Cに対する優先的なウサギ抗体反応 - 株式会社コーストワイズ・ベンチャーズ・グループ

Scientific Reports volume 13、記事番号: 9156 (2023) この記事を引用

メトリクスの詳細

ペプチドで免疫したウサギで生成された抗体は、数十年にわたって生物学研究に使用されてきました。このアプローチは広く実施されていますが、複数の理由により、特定のタンパク質を標的とすることが難しい場合があります。マウスで注目された考慮事項の 1 つは、体液性応答が、無傷のタンパク質には存在しないペプチド配列のカルボキシル末端を優先的に標的とする可能性があるということです。ペプチド免疫原の C 末端に対する優先的なウサギ抗体応答の頻度を明らかにするために、ヒト NOTCH3 に対するウサギ抗体の生成に関する経験を紹介します。ヒト NOTCH3 の 10 個のペプチド配列に対して、合計 23 個の抗体が生成されました。これらのポリクローナル抗体の 70% 以上 (23 個中 16 個) が C 末端優先であることが判明しました。NOTCH3 ペプチド反応性抗体は主に免疫ペプチドの末端遊離カルボキシル基を標的としていました。 C末端エピトープを好む抗体は、免疫原構造の遊離カルボキシル基を除去したC末端を伸長した組換え標的配列とは弱く反応するか、まったく反応しませんでした。さらに、これらの抗血清のそれぞれは、免疫原の C 末端の前で切断されたタンパク質に対する抗体反応性を示さなかった。これらの抗ペプチド抗体の免疫細胞化学的応用において、我々は同様に、免疫配列の遊離C末端を発現する細胞に最も良く結合する組換え標的に対する反応性を発見した。まとめると、我々の経験は、ウサギが NOTCH3 由来ペプチドの C 末端エピトープに対して抗体反応を起こす強い傾向を示しており、これにより天然タンパク質に対するウサギの使用が制限されると予測されます。この一般的に利用されている実験パラダイムにおける抗体生成の効率を向上させることができる、このバイアスを克服するためのいくつかの潜在的なアプローチについて説明します。

研究用抗体の開発と応用はタンパク質の研究に不可欠です。研究用抗体の中でも、抗ペプチド抗血清は、主に多数のタンパク質をコードする遺伝子配列の解明とペプチド合成の技術進歩により、大きな支持を得ています。これらの進歩により、標的タンパク質の生成や精製を必要とせずに、動物を免疫することにより、通常は困難なく抗血清を生成できるようになります 1,2。

抗ペプチド免疫化は大部分は成功していますが、タンパク質標的の検出に有用な抗体を生成できない場合があります 1,3。失敗の原因は、ペプチド抗原が標的タンパク質と同じ立体構造をとることができないこと4、標的配列がアクセスできない領域に埋もれていること5、またはペプチド免疫原に反映されない標的タンパク質の翻訳後修飾が原因であると考えられています。

以前の研究で、Liang ら 6 は、使用可能な抗ペプチド抗体の生成に失敗するもう 1 つの潜在的な理由、つまり、無傷のタンパク質には存在しない免疫化ペプチドのカルボキシル末端 (C 末端) に対する抗体の優先的標的化に注目しました。彼らは、C-CAM1 の内部エピトープによるマウスの免疫化により、主に免疫化ペプチドの C 末端に対する抗体応答が生成されたと報告しました。マウス由来のモノクローナル抗体は、免疫原の C 末端に依存した方法で免疫ペプチドと反応しましたが、これらの抗体は無傷のタンパク質には結合しませんでした。研究者らは、マウス由来のモノクローナル抗体には、無傷のタンパク質に存在するペプチド結合によって除去されるC末端に存在するカルボキシレート部分が必要であると結論付けました。

別の研究では、Edwards ら 7 は、個々のタンパク質の C 末端に対応する小さなペプチドによるウサギの免疫化に依存する、細菌タンパク質に対する抗体を生成するアプローチを開発し、成功しました。この研究は、ウサギがペプチドの C 末端に対して効果的な応答を生成できること、および短い免疫原に対して生成された抗血清が著しく特異的であることを示しました。 ELISA アッセイのペプチド競合によって評価したところ、ペプチド免疫原の C 末端を好む抗体の相対割合は、報告されたいくつかの抗体で高かった。

