グラムの細胞外小胞 - 株式会社コーストワイズ・ベンチャーズ・グループ

npj Biofilms and Microbiomes volume 9、記事番号: 30 (2023) この記事を引用

481 アクセス

11 オルトメトリック

メトリクスの詳細

腸内細菌叢が宿主の免疫系に影響を与えることは現在ではよく知られています。細菌と宿主細胞とのコミュニケーションの 1 つの方法は、さまざまな積荷を含む小さな膜構造である小胞の分泌を介するものです。グラム陽性腸内細菌によって分泌される小胞、宿主との相互作用のメカニズム、および免疫調節効果に関する研究はまだ比較的不足しています。今回我々は、新たに配列決定されたグラム陽性ヒト腸内共生菌株であるビフィドバクテリウム・ロンガムAO44によって分泌される細胞外小胞（EV）のサイズ、タンパク質含有量、免疫調節効果を特徴づけた。われわれは、B. ロンガム EV が抗炎症効果を発揮し、脾細胞および樹状細胞 (DC) と CD4+ T 細胞の共培養物の両方から IL-10 分泌を誘導することを発見しました。さらに、EVのタンパク質含有量は、ABCトランスポーター、クオラムセンシングタンパク質、および細胞外溶質結合タンパク質の濃縮を示し、これらはB.ロンガムの他の株の抗炎症効果において顕著な機能を有することが以前に示されていた。この研究は、宿主に対する腸内細菌の免疫調節効果を促進する際の細菌小胞の重要性を強調し、将来の治療法としての細菌小胞に光を当てています。

過去 20 年間、多くの研究で、腸内細菌叢がヒトの生理機能に重大な影響を及ぼしていることが実証されており 1,2,3、その有益な機能の範囲は主に免疫系の成熟と調節に関連していることが示されています 3,4,5,6,7。 8、9、10、11、12、13、14。免疫調節細菌は、私たちや他の人々によって長い間同定されていました 15、16、17、18 が、まだ少数の細菌由来の免疫調節分子のみが特徴付けられています 19、20、21。細菌小胞は、細菌細胞と宿主細胞の両方と相互作用できる存在として関心を集めています22。小胞は、グラム陰性菌とグラム陽性菌の両方によって分泌される膜構造です。小胞のサイズは 20 ～ 300 nm とさまざまで、タンパク質 (膜および細胞質の両方)、ペプチドグリカン、核酸、毒素、さらにはリポ多糖 (グラム陰性菌では LPS) などのさまざまな荷物を運びます。小胞は、細菌や宿主細胞の積荷を取り込み、放出することによって細菌や宿主細胞と相互作用します。これらの相互作用により、小胞は近隣の細菌または宿主免疫細胞への長距離分子送達に理想的なものとなります。したがって、細菌小胞は潜在的な治療法に利用できる可能性があります23。グラム陰性菌によって生成される小胞は 60 年代から研究されてきましたが 24、グラム陽性菌による細胞外小胞 (EV) の生成は 30 年後に実証されました 25。 90 年代に発見されましたが、グラム陽性 EV の小胞形成と免疫調節効果への関心は過去 10 年間で高まりました 26,27 が、依然として、黄色ブドウ球菌 28、結核菌 29、結核菌 29 などの病原性細菌に焦点が当てられています。炭疽菌30,31。いくつかの研究では、グラム陰性菌とは異なり、代謝的に活性なグラム陽性菌のみが EV を分泌することが示されています 32,33 が、最近の研究では、EV は「泡立つ細胞死」の過程でも分泌されることが示唆されています 34。現在まで、小胞形成の遺伝的調節に関与する因子と、EV の放出を可能にする細菌の膜状態については限られた理解しかありません 26,35。グラム陽性腸内細菌叢のメンバーの中で、ビフィズス菌属は母乳のオリゴ糖を分解することが知られており、成人の腸だけでなく母乳で育てられた乳児の消化管 36 にも広く蔓延していることが知られているため、関心を集めています 37 。さらに、ビフィドバクテリウム属の種は、自然免疫系と適応免疫系の両方に影響を及ぼし、そのほとんどが抗炎症作用を持つことが判明しており 16,38、現在までに特徴付けられているエフェクター分子もいくつかある 39,40。ビフィドバクテリウムビフィダムピリ 40 やビフィドバクテリウムブレーベ 39 の細胞外多糖などのいくつかの細胞外分子は、抗炎症効果を誘導することが示されていますが、これらの分子が宿主と相互作用するメカニズムは完全には理解されていません。ビフィズス菌属の重要なメンバーはビフィズス菌ロンガムです。この種は、ビフィズス菌種の中でも、人間の腸内に非常に豊富に存在します41。 B. ロンガムは、細胞株に対して in vitro で抗炎症作用を有することが 42、マウスモデルにおいて in vivo で抗炎症作用があることが判明し 43、そして最も重要なことに、炎症性腸疾患 (IBD) の臨床試験において抗炎症作用があることが判明しました 44。これらの抗炎症効果は主に、酸化ストレスを軽減し、炎症性サイトカインの分泌を下方制御し、腸内の短鎖脂肪酸（SCFA）含有量を増加させる能力に起因すると考えられています45。しかし、宿主との相互作用や治療効果の根底にある分子機構はまだ発見されていません。いくつかの研究では、ビフィズス菌種によって分泌されるEVが抗炎症作用があり、アレルギー治療におけるアジュバントとしての使用の可能性があることが強調されています46,47。たとえば、B. ビフィダムの小胞は樹状細胞 (DC) と相互作用し、その後制御性 T 細胞 (T-reg) が分化することが判明しました 47。興味深いことに、最近の研究では、マスト細胞におけるアポトーシス誘導を介して食物アレルギーを軽減するB. ロンガム小胞の可能性が強調されています46。グラム陰性菌とグラム陽性菌の両方の腸内共生生物由来の小胞の免疫調節効果に関する研究が現れ始めているが 26、これらの効果の根底にある分子とメカニズムを発見した研究はほんのわずかである。さらに、同じ種のいくつかの菌株に由来する EV は、異なるメカニズムで異なる免疫調節効果を誘導することが示され、ヒトの腸内に見られる数千の細菌株に由来する小胞の大きな可能性が強調されています 48。今回我々は、新たに配列決定され注釈が付けられたビフィドバクテリウム・ロンガム株AO44によって産生される腸内細菌小胞の免疫調節効果を実証する。私たちの結果は、細菌小胞の潜在的な治療効果に関する将来の研究に新たな道を開きます。

