A 結合部位は、タンパク質ファミリー全体で近位アシル化を誘導します。 Sci Rep 13、5029 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-31900-5

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受信日: 2022 年 7 月 28 日

受理日: 2023 年 3 月 20 日

公開日: 2023 年 3 月 28 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-31900-5

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