現在の研究では、(1) 個々のウサギにおいて抗ペプチド体液性反応が免疫化ヒトペプチド配列の C 末端を優先的に標的とする程度、および (2) 一連の C 末端を好む体液性反応の頻度を調べます。ヒトタンパク質の断片を表すペプチドで免疫化されたウサギの実験。これらの疑問に対処するために、免疫に使用されるペプチドの C 末端に対する各抗体調製物の特異性に焦点を当て、NOTCH3 抗体の生成を目的とした一連のプロジェクトからのポリクローナル抗血清を遡及的に分析しました。

NOTCH3 は、発生、恒常性、病理において複数の役割を果たす膜貫通受容体 (図 1A) です。 NOTCH3 の変異は、遺伝性脳卒中および血管性認知症、皮質下梗塞を伴う常染色体優性脳動脈疾患および白質脳症 (CADASIL) の最も一般的な原因の原因となっています 8,9。

NOTCH3 に対する抗ペプチド抗体の生成と特性評価。 (A) 抗体産生およびペプチド免疫原の標的となる NOTCH3 配列の位置。上はヒトNOTCH3タンパク質の概略図を示しており、主にN末端のタンデムEGF様リピートで構成されています。丸は、ウサギの免疫化に使用されるペプチド配列の位置を示す。対応するペプチド配列、EGF リピート位置 (EGF#)、および抗体番号を以下に示します。 CADASIL 変異残基 (赤色) を含む 2 つのペプチド (抗体 2076 ～ 2079 に対応) を除いて、野生型配列を使用しました。 (B) 標的優先抗血清を決定するための特性評価戦略。 EGF27由来のペプチド配列に対する抗体1495および1496の特徴付けの詳細な説明は、すべての抗体の配列特異性を決定するために使用されるアプローチを例示する。免疫原配列 (緑色) は、5 つの組換えバリアントの発現を指示するために、EGFP (GFP) の C 末端にクローン化されました。クローン 0 は、免疫原の C 末端で正確に終了します。クローン 2 はクローン 0 から 2 つのアミノ酸が欠失しています。クローン 1 はクローン 0 から 1 つのアミノ酸が欠失しています。クローン + 1 には、クローン 0 (野生型配列から) に対する 1 つのアミノ酸拡張が含まれています。クローン + 2 には、クローン 0 に追加された 2 つのアミノ酸が含まれています)。 5つの組換え体すべてとNOTCH3配列を持たないEGFPクローンをHEK293細胞で発現させ、対応する抗体を用いたイムノブロッティング(IB;図2、3参照)および免疫細胞化学(ICC;図5参照)によって組換えタンパク質を分析した。

NOTCH3に関する研究の過程で、CADASIL10、11で強化されているN末端近くの2つのAsp-Pro配列でNOTCH3が切断されていることを発見しました。これらの発見には、Asp-Pro 切断によって生成される C 末端アスパラギン酸残基に特異的なネオエピトープ特異的モノクローナル抗体の生成が必要でした。これらの抗体は、C 末端にアスパラギン酸を含む配列に特異的です。末端アスパラギン酸残基を超えてタンパク質が伸長すると、結合が排除されます10、11。

また、これらの研究中に、末端アスパラギン酸配列に対する抗体を生成するために使用された免疫化ウサギからのポリクローナル血清には、C末端アスパラギン酸を必要とする抗体が非常に豊富に含まれていることにも注目しました。血清には、C 末端アスパラギン酸残基を含まない配列に反応できる抗体が少量しか含まれていませんでした。（データはこの研究の一部として示されています。）これにより、ウサギのペプチド免疫によって調製された一連の独立したNOTCH3抗体からのC末端配列を優先的に認識する抗体応答の頻度を決定するための現在の研究を実施するようになりました。。

抗体産生の標的としたNOTCH3の領域を図1Aに示します。これらの抗体はすべて、タンパク質の細胞外ドメイン、つまりほとんどの CADASIL 変異の部位であり、タンデム EGF 様リピートで構成される領域を標的とします 12,13。 EGF 様リピートにはシステイン残基が豊富に含まれており、すべてのペプチドには少なくとも 1 つのシステイン残基が含まれています。使用したペプチドの配列を図１Ｂに示す。ペプチドを使用して、一度に 2 ～ 4 匹のウサギを免疫しました。さまざまなベンダーが実験を実施し 10、11、14 、質量分析によって純度が検証された KLH 結合ペプチドを使用して免疫化が行われました。