B. ロンガム株 AO44 の DNA が抽出され、全ゲノムの配列が決定され、GenBank に寄託されました (アクセッション番号 PRJNA908295)。どの細菌実体が抗炎症性免疫応答 (つまり、IL-10 分泌) を刺激するかを決定するために、メタノール/クロロホルム (MeOH/CHCl3) 抽出を使用して化学分別を実行しました。岐阜嫌気培地（GAM）またはブレインハートインフュージョンサプリメント（BHIS）で増殖させたB.longum AO44からの細菌細胞と馴化培地の両方を収集し、疎水性/親水性画分を抽出しました（図1a、b）。特定病原体フリー (SPF) マウス脾細胞を使用して、各化学画分の免疫調節効果を評価しました。脾細胞を抗CD3抗体で活性化し、各細菌画分を補充しました。抗 CD3 抗体で活性化された SPF マウス脾細胞を使用すると、脾臓に存在する免疫細胞の集団全体に対する細菌の実体の影響を研究することができます。 GAM および BHIS の両方で増殖した細菌からの CHCl3 画分は、他の画分と比較して脾細胞による最も高い IL-10 分泌を示しました。対照（抗CD3で活性化された脾細胞）からの変化倍数が示されている（図1c、d）。濃縮（10倍）馴化培地の画分（すなわち馴化培地）の免疫調節効果はCHCl3画分と同様であり、両方の画分に存在する細菌実体が活性な免疫調節成分を含むことを示した。

a 細菌の増殖と細胞/上清の分離の図。 b 細菌馴化培地と細胞の化学的分別の図。 c BHIS培地で増殖させたB.ロンガムから生成した化学画分のいずれかに曝露した脾細胞におけるIL-10濃度の倍率変化（対照と比較）。 d GAM培地で増殖させたB.ロンガムから生成した化学画分のいずれかに曝露した脾細胞におけるIL-10濃度の倍率変化(対照と比較)。各ドットは、3 つの独立した実験の技術的な繰り返しを表します。ブラウンフォーサイスおよびウェルチの分散分析、*P < 0.05 および **P < 0.01。エラーバーは、sd CHCl3 画分 = 疎水性有機画分、MeOH 画分 = 親水性有機画分、H2O 画分 = 親水性極性画分、SupX10 = 濃縮馴化培地を表します。図 1a、b は BioRender.com で作成されました。

CHCl3 の化学的特性によると、この画分には細菌の細胞膜などの疎水性分子がほとんど含まれています。 CHCl3 画分と濃縮上清画分の両方が IL-10 分泌に対して同様の効果を有し、EV は馴化培地に分泌された (つまり、上清中に存在する) 細菌細胞膜で構成されているため、我々は EV の特徴付けに焦点を当てることにしました。活動的な細菌の実体。 B. ロンガム AO44 の EV は、一連の濾過と超遠心分離によって単離され（図 2a）、ペレット内の EV が得られました。対照として、細菌を含まないBHIS培地を同じ濾過および超遠心分離のプロセスに通し、免疫効果が濃縮培地自体に由来するものではなく細菌実体に由来することを確認した。 EVは形態とサイズによって特徴付けられました（図2b〜d）。代表的な Cryo-TEM 画像は、超遠心分離されたペレット内の小胞の存在を確認し、その形態を示します (図 2b)。さらに、Cryo-TEMを使用して、EVが細菌細胞膜から出芽しているだけでなく、増殖培地中の細菌細胞を取り囲んでいることも確認されました（図2c）。 EVのサイズ分布はNanoSightを使用して測定され、ほとんどの小胞のサイズは150 nmでした（図2d）。 EVがB.longumによって合成されたことを検証するために、細菌を蛍光D-アミノ酸の存在下で増殖させて、新たに合成されたタンパク質、特に細菌のペプチドグリカンを標識した。代謝活性のある細菌は、タンパク質を合成するために蛍光 D-アミノ酸を組み込みます。蛍光 D-アミノ酸による代謝標識は、非特異的標識アーティファクトを引き起こす可能性のある蛍光マーカーの痕跡を残す可能性がある抽出後に標識する必要がなく、新たに合成された細菌性 EV をその生産中に標識できる方法です。。標識された小胞は、小さな粒子を検出するように設計された特異的なフローサイトメトリーによって識別され、標識されていない小胞と区別されました（図2e、f）。