ウサギは、抗体の製造を契約したベンダーによって標準化されたスケジュールに従って免疫化されました。すべての場合において、免疫前血清は免疫原に対して最小限の反応性を示し、免疫スケジュールの終了時には、各動物は 1:512,000 を超える希釈率で ELISA により陽性となる血清を産生し、免疫に対する強い体液性反応を示しました。

血清は、ペプチドをビーズに架橋することによって生成されたカラムを使用してアフィニティー精製されました。培地での洗浄および酸性緩衝液を使用した溶出を含む標準的な方法を使用し、その後中性PBSに対して透析し、20%グリセロールで安定化させた後に抗体調製物を凍結した。最終的なポリクローナル抗体調製物の反応性は、ELISA によって検証されました。

各 NOTCH3 抗体標的配列の特異性は、異なる長さのペプチド配列に融合した組換え GFP のイムノブロットをプローブすることによって決定されました。図 1B に示す例で戦略を説明します。 GFP の遺伝子クローンを、各免疫ペプチド (各抗体のクローン 0 と呼ばれる) のアミノ酸配列をコードする DNA 配列と融合させました。ペプチドターゲットから 1 つまたは 2 つのアミノ酸を削除して、クローン - 1 および - 2 を生成しました。さらに、NOTCH3 タンパク質配列の 1 つまたは 2 つのアミノ酸を追加して、クローン + 1 および + 2 を生成しました。生成された GFP クローンの例抗体1495および1496の配列標的を試験するための配列を図1Bに示す。 cDNA 発現クローン - 2、-1、0、+ 1、および + 2 を細胞にトランスフェクトして、融合 GFP タンパク質を含むタンパク質溶解物を生成し、ウェスタンブロットで分離しました。ブロットを NOTCH3 抗血清と GFP 抗体でプローブしました。続いて、NOTCH3 抗体シグナルと GFP の比を NOTCH3 抗体親和性の尺度として採用しました。抗体が免疫ペプチドの C 末端に対して優先的に反応する場合、クローン 0 からの GFP 融合タンパク質に対する結合シグナルが最も高く、クローン − 2、− 1、+ 1、およびクローンからの GFP 融合タンパク質に対するシグナルはより低いことが観察されます。 +2。

NOTCH3抗体を使用したイムノブロット分析を図1〜3に示します。図２、３および補足図。 1、2. 抗体の大部分は免疫ペプチドのカルボキシル末端を含むタンパク質に反応しましたが、カルボキシル残基を欠いたタンパク質（クローン - 2 および - 1）やアミノ基を持つタンパク質に結合する抗体の量ははるかに低かったです。ペプチドのカルボキシル残基をブロックする酸延長 (クローン + 1 および + 2)。

NOTCH3 抗ペプチド抗体の標的優先性のイムノブロット分析。可変の C 末端残基を持つ GFP 融合体をトランスフェクトした細胞のタンパク質溶解物の免疫ブロット分析を示します (A ～ K)。これらのブロットのそれぞれについて、NOTCH3 配列 (GFP) を含まない、または完全な免疫原配列 (クローン 0) または欠失 (-2 および - 1) または付加 (+ 1 または + 2) を含む EGFP の発現を指示する 6 つのプラスミドを HEK293 にトランスフェクトしました。 (図 1B を参照)、リストされている抗体に対応します (各パネルの下のブロットの隣にある抗体番号を参照)。免疫化に使用される配列は、図 1A に対応する丸でコード化されています。 GFP (上のブロット) と NOTCH3 抗体 (下のブロット) の両方についてブロットをプローブし、下側/上側シグナルの比を決定しました。すべての値は GFP に対して正規化されました。異なるサイズの非 NOTCH3 C 末端伸長を含む 2 つの異なる GFP コントロールを使用しました。 (L) トランスフェクションによって生成されたタンパク質の概略図。各ターゲット配列について、クローン 0 には使用した免疫原 (赤いひし形で表される残基で終わる) が含まれているのに対し、他のクローンには欠失または伸長 (紫と青のひし形) が含まれていることを示します。抗体が免疫原の C 末端を優先的に標的とする場合、各パネルのクローン 0 が最も多くのシグナルを生成します。免疫ブロット実験は、各抗体に対して少なくとも 3 回実行されました。クローン 0 と比較した p < 0.05 の有意性は、黒のアスタリスク (通常データの一元配置分散分析) と赤のアスタリスク (ノンパラメトリックデータのクラスカル-ウォリス検定) で示されます。全長ゲルを補足図に示します。 3、4。

NOTCH3 抗ペプチド抗体の標的優先性の追加のイムノブロット分析。図 2 を参照してください。追加の抗体も (A ～ L) と同じ方法で評価しました。以前と同様に、実験は各抗体に対して少なくとも 3 回実行されました。全長ゲルを補足図に示します。クローン 0 と比較した p < 0.05 の有意性は、黒のアスタリスク (通常データの一元配置分散分析) と赤のアスタリスク (ノンパラメトリックデータのクラスカル-ワリス検定) で示されます。

注目すべきことに、所定のペプチド配列による免疫後に産生された抗体間には、C末端特異的優先性が非常に強い一致があった。 C 末端優先性を生成する配列は、免疫化されたウサギの 100% で同様でした。 EGF2Cの場合、6匹のウサギすべてがC末端エピトープを標的とした体液性反応を定性的に示した（図2H〜Kおよび3A、B）。Ｃ末端優先性が弱まった抗体を生成したペプチドは、試験したすべてのウサギで同様の優先性を生成した（例えば、ＥＧＦ１Ｎ（図２Ａ、Ｂ）およびＥＧＦ１３（図３Ｅ、Ｆ））。 C 末端の優先性の一致は、免疫化に使用されるペプチド配列に依存する個体間の体液性応答の保存と一致しています。

抗体を生成するために使用されるペプチドの多くは、アスパラギン酸残基で終結しています。抗体が末端アスパラギン酸以外の固有の残基を必要とすることを検証するために、C 末端アスパラギン酸配列に対する抗体を使用して、アスパラギン酸で終わるすべてのクローン 0 タンパク質に対してイムノブロッティングを実行しました。一部の抗体は免疫化に使用されなかったエピトープに対して非常に弱い交差反応性を示しましたが、GFP-NOTCH3 融合パネルに対してテストした場合、9 個中 9 個の抗体は免疫化に使用された NOTCH3 配列に対して最も熱心でした。図 4 は、イムノブロット上の免疫配列に対して高度に特異的であった 4 つの抗体を示しています。

NOTCH3 ペプチドの C 末端を優先的に標的とする抗体の特異性。ポリクローナル抗体 5210 (A)、4944 (B)、1415 (C) および 1496 (D) を使用した免疫ブロット分析を実施し、9 つの独立した NOTCH3 配列に対する各抗体の特異性を決定しました。各タンパク質の正体はブロットのレーンの上に示されています。レーン 1 は非 NOTCH3 GFP ネガティブコントロールです。他のレーンは、図１に示される配列からのクローン０を表す（明確にするためにマークは省略されている；図１Ａ、ＥＧＦ＃を参照）。各パネルは、NOTCH3 抗体によるプローブ (各ペアの下のブロット) と比較した GFP のプローブ (上のブロット) を示しています。全長ゲルを補足図5に示します。

また、細胞培養で発現したタンパク質の細胞染色により、NOTCH3 抗体の C 末端優先性も評価しました。細胞培養物を、図１および図２で使用した発現構築物でトランスフェクトした。 2、3. トランスフェクトされた細胞を固定した後、同族抗体を使用して免疫細胞化学を実行しました。 C 末端優先性を持つ抗体は、クローン 0 でトランスフェクトされた細胞に強い染色を示すことが予想されましたが、クローン - 2、- 1、+ 1、または + 2 ではそうではありませんでした。一般に、イムノブロッティングによって評価された C 末端優先性と免疫細胞化学によって評価される C 末端の優先性。たとえば、図5では、標的ペプチド（クローン0、図5）および欠失または付加（クローン-1および+1、クローン-1および+1）を含む一連のクローンでトランスフェクトされた細胞の抗体4143、9932、および1415染色を示します。図5）。細胞染色はクローン 0 で最も強く、クローン - 1 または + 1 ではバックグラウンドを超えて存在しませんでした。このパターンはイムノブロッティングによる反応性の好みと一致します。トランスフェクトされていない細胞とすべてのトランスフェクトされたグループの両方に対して高いバックグラウンド染色を生成する抗体がいくつかありました。 C末端の優先性を評価します。抗体8274は、クローン-1、0、および+1を発現する細胞の染色を示し(行5、図5)、この抗体が非排他的C末端結合を示すことを示す免疫ブロット結果と一致した。