細胞外小胞の分離プロセスの図。 b 同じサンプルから細菌によって放出されたさまざまな EV の Cryo-TEM 画像。「b」の「S」は、TEM 穴あき支持フィルムを示します。すべてのバーは 100 nm に対応します。 c EV形成のさまざまな段階にある細菌のCryo-TEM画像：（1）細菌の先端。アスタリスクは、細胞壁を通した投影で見られる形成可能な EV を示します。 (2) 細胞壁と被膜の間に形成される EV (矢印)。 (3) 細胞壁とカプセルの間に完全に形成された EV (矢印)。「S」は TEM 穴あき支持フィルムを示します。 (4) EV 放出後の細菌の先端。矢印は歪んだ細胞壁を指します。矢印はリリースされたEVを指します。 (4)の拡大図を右に追加します。スケールバーは 100 nm に対応します。 d NanoSightで測定したB.ロンガム細胞外小胞のサイズ分布と濃度（1e10）。エラーバーは、フローサイトメトリーで検出された、D-アミノ酸標識によって蛍光標識されたB.longum細胞外小胞のsd e,fを表す。 e 標識されていない小胞と f 標識された小胞。図 2a は BioRender.com で作成されました。

B. ロンガム AO44 EV のプロテオーム含有量を、液体クロマトグラフィー - タンデム質量分析法によって分析しました。 3 つのリピートすべてで 463 個のタンパク質が同定および定量されました。濃縮されたKEGG経路は、図3aおよび補足表1cにパーセンテージで示されています。タンパク質の 3 つの最大グループは、代謝経路 (16.9%)、リボソーム (9.4%)、および二次代謝産物の生合成 (7.7%) に属し、4 番目に大きいグループは ABC トランスポーター (6.1%)、6 番目に大きいグループはクォーラムセンシング (4.9%)。さらに、INTERPRO データベースによれば、ABC トランスポーターが最も顕著に濃縮されたカテゴリーであり、タンパク質数は 31、p 値は 1e-10 でした (図 3b および補足表 1b)。 INTERPROは、膜貫通透過酵素タンパク質、ヌクレオチド結合タンパク質、および高度に特異的なペリプラズム溶質結合タンパク質など、ABCトランスポーターに関連する他のタンパク質カテゴリーがB.ロンガムAO44 EVに豊富に含まれていることを確認しました（図3b）。 KEGGによって分析されたこれらのABCトランスポーターサブセットとクオラムセンシングサブセットのSTRING分析と相互作用マップを図3c、dに示します。注目すべきことに、ABCトランスポーターサブセットには、クオラムセンシング経路およびATP結合経路に属するタンパク質も含まれていました（図3c）。クオラムセンシングサブセットには、脂肪酸生合成、タンパク質輸送、ABCトランスポーター、および膜の固有成分であるタンパク質に関与するタンパク質が含まれていました（図3d）。小胞内で同定されたすべてのタンパク質は補足表 1 にリストされています (補足表 1a には内在性膜成分の全リストが含まれ、補足 1b には INTERPRO 分析が含まれ、補足 1c には KEGG 分析が含まれます)。

B. ロンガム EV が豊富な KEGG 経路。 b DAVID Bioinformatics Resources (フレデリック国立研究所の LHRI/ADRD) によって分析された、INTERPRO データベースの強化されたドメインおよびタンパク質ファミリーのカテゴリー (P 値およびタンパク質数)。濃縮は細菌ゲノムのバックグラウンドに対して行われました。 c KEGG 経路データベースによって注釈が付けられた ABC トランスポータークラスターの STRING 分析と相互作用マップ (紫 - ABC トランスポーター、青 - クオラムセンシング、灰色 - ATP 結合)。 d KEGG経路データベースによって注釈が付けられたクオラムセンシングタンパク質のSTRING分析と相互作用マップ（青 - クオラムセンシング、黄色 - 脂肪酸生合成、茶色 - タンパク質輸出、紫 - ABCトランスポーター、水色 - 膜の固有成分）。

EVのタンパク質プロファイルが細菌細胞および上清のタンパク質プロファイルと異なることを検証するために、細菌細胞および上清に対してもプロテオミクス分析を実行しました（補足表2）。細菌細胞のタンパク質強度プロファイルを、EV データおよび超遠心分離後の上清から分析したタンパク質と比較しました。各グループからの複製は、教師なしクラスタリングによって一緒にクラスター化され、ヒートマップで表されます (図 4a)。複数の強力なタンパク質が細菌細胞のプロテオミクスでは同定されたがEVでは同定されず、EVでは同定されたが上清では同定されなかった。これは、EVに特有の、総タンパク質含有量とは異なる特定のタンパク質含有量がEVに含まれていることを示している。細胞の成分だけでなく、分泌されたタンパク質の内容からも測定されます。 INTERPROデータベースによると、ABCトランスポーターのタンパク質とドメインは細菌細胞と比較してEVで有意に豊富でした（図4b）。細菌細胞（右）とEV（左）で同定された異なるタンパク質は、火山プロットに表示されます（図4c）。

a Perseus ソフトウェアによって分析された、細菌細胞、EV、および上清サンプルのタンパク質強度のヒートマップ表示。この教師なし階層クラスタリングは、ユークリッド距離分析を使用して実行されました。 b DAVID Bioinformatics Resources (フレデリック国立研究所の LHRI/ADRD) によって分析され、細菌細胞と EV を比較した INTERPRO データベースの強化されたドメインおよびタンパク質ファミリーのカテゴリー (P 値)。濃縮は細菌ゲノムのバックグラウンドに対して行われました。 c 細菌細胞（右）およびEV（左）で同定された示差タンパク質のボルケーノプロット表示。赤 - ABC トランスポーター、青 - ATP 結合タンパク質、緑 - 細胞膜、オレンジ - リボソームタンパク質。