免疫細胞化学分析による抗ペプチド NOTCH3 抗体の部位優先性。 HEK293 細胞に、トップラベルに対応する組換え構築物を一時的にトランスフェクトしました。左側では、トランスフェクトされた細胞の各セットを抗体で染色しました。 GFP-Clone - 1 は、1 つのアミノ酸欠失を伴う、対応する免疫ペプチド配列に融合された GFP に対応します。 GFP-クローン 0 は、免疫原配列との GFP 融合体です (図 1A のペプチド配列と C 末端で一致)。 GFP-Clone + 1 には追加のアミノ酸が含まれています。 NOTCH3 配列を持つすべての GFP 組換え体には、免疫化に使用される配列が含まれています (図 1A に示すように)。たとえば、4143 でプローブされた細胞は、EGF2(C) の配列で終わる構築物、すなわち SCRCPRGFRGPDCSLP、SCRCPRGFRGPDCSLPD、および SCRCPRGFRGPDCSLPDP でトランスフェクトされました。

これまでの研究では、マウスにおけるペプチドの C 末端に対する体液性免疫応答への偏りにより、抗体の多様性と有用性が制限される可能性があることが示されています 6。ここでは、10 種類の異なるペプチドによる一連の 23 回のウサギ免疫の結果について説明します。我々は、これらの免疫化による抗血清の大部分が、免疫原のC末端とは独立した抗体を犠牲にして、主にペプチドのC末端配列に反応する抗体を生成することを実証する。また、C 末端エピトープの優先順位は個々のウサギ間で同様であり、ペプチド配列に依存することも示します。

これは、ヒトペプチド配列の C 末端を標的とするウサギの体液性反応の強い優先性を実証する、我々の知る限り最大の研究である。この結果は、免疫化に C 末端ペプチド配列を使用した場合、目的のタンパク質のクラスを標的とする抗体の非常に効果的な産生率を報告した Edwards の研究と一致しています 7。アスパラギン酸で終わるペプチドに対して産生された以前のポリクローナル抗体は、主にペプチド免疫原の C 末端に対して反応する抗体で構成されており、カスパーゼによって生成されるネオエピトープの検出が可能でした 15、16。共同研究に基づくと、哺乳動物のタンパク質に対する試薬を生成するアプローチは、ウサギの免疫系のバイアスを利用して C 末端抗体を生成できる可能性があるようです。

B 細胞クローニング技術など、抗体生成を促進する迅速なワークフローの利用可能性によって、ウサギモノクローナル抗体の数が増加していることは、これらの観察の重要性を強調しています。接種に使用されるペプチドが C 末端特異的応答を引き起こす場合、抗体を生成するためにスクリーニングする必要があるクローンの数が多くなる可能性があります。 Edwards et al.7 が示唆しているように、タンパク質の天然の C 末端に対する抗体を生成することにより、将来のウサギのモノクローナルプロジェクトの効率が向上する可能性があります。

調査結果は一般化できるでしょうか? 私たちに自信を与える要因の 1 つは、免疫原として複数のペプチド配列を検査したことです。さらに、この研究は抗体を生産するための単一の施設の使用に依存していませんでした。抗体の生成は、血清の分析に関与していない関係者に委託されました。さらに、このプロジェクトは長期間にわたって実行されました。最後に、ほとんどの場合、2 つの異なる方法を使用して抗体の C 末端優先性を確認することができました。

それにもかかわらず、観察された C 末端の優先度は過大評価されている可能性があります。この報告書の限界の 1 つは、この報告書の仮説を検証するように設計されていない複数の独立したプロジェクトの一部として得られた血清を分析したという遡及的な性質であることです。この研究で使用されたペプチドはすべて、単一の細胞外タンパク質に由来しました。 NOTCH3 は自然に循環している可能性があり 17、哺乳類のホモログがよく保存されているため、他のタンパク質よりも免疫原性が低い可能性があります。実際、免疫化に使用されるほとんどのヒトペプチドはウサギの配列とほぼ同一です。抗体 2076 ～ 2079、9931、9932、1412、および 1413 に使用されるペプチドには 1 残基の違いがあり、抗体 1495 ～ 1496 には 2 つのアミノ酸の違いがあります。ヒトペプチドの残りの半分はウサギの配列と同一です。