EV を SPF マウス脾細胞に濃度を下げて導入し、細胞の培地中の IL-10 と IL-17 の両方の濃度を測定しました。 IL-10 濃度は、他のすべての希釈および対照と比較して、EV の最低希釈 (1:50) で最高でした。小胞を1:1250希釈で非有効濃度まで希釈すると、IL-10の濃度は非線形的に減少した(図5a)。反対に、IL-17濃度は、すべての濃度において小胞の影響を受けませんでした（図5b）。 CD8+ Ki67+ PD1+ および CD4+ Ki67+ PD1+ 細胞の頻度をフローサイトメトリーで測定し、細胞の増殖と活性化を評価しました。 CD8+ Ki67+ PD1+ 細胞頻度と CD4+ Ki67+ PD1+ 細胞頻度は両方とも、細胞を最低希釈の小胞（1:50）に曝露した場合に高く、CD8+ Ki67+ PD1+ は他の希釈液やコントロールと比較してわずかに有意でした（図 5c、d ）。 B. ロンガム EV に対する抗原提示細胞および T 細胞の抗炎症反応をさらに調査するために、DC-CD4+ T 細胞を細菌性 EV の存在下で共培養しました。 IL-10レベルは、濃縮BHISで活性化した細胞と比較して、B.ロンガムのEVで活性化した細胞で有意に高かった（x1000、図5e）。 IL-17の倍率変化は、濃縮BHISで活性化した細胞と比較して、EVで活性化した細胞では有意な差はなく、わずかな減少さえも示しました（x1000、図5f）。 DC-CD4+ T 細胞共培養における IL-10 および IL-17 の誘導は、脾細胞全体のアッセイにおける誘導と一致しました。

a 抗 CD3 に曝露後の脾細胞培地中の IL-10 濃度および b IL-17 濃度。または、濃縮BHIS（ライトグレー、1:50希釈）または細胞外小胞の下降希釈と組み合わせた抗CD3抗体。 c 抗CD3に曝露した後の総CD4細胞のうちのCD4+ Ki67+ PD1+ 細胞頻度。抗 CD3 と濃縮 BHIS (1:50 希釈) または細胞外小胞の下降希釈を組み合わせたもの。 d 抗CD3または濃縮BHISと組み合わせた抗CD3（1：50希釈）または細胞外小胞の下降希釈物に曝露した後の総CD8細胞のうちのCD8+ Ki67+ PD1+細胞頻度。 e、f B.ロンガムEVまたは濃縮BHISのいずれかに曝露されたDC-CD4+ T細胞培地中のIL-10（e）またはIL-17（f）濃度の倍率変化（対照と比較）。各ドットは、3 つの独立した実験からの生物学的反復を表します。 a – d 通常の一元配置分散分析、e、f 対応のない t 検定。 *P < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.001、****P < 0.0001。エラーバーは標準偏差を表す

腸内細菌叢は私たちの健康に大きな潜在的な影響を及ぼしており、細菌由来の治療用分子の宝庫と考えられるほどです 19,20,21。宿主に対する細菌誘発性の治療効果の主な経路は、細菌と宿主の免疫系とのコミュニケーションを介するものである6、7、8、9、16、49。例えば、腸内細菌によって産生される SCFA は、T-reg の誘導を介して宿主に対して抗炎症効果を誘導することができます50。しかし、そのような共生宿主間コミュニケーションの様式や関与する細菌の免疫調節分子は、依然としてほとんどわかっていない。腸内微生物と宿主の相互作用の考えられる様式の 1 つは、細菌小胞の分泌を介するもので、細菌小胞は宿主細胞に、場合によっては離れた場所にさえ到達することができます。実際、グラム陰性菌バクテロイデスフラジリスの外表面多糖類 (PS) は細菌の外膜小胞 (OMV) を介して宿主細胞に伝達され、マウスの実験的大腸炎を軽減します 51。グラム陽性腸内細菌の細胞外小胞 (EV) に関する研究は増えてきていますが、グラム陰性 OMV に関する研究と比較すると、まだ比較的少ないです 46,47。具体的には、いくつかの最近の研究では、ビフィドバクテリウム属の細菌によって産生されるEVの生理学的効果が実証されています。この属のうち、ビフィドバクテリウムロンガムは、抗炎症作用と免疫調節作用を持つ一般的なグラム陽性腸共生菌です。

ここで我々は、その免疫調節実体を特徴付けることを目的として、新たに単離されたヒト腸由来の B. ロンガム株 AO44 を研究することを選択しました。我々は、活性な免疫調節細菌化合物の化学的特徴を発見するために、最初に細菌細胞およびB.longum AO44の上清の化学分別を実施した。ビフィズス菌種の増殖に広く使用されている 2 つの豊富な増殖培地 (BHIS および GAM) が選択されました。 CHCl3:MeOH:H2O 分別を実行し、分子を粗疎水性画分と親水性画分、有機画分と極性画分に分離しました。ビフィドバクテリウム属の細菌は主に抗炎症作用を誘導することが示されているため 38、活性画分による抗炎症性サイトカイン IL-10 の誘導についてスクリーニングしました。濃縮上清画分と CHCl3 細胞画分の両方が、GAM 培地と BHIS 培地の両方において、免疫細胞による IL-10 分泌に対して最も高い効果を示しました。 CHCl3 非極性有機画分には、膜部分や脂質などの疎水性分子が含まれています。したがって、有効成分は両方に含まれる細胞物質であると考えられます。上清は遠心分離によって細菌細胞から分離されているため、見つかった疎水性膜部分は細胞破片または細菌細胞から培地に分泌されたEVである可能性があります。したがって、我々は次に、BHISで増殖させた細菌からEVを単離し、全脾細胞培養においてIL-17ではなくIL-10の分泌を誘導する能力を確認したが、これはその抗炎症効果を強調するものである。