実用的な調査として、C 末端優先性の詳細を可能にする突然変異分析やペプチドの生化学的修飾は実行しませんでした。 NOTCH3 はシステインに富むタンパク質であるため、この研究のために選択された配列はシステインを含まないものではありませんでした。 C 末端の優先性はペプチドの高いシステイン含有量によって引き起こされ、タンパク質を体液性反応に偏りをもたらす特定の立体構造に強制する可能性がある可能性を排除できません。特に、この研究よりもはるかに大規模なデータを生成する可能性が高い複数の研究者または産業規模の抗体メーカーによって開始される場合には、C 末端力価の検査を拡大した将来の研究が検討される可能性があります。このようなデータベースにより、C 末端反応性を生成する可能性が高い配列の特定のカテゴリーをより深く理解できるようになります。

一般化可能性とは関係なく、ウサギにおける抗体応答の C 末端優先性が発生することは明らかです。したがって、C 末端抗体の相対量を減らすと、抗体生成の効率が向上する可能性があります。将来的には、(1) 環状ペプチドの使用を含む、C 末端をブロックするいくつかの方法がテストされる可能性があります。 (2) エステル化によるペプチドの C 末端の化学的ブロック。 (3) C 末端を介して結合されたペプチド、または C 末端がブロックされたペプチドを使用したアフィニティー精製。 (4) ペプチドの中央の認識に重要な免疫原性領域を隠す可能性があるシステイン残基の反応性を防ぐ戦略。 (5) ペプチドの中心にある保存されたエピトープに対する耐性を克服するのに役立つ代替アジュバントまたは積極的なアジュバント投与の使用。 Liang et al.6 は C-CAM1 配列の C 末端をアミド化したが、それによってマウスが無傷の標的タンパク質を認識する抗体を産生する傾向が増加することは発見されなかったことに注意すべきである。その代わりに、彼らは、免疫原としてC末端が延長されたより長いペプチドに対するモノクローナル抗体をスクリーニングし、続いてスクリーニング（またはこの場合はアフィニティー精製）に短いペプチドを使用することを提案した。システインに富むペプチドの化学的架橋をブロックするためのシステインのアルキル化に関しては、これを試みる可能性はありますが、アルキル化システイン自体が抗体応答の標的になる可能性があるため、その効果は減弱されることが示されています 18,19。アジュバントの効果を試験するための自然な出発点は、この研究のすべての動物に使用された完全フロイントアジュバントの代替品を使用することです。

我々は、抗体応答の C 末端優先性は抗ペプチド抗体産生の共通の特徴である可能性があると結論付けています。これは、ネイティブタンパク質標的に対する抗体を生成できない可能性のある原因として考慮される必要があります。

ウサギポリクローナル抗体は、別の場所で詳述されている標準手順を使用して商業ベンダーによって生成されました10、11、14。すべての動物実験は、GenScript および Cocalico Biologics の施設内動物管理使用委員会 (IACUC) によって審査および承認され、米国獣医師会および ARRIVE の安楽死に関するパネルの推奨事項を含む、関連するガイドラインおよび規制に従って実施されました。ガイドライン（抗体産生には必要ないため、非ペプチド免疫動物の対照群は含めなかった）。ペプチド抗原は、図1に示すヒトNOTCH3タンパク質の残基に対応して合成した(アクセッション:NP_000426.2 GI:134244285からの配列)。免疫化の前に抗原をKLHに架橋結合させました。これは、初回免疫化には完全フロイントアジュバントを使用し、その後の追加免疫には不完全フロイントアジュバントを使用して実行されました。記載されたペプチド抗原を注射されたすべての動物が研究に含まれた。テストブリードは、標準化されたワークフローに従ってベンダーによって分析されました。現在の研究では、反応性プロファイルの評価に終末期の出血からの血清が使用されました。

標的エピトープをコードする二本鎖オリゴヌクレオチドを、pEGFP-C3 (Clontech)を用いた標準的なライゲーション手順によりEGFPオープンリーディングフレームのC末端に挿入した。すべての構築物は連続的なオープンリーディングフレームの存在を検証するために配列決定されました。対照として、EGFP-C1 または無関係な C 末端伸長を持つ EGFP を使用して、EGFP タンパク質に対するバックグラウンド反応性を測定しました。 2 つのネガティブコントロールを使用すると、異なる免疫ブロットパネルで見られるように、異なるサイズの生成物が生成されました (たとえば、図 2A ～ H と図 2I、K)。