我々は、それらの追加の潜在的な免疫効果をさらに調査し、これらの同じEVが、対照と比較してCD4+ Ki67+ PD1+およびCD8+ Ki67+ PD1+細胞頻度を増加させる能力があることを特定した。 CD4+ Ki67+ PD1+ および CD8+ Ki67+ PD1+ の上方制御は、CD4 細胞と CD8 細胞の両方の活性化 (PD1+) と増殖 (Ki67+) を示し、これは IL-10 の誘導と一致します。宿主免疫細胞に対するEVの抗炎症効果をより機構的に洞察するために、DC-CD4+ T細胞共培養におけるEVの免疫調節効果を調査しました。ここで、脾細胞全体と同様に、EV は IL-17 ではなく IL-10 の分泌を誘導しました。これは再びそれらの抗炎症作用を示しており、DC と CD4+ T 細胞がこの相互作用における主要な役割を果たしていることが特定されます。 EVの免疫調節効果を特定した後、プロテオミクスによってその内容を特徴付けました。プロテオミクス分析により、細菌細胞全体のタンパク質含有量および上清中の分泌タンパク質とは異なる、EV 内の独自のタンパク質含有量が明らかになりました。具体的には、ABC トランスポーターとクオラムセンシングタンパク質の濃縮が EV で観察されました。細菌の高親和性輸送系は、細胞膜透過酵素タンパク質、ヌクレオチド結合タンパク質、特異性の高い細胞周囲溶質結合タンパク質など、すべて小胞内に存在する溶質の細胞膜を通過する能動輸送に関与しています。注目すべきことに、ABCトランスポーターと細胞外溶質結合タンパク質（「ファミリー5」を含む）は、アレルギーを軽減することが示された別のB.ロンガム株のEVに豊富に含まれていました46。さらに、クオラムセンシングタンパク質はグラム陰性 OMV に豊富に含まれており、細菌バイオフィルムの形成を促進することが以前に示されています 52,53。最後に、細菌小胞の特異的な蛍光標識を実証します。これにより、EV と宿主の相互作用に関する将来の研究が可能になります。要約すると、我々は、新たに単離された腸由来の B.longum の EV の形態、サイズ、含有量、および免疫調節活性によって特徴付けました。 EVが媒介する免疫細胞の活性化を実証する我々の結果は、生体内、健康、疾患におけるEVの効果を評価し、これらの特定のEVを潜在的な将来の治療法として検討する将来の研究につながる可能性がある。

B. ロンガム AO44 を、1 N NaOH 中の 5 μg/ml ヘミン (Alfa Aesar) および 100% EtOH 中の 2.5 μg/ml ビタミン K (Thermo Fisher Scientific) を補充した Brain Heart Infusion 寒天プレート (BHI、BD BBLTM) 上で解凍しました。以前は BHIS と呼ばれていました)、嫌気チャンバー内、37 °C、85% N2、10% CO2、5% H2 (COY)。

B. ロンガム AO44 を嫌気条件下、37 °C で前培養しました。まず、約 20 ml のフンゲートチューブ内の 10 ml の BHIS または GAM に 0.5% v/v で接種し、次に嫌気条件下、37 °C で 1 L ガラス瓶内の 900 mL の BHIS または GAM に 0.5% v/v で接種します。 37℃で4日間インキュベートした後、上清と細胞を遠心分離（7500×g、1Lx4ボトルローターを備えたThermo Fisher Scientific Sorvall R6遠心分離機）によって分離しました。

上清分画－１０×上清画分（すなわち、粗濃縮上清）を、遠心分離した上清をロータリーエバポレーターで１／１０の体積まで蒸発させることによって調製した。上清−メタノール画分を以下のように調製した：まず、遠心分離した上清１０ｍｌを凍結乾燥した。３０ｍｌのメタノールを乾燥残渣に添加した。スパチュラと超音波処理 (15 分間) で混合した後、混合溶液を室温 (RT) で一晩放置し、分子をメタノールで完全に抽出しました。メタノール溶液を不溶性残留物から注意深く除去した。このメタノール画分（３０ｍｌ）を真空中で濃縮乾固し、１ｍｌのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に再溶解した。上清−水画分を以下のように調製した：上記プロセスからの不溶性残留物を１ｍｌの水に溶解した。

細胞ペレットの分画 - 細胞-クロロホルム画分を次のように調製しました: 1 L 培養物からの細胞ペレットを 300 ml のクロロホルム:メタノール = 1:1 (v/v) に浸しました。スパチュラと超音波処理 (15 分間) で混合した後、混合溶液を室温で一晩放置し、分子を有機溶媒で完全に抽出しました。抽出物を細胞ペレットから取り出し、濾過し、真空中で蒸発乾固させた。次いで、乾燥残渣に３０ｍｌのクロロホルムを加え、スパチュラおよび超音波処理（１５分間）によって混合し、室温で一晩放置して、分子を有機溶媒中に完全に抽出させた。クロロホルム溶液を不溶性残渣から除去し、真空下で濃縮し、続いて３mlのDMSOに再溶解した。細胞-メタノール画分を次のように調製しました。上記の細胞-クロロホルム抽出プロセスからの不溶性残留物を30 mlのメタノールに溶解し、スパチュラと超音波処理（15分間）で混合し、分子を完全に抽出するために室温で一晩放置しました。有機溶剤。メタノール溶液を不溶性残渣から除去し、真空下で濃縮し、３mlのDMSOに再溶解した。

B. ロンガム AO44 を 10 ml BHIS 中で 37 ℃、嫌気条件下で一晩増殖させた。次に、細菌培養物を 1:40 で 200 ml の BHIS に希釈し、嫌気条件下で 37 °C で 8 時間増殖させ、2 回目の 1:20 の希釈を行い、細菌を嫌気条件下で 37 °C で 16 時間増殖させました。培養物を 8000 × g で 30 分間遠心分離した後、孔径 0.45 μm のフィルターと孔径 0.22 μm のフィルターで 2 回濾過しました。次いで、濾過した上清を、１００ｋＤａの排除を伴うＣｅｎｔｒｉｃｏｎ（登録商標）Ｐｌｕｓ−７０遠心フィルターユニット（Ｍｅｒｃｋ）を使用して濃縮した。残った上清を 100,000 × g、4 °C で 1 時間超遠心分離して、膜小胞ペレットを得ました。超遠心分離後、上層の液体を廃棄し、小胞ペレットを 1 ml の滅菌ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) に再懸濁し、孔径 0.22 μm のフィルターで濾過し、-80 °C で凍結しました。小胞のサイズ分布は、NanoSight を使用して測定されました。

C57BL/6 SPF マウスから脾臓を採取し、1 ml の ACK 溶解バッファー (Thermo Fisher Scientific) を使用して 40 µm セルストレーナー上で 1 ～ 2 分間機械的に破砕しました。次に細胞を20 mlの氷冷RPMI（Sartorius）培地に移し、4℃、300×gで10分間遠心分離しました。細胞を10mlの氷冷RPMIで2回洗浄し、計数し、37℃のRPMIで最終濃度200万細胞/mlまで希釈した。次いで、T細胞の次善の活性化のために、細胞に0.05 mM β-メルカプトエタノール(Merck)および抗CD3(0.5 μg/ml、145-2C11、BioLegend)を補充した。 100μlの細胞を96ウェルプレートの各ウェルに播き、100μlの希釈画分（1：250希釈）または小胞（1：50〜1：31,250希釈）を加えました。細胞とその培地を 5 日後にフローサイトメトリーと ELISA 分析のために収集しました。

C57BL/6 SPF マウスから脾臓を採取しました。 DCの抽出のために、脾臓にRPMI培地中1 mg/mlの濃度のコラゲナーゼiiを注射し、37℃で30分間インキュベートし、その後40μmセルストレーナー上で機械的に破砕した。 CD4+ T 細胞を抽出するために、脾臓を 2% ウシ胎児血清 (FBS) を含む 1 ml の PBS を用いて 40 μm セルストレーナー上で機械的に破砕しました。次に細胞を10 mlのPBSまたは2% FBSおよび1 mM EDTAを含むハンクス平衡塩類溶液(HBSS)で2回洗浄し、室温で5分間、300×gで遠心分離した。メーカーの指示に従って、各脾臓からの細胞を使用して、EasySep™ Mouse Pan-DC Enrichment Kit (STEMCELL Technologies Inc.) を使用して DC を単離するか、EasySep Mouse CD4+ T Cell Isolation Kit (STEMCELL Technologies Inc.) を使用して CD4+ T 細胞を単離しました。 50μlの単離DCを、最終濃度400,000細胞/mlでRPMI培地中の96ウェルプレートに播種した。 50μlの単離されたCD4+ T細胞を、同じ96ウェルプレートのRPMI培地中で最終濃度200万細胞/mlでプレーティングした。次いで、CD4+ T細胞の最適以下の活性化のために、細胞に0.05 mM β-メルカプトエタノール（Merck）および抗CD3（0.5 μg/ml、145-2C11、BioLegend）を補充した。次いで、DC-CD4+ T細胞共培養物に、100μlの希釈小胞(1:50希釈)および対照として濃縮BHIS(1:50希釈)を添加した。 3日後にELISA分析のために細胞培地を収集した。

Cryo-TEM 試料は、制御された温度 (25 °C) および 100% の相対湿度で、制御環境ガラス化システム (CEVS)54 で準備されました。溶液の４μＬ滴を、ＣＥＶＳ内のピンセットで保持されたＴＥＭグリッド（２００メッシュ銅グリッド上のＬａｃｅｙＦｏｒｍｖａｒ／カーボンフィルム、ＴｅｄＰｅｌｌａＩｎｃ．、レディング、米国）上に支持されたカーボンコート穿孔フィルムに塗布した。グリッドは、その親水性を高めるために、事前に PELCO EasiGlow グロー放電器 (Ted Pella Inc.、レディング、米国) でプラズマエッチングされていました。余分な液体をフィルター紙を使用してグリッドの裏側から 2 回吸い取り、イメージングに適した薄膜を形成しました。次に、凝固点 (-183 °C) の液体エタンにグリッドを素早く浸すことで、溶液をガラス化しました。標本は画像化するまで液体窒素デュワー中で保管した。標本は、200 kV で動作し電界放出銃 (FEG) を備えた高解像度 TEM である Thermo-Fisher Scientific Talos 200C、および Falcon III 直接イメージングカメラを使用してイメージングされました。顕微鏡への標本の移動は、-180 °C に保たれた Gatan 626 クライオホルダーを使用して行われました。すべての画像は、電子線放射線による損傷を最小限に抑えるために低線量イメージングによって記録され、画像のコントラストを高めるために Volta 位相板 (VPP) を使用しました。