我々は、以前に説明した研究 14,18 の方法を採用しました。タンパク質は SDS ポリアクリルアミドゲル上で分離されました。次に、iBlot 2 機器 (Invitrogen、メソッド P0 20 V 1 分間/23 V 4 分間/25 V 2 分間) を使用してニトロセルロースに転写しました。ニトロセルロース膜は、5% ミルクを含む TBST を使用してブロックされ、その後 4 °C で一晩、TBST 中の一次抗体でプローブされました。一次抗体は、アフィニティー精製した血清から 1:1000 に希釈して使用しました。 TBST中の二次抗体を室温で30分間適用しました。抗体インキュベーション後の洗浄は、室温でTBSTを使用して3回行った。使用した二次抗体調製物には、ロバ抗マウス IRDye 680RD (Li-Cor #926-68072、1:10,000 希釈、AB_10953628) およびヤギ抗ウサギ IRDye 800CW (Li-Cor #926-32211、1:10,000 希釈、AB_2651127) が含まれていました。。データのキャプチャと定量化には、700 nm および 800 nm での検出設定を備えた Li-Cor Odyssey Imager および Li-Core Image Studio ソフトウェアを使用しました。全長イムノブロットを補足図に示します。 3～5。

培養 HEK293 細胞を DMEM および 10% ウシ胎児血清中で増殖させました。メーカー推奨プロトコールに従って、PolyJet (SignaGen、カタログ番号 SL100688) を使用して、EGFP プラスミドをトランスフェクトした後、これらの細胞に対して免疫細胞化学を実施しました 20。一晩インキュベートした後、細胞をホルマリンで固定しました。細胞をブロッキング溶液（PBS中2% BSA）中で30分間インキュベートし、一次抗体（GFP抗体の場合は1:200、アフィニティー精製血清の場合は1:500）を室温で2〜4時間適用しました。 1:200希釈のブロッキング溶液中のビオチン化二次抗体を30分間適用し、続いて製造業者のプロトコール(Vectastain Elite ABCキット、Vector Lab、カタログ番号NC9293436)に従って調製したABC溶液を15分間インキュベートした。最後に、ImmPACT DAB HRP 基質キット (Vector Lab、カタログ番号 NC9567138) を使用して、呈色反応のための DAB インキュベーションを 1 ～ 5 分間適用しました。すべての洗浄ステップは PBS を使用して 3 ～ 5 回実行されました。細胞は対比染色されませんでした。複製トランスフェクションも GFP で染色しました (sc-9996、Santa Cruz Biotechnology)。

データセットは、Shapiro-Wilk 検定を使用して正規性について分析されました。正規分布データの場合、一元配置分散分析と多重比較のダネット検定を使用して比較が行われました。ノンパラメトリック分析では、クラスカル・ウォリス検定とそれに続くダンの多重比較事後分析を使用して、グループ間の差異を比較しました（Prism 8 分析ソフトウェア）。確率値 < 0.05 は統計的に有意であるとみなされます。

現在の研究中に使用および/または分析されたデータセットは、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。

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私たちの研究は、NIH (NS099160) および退役軍人省 (BX003855 および BX003824) からの助成金によって支援されています。

ミシガン大学神経内科、アナーバー、ミシガン州、48109、米国

ス・ジョン・リー、ミッチェル・B・ガッシュ、コナー・J・バロウズ、アキル・コンデプディ、シャオジー・チャン、マイケル・M・ワン

ミシガン大学分子統合生理学学部、7725 Medical Science Building II Box 5622、1137 Catherine St.、Ann Arbor、MI、48109-5622、米国

マイケル・M・ワン

神経科サービス、退役軍人省、バージニア州アナーバーヘルスケアシステム、アナーバー、ミシガン州、48105、米国

Soo Jung Lee、Xiaojie Zhang、Michael M. Wang

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転載と許可

リー、SJ、ガッシュ、MB、バロウズ、CJ 他ウサギ抗体は NOTCH3 ペプチド免疫原の C 末端に優先的に応答します。 Sci Rep 13、9156 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-36067-7

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受信日: 2023 年 2 月 3 日

受理日: 2023 年 5 月 29 日

公開日: 2023 年 6 月 6 日

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