細菌を、HADA (0.8 mM、Tocris、Bio-Techne) を補充した BHIS 培地中の嫌気チャンバー内で嫌気条件下、37 °C で一晩増殖させました (総量 10 ml)。標識された細菌を、7500 × g で 5 分間の遠心分離によって培地から分離しました。次に、小胞を上記のように単離し、90 nm ほどの小さな粒子を検出できる小型粒子検出器を備えたフローサイトメトリーアナライザーである BD FACSymphonyTM A1 によって検出しました。使用電圧：FS-550、SS-650、SP SSC-450、BV421-460。

一貫性を保つために一定の抗体パネルを使用しました。パネルには、CD4 (RMA-5)、CD8 (53-6.7)、TCRβ (H57-597)、CD19 (6D5)、Ki67 (16A8)、PD-1 (29F.1A12、すべて BioLegend 製) に対する抗体が含まれていました。転写因子の細胞内染色では、細胞を表面マーカーについて染色し、Fix/Perm バッファー (eBioscience) で RT で 30 ～ 60 分間固定し、抗体の存在下で透過化バッファー (eBioscience) で RT で 30 分間透過処理しました。細胞はBD BioSciences® LSRFortessaで取得され、分析はKaluza® Analysis Softwareで行われました。染色の一貫性を確保するために、抗体の濃度、クローン、およびソースを一定に保ちました。

脾細胞およびDC-CD4+ T細胞培地中のIL-10およびIL-17濃度は、マウスIL-10およびIL-17 ELISA MAXTM標準キット(BioLegend)を製造者の指示に従って使用して測定した。 ELISA 検出限界: IL-10 - 31.5 ～ 2000 pg/ml、IL-17 - 15.6 ～ 1000 pg/ml。

EV および上清サンプルを 10 mM ジチオスレイトール (DTT)、100 mM トリス、および 5% ドデシル硫酸ナトリウム (SDS) に溶解し、超音波処理し、95 °C で 5 分間煮沸し、80% アセトンで沈殿させました。タンパク質ペレットを9 M 尿素および400 mM 重炭酸アンモニウムに溶解し、3 mM DTTで還元し（60 °Cで30分間）、100 mM 重炭酸アンモニウム中の10 mM ヨードアセトアミドで修飾しました（室温、暗所で30分間）。 2 M 尿素、修飾トリプシン (Promega) を含む 25 mM 重炭酸アンモニウム中で、酵素対基質の比 1:50 (M/M) で 37 °C で一晩消化しました。自家製 C18 ステージチップを使用してトリプシンペプチドを脱塩し、乾燥させ、0.1% ギ酸に再懸濁しました。ペプチドは、Reprosil 逆相材料 (Dr Maisch GmbH、ドイツ) を充填した 0.075 × 300 mm 溶融シリカキャピラリー (J&W) での逆相クロマトグラフィーによって分離されました。ペプチドを、５％から２８％の６０分間の直線勾配、２８％から９５％の１５分間の勾配、および０．１％ギ酸を含む水中９５％アセトニトリルで１５分間、０．１５μｌ／分の流速で溶出した。質量分析は、Q Exactive HF 質量分析計 (Thermo Fisher Scientific) を使用し、フル MS スキャンとそれに続く高衝突誘起解離 (HCD、HCD、最初の MS スキャンから選択された 18 個の最も支配的なイオン (>1 電荷) の 27 正規化衝突エネルギー)。動的除外リストは、20 秒の除外期間で有効になりました。質量分析データは、MaxQuant ソフトウェア 1.5.2.856 を使用して分析され、Andromeda 検索エンジンを使用してピークの選択と同定が行われ、Uniprot データベースのビフィドバクテリウムロンガムプロテオームに対して検索され、前駆体質量の場合は 6 ppm、フラグメントの場合は 20 ppm の質量許容差で検索されました。イオン。メチオニンの酸化およびタンパク質の N 末端アセチル化は可変修飾として受け入れられ、システインのカルバミドメチルは静的修飾として受け入れられました。最小ペプチド長は 6 アミノ酸に設定され、最大 2 回の誤切断が許容されました。データは、同じソフトウェアを使用したラベルフリー分析によって定量化されました。ペプチドおよびタンパク質レベルの誤検出率 (FDR) は、ターゲットデコイ戦略を使用して 1% にフィルタリングされました。タンパク質表は、逆引きデータベースからの同定、一般的な夾雑物、および単一ペプチドの同定を除去するためにフィルタリングされました57。

細菌細胞サンプルの場合、ペプチドは、5% ～ 28% の 180 分間の直線勾配、28% ～ 95% の 15 分間の勾配、および水中 0.1% ギ酸を含む 95% アセトニトリルで 25 分間、 0.15μl/分。質量分析は、Exploris 480 質量分析計 (Thermo) によりポジティブモード (m/z 350 ～ 1200、MS1 の分解能 120,000、MS2 の分解能 15,000) で実行され、フル MS スキャンとそれに続く高衝突誘起解離 (HCD、27 で正規化) を繰り返し使用しました。最初の MS スキャンから選択された 30 個の最も支配的なイオン (>1 電荷) の衝突エネルギー)。動的除外リストは 30 秒の除外期間で有効になりました。 MS データ分析は EV サンプルと同様に行われました。

この研究では、ヒト分離株である B. ロンガム AO44 株が使用されました 16 (ブリガムアンドウィメンズ病院)。ゲノム DNA は、ZymoBIOMICS DNA Miniprep Kit (Zymo Research) を使用して抽出されました。 DNAはIllumina MiSeq PE 2x150によって配列決定され、使用されたアセンブリ方法はSPades v3.15.3でした。

小胞のプロテオーム内容の同定および定量化の質量分析は、Perseus 1.6.10.43 ソフトウェアを使用して行われました。他のすべての統計分析は Prism-GraphPad を使用して行われました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Research レポートの概要をご覧ください。

この研究で分析されたデータは、記事とその補足表ファイル内で入手できます。 B. ロンガムの全ゲノム配列は、受託番号 PRJNA908295 として GenBank に寄託されています。質量分析プロテオミクスデータは、PRIDE パートナーリポジトリ、データセット識別子 PXD038667 経由で ProteomeXchange コンソーシアムに寄託されています。追加のデータは、要求に応じて対応著者から入手できます。

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リファレンスをダウンロードする

実りある議論と貢献をしてくださった Geva-Zatorsky 研究室のメンバーに感謝いたします。校正してくれた Geva-Zatorsky 研究室の Rachel Herren に特別に感謝します。 Technion、ラパポート医学部の電子顕微鏡ユニットであるBCFチームのLihi Shaulov氏、およびラパポート医学部のフローサイトメトリーユニットであるBiomedical Core Facility (BCF)チームのAmir Grau氏に感謝します。 BD BioscienceのMarina Nudelmanとして。プロテオミクスについてはテクニオンのスモーラープロテオミクスセンターに、またナノサイトについてはテクニオンのバイオテクノロジー・食品工学部の Inna Kovrigina 教授と Marcelle Machluf 教授に感謝いたします。クライオ TEM 作業は、Technion Center for Electron Microscopy of Soft Matter で実施されました。 Neta Regev-Rudzki 教授と博士たちに心より感謝いたします。 Weizmann Institutes の Shouval 研究室の Ruthie Shouval と Meirav Pevsner-Fischer には、洞察力に富んだ議論と提案をいただきました。この研究は、テクニオン工科大学、「ケレンハナシ」、カテドラ、ラパポートテクニオン統合がんセンター、優秀な若手研究者のためのアロンフェローシップ、イスラエル科学財団 (補助金 1571/17 および 3165/20)、シーラヴェの支援を受けました。財団、イスラエルがん研究基金研究キャリア開発賞、カナダ高等研究所（CIFAR）、ヒューマンフロンティアサイエンスプログラムキャリア開発賞（助成金CDA00025/2019-C）、ガットワース財団賞、D.ダン＆ベティ賞カーン財団からミシガン大学、ワイツマン研究所、テクニオン・イスラエル工科大学の研究協力、および欧州連合への寄付 (ERC、ExtractABact、101078712)。ただし、表明された見解や意見は著者のみのものであり、必ずしも欧州連合または欧州研究評議会執行機関の見解や意見を反映しているわけではありません。欧州連合も認可当局もそれらに対して責任を負うことはできません。 NGZ は、人間とマイクロバイオームプログラムの CIFAR フェロー、Kavli フェロー、および Horev フェロー (Taub Foundation) です。 NM は RTICC-Rubinstein フェローシップによってサポートされています。 LZは日本学術振興会海外特別研究員の受入れ者です。

細胞生物学および癌科学部門、ラパポート医学部および研究研究所、ラパポートテクニオン統合がんセンター (RTICC)、テクニオンイスラエル工科大学、ハイファ、31096、イスラエル

ノア・マンデルバウム、シャケド・カラッソ、エリオット・ベリンスタイン、タル・ゲフェン、ナーマ・ゲヴァ＝ザトルスキー

ハーバード大学化学およびケミカルバイオロジー学部、ケンブリッジ、マサチューセッツ州、米国

リーハン・チャン & エミリー・P・バルスカス

Smoler Proteomics Center、Lokey Interdisciplinary Center for Life Sciences & Engineering、Technion-Israel Institute of Technology、ハイファ、3200003、イスラエル

タマル・ジヴ

化学工学部およびラッセル・ベリー・ナノテクノロジー研究所 (RBNI)、テクニオン・イスラエル工科大学、ハイファ、3200003、イスラエル

サピア・リフシズ＝サイモン、イリーナ・ダヴィドヴィッチ、イェシャヤフ・タルモン

The Shraga Segal 微生物学、免疫学、遺伝学学部、ベングリオン大学健康科学部、ベエルシェバ、84105、イスラエル

イシャイ・ライト＆トーマー・クックス

ハーバード大学ハワード・ヒューズ医学研究所、ケンブリッジ、マサチューセッツ州、米国

エミリー・P・バルスカス

人間とマイクロバイオーム、CIFAR、トロント、カナダ

ナーム・ゲヴァ・ザトルスキー

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研究の概念化: NM、TG、および NGZ、すべての実験と分析は NM と TG によって実行されました一部の実験は LZ および EB によって実行されました細菌ゲノム構築は SCTZ によって実行され、すべてのプロテオミクス分析が実行されました。 Cryo-TEM イメージングは YT、SLS、ID によって実行されました NanoSight 実験の一部は IL および TC によって実行されました研究の最初の部分の概念化は EPB、LZ、NM、TG、および NGZ によって実行されました NM による原案の作成、TG、および NGZ すべての著者が記事に貢献し、提出されたバージョンを承認しました。

ナーマ・ゲヴァ＝ザトルスキーへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

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転載と許可

Mandelbaum, N.、Zhang, L.、Carasso, S. 他グラム陽性腸共生菌ビフィドバクテリウムロンガムの細胞外小胞は、免疫調節作用、抗炎症作用を誘導します。 npj バイオフィルムマイクロバイオーム 9、30 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41522-023-00400-9

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受信日: 2022 年 12 月 5 日

受理日: 2023 年 5 月 18 日

公開日: 2023 年 6 月 3 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41522-023-00400-9

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