酵素 - 株式会社コーストワイズ・ベンチャーズ・グループ

Scientific Reports volume 13、記事番号: 312 (2023) この記事を引用

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ピリドキサール-5'-リン酸 (PLP) は、さまざまなタイプの酵素反応を助ける多用途の補因子です。 PLP は基質と反応し、酵素とは独立してこれらの反応の一部を触媒することも報告されています。そのような触媒反応の 1 つは、多価金属イオンの存在下でシステインが分解されて硫化水素 (H2S) を生成することです。しかし、多価イオンの非存在下でのシステインの異化におけるPLPの酵素非依存性の触媒活性は不明です。この研究では、PLP がシステインと反応してチアゾリジン生成物を形成することを示し、これは吸収スペクトルの量子化学計算によって裏付けられています。 PLP とシステインの反応は、イオン強度と pH に依存します。チアゾリジン生成物はゆっくりと分解して H2S を生成し、PLP はより長い反応時間 (> 24 時間) で活性型に再生します。これは、PLP が触媒として作用できることを示唆しています。我々は、PLPが触媒するシステイン分解によりH2Sが生成され、その後チアゾリジン環中間体の形成を通じて進行し、その後ゆっくりと加水分解してPLPを再生する、酵素非依存性のもっともらしい反応機構を提案する。この研究は、PLP が酵素、塩基、多価金属イオンの非存在下でシステインの分解を触媒して H2S を生成することを示しています。

1942 年にスネルらによって発見されました。ピリドキサール-5'-リン酸 (PLP) は、ビタミン B6 の代謝活性型です。これは、アミノ酸との多数の反応を触媒する酵素の最も用途の広い補因子の 1 つです1。補因子としての PLP は、すべての酵素活性のほぼ 4% に使用されます2。 PLP 依存性酵素は、アミノ酸の存在下でアミノ基転移、ラセミ化、脱炭酸、α、β、γ の置換と脱離、アルドール基転移、クライゼン縮合、そして最近では酸化的脱アミノ化を触媒します 3。興味深いことに、PLP は酵素に依存しない方法でこれらの反応の一部を触媒することもできます。アミノ基転移、α、β置換、およびアミノ酸による脱炭酸は、水溶液中でPLPおよび多価金属イオンによって非酵素的に触媒されます4、5、6、7、8、9、10、11が、進行することも報告されています。金属イオンを使用せずにゆっくりと12. たとえば、酵素の非存在下でPLPはアミノ酸とともに加熱されるとゆっくりとアミノ基転移を起こし、ピリドキサミン4を生成します。これらの研究は、PLPのアルデヒド基が活性部位として機能し、アミノ酸と容易かつ可逆的に反応してシッフ塩基を形成し、他の反応条件に応じてさらに反応して生成物を形成すると結論づけた。 PLP は酵素とは独立してこれらの生成物を生成するため、PLP と必須アミノ酸の直接相互作用を理解することが重要です。

多価金属イオンの非存在下でのシステインとの反応におけるPLPの酵素非依存性の触媒的役割はまだ調査されていない。これは、PLP とシステインの反応により、縮合を介して安定な生成物であるチアゾリジン環が形成されることが広く報告されているためです 13、14、15、16、17。初期の研究では、チアゾリジン環形成は 3 つのステップで進行すると結論付けられました。まず、PLP のアルデヒド基上のシステインからのアミン基の付加、第 2 に水を除去してアルジミン性シッフ塩基を形成、そして第 3 に閉環です (図 1A)。。チアゾリジン環は 24 時間以上安定であると報告されていますが、それ以上の研究は報告されていません 15。あるいは、システインのチオール基が PLP のアルデヒド基と反応して、ヘミメルカプタールまたはメルカプタール中間体を形成することもあります 17。興味深いことに、S-(p-置換フェニル) システインなどのシステイン誘導体が弱アルカリ性条件下で PLP と反応すると、α、β 脱離が起こり、アンモニア、ピルビン酸、S-(p-置換フェニル) 類似体が生成されます。 PLP が再生されます (図 1B)。これにより、弱アルカリ性条件下での S 置換システインの分解における PLP の触媒的役割が確認されました 18,19。

PLPとシステインの酵素非依存性化学相互作用の提案された反応機構。 (A) 塩基および金属イオンの非存在下でのPLPとシステインによるチアゾリジン環の形成機構。シッフ塩基の形成は中間段階です。 (B) 弱アルカリ性条件下での S-置換システインとの反応における PLP の触媒作用のメカニズム。 PLP は再生され、S 置換類似体、アンモニア、ピルビン酸が生成されます。

最近、Hine ら。たちは、三価金属イオンの存在下でシステインが分解されて硫化水素 (H2S) を生成する際の PLP の非酵素的役割を研究しました9。内因性 H2S は主に、PLP を補因子とするシスタチオニン-β-シンターゼ（CBS）、シスタチオニン-γ-リアーゼ（CGL）、3-メルカプトピルビン酸硫黄トランスフェラーゼ（3-MST）などの酵素によってシステインとホモシステインから生成されます20。 H2S は体にとって必須の栄養素であり、内因性酵素による H2S 産生や CBS、CGL、3-MST の活性の欠乏は、神経変性疾患を含むいくつかの健康への悪影響と関連しています 21,22。したがって、神経変性疾患の進行の原因となる潜在的な酵素欠損を救済する能力を評価するために、システイン分解におけるPLPの酵素非依存性触媒的役割を調査することが差し迫っている。

システインの代謝におけるPLPの酵素非依存性触媒的役割に関する現在の文献には、生理学的条件でのこの相互作用の研究が欠けています。塩基または多価金属イオンのいずれかの存在下でのPLPの触媒的役割は十分に確立されていますが、PLPとシステインの相互作用を全体的に理解するには、両方が存在しない場合のPLPの時間依存的な触媒挙動を決定する必要があります。したがって、この研究では、生理学的条件におけるPLPとシステインの相互作用を調査しました。 1H-NMR および UV-Vis 分光法を使用して、反応の進行をモニタリングしました。ペーパークロマトグラフィーを実行して、生成物である H2S ガスの発生を監視しました。可能性のある中間体に対して量子化学計算を実行して、それらの UV-Vis 吸収を予測し、実験データと比較しました。

システインとのPLP反応のさまざまな中間体は文献13、14、15、16、17で仮説が立てられており、これにはシッフ塩基、ヘミメルカプタール、閉環チアゾリジン構造の形成が含まれます（図2A）。これらのさまざまな潜在的な PLP-Cys 生成物は、1H-NMR および UV-Vis 分光法によって調査されました。

D2O 中の PLP と (A) システイン、(B) S-メチルシステイン (SMC)、および (C) N-アセチルシステイン (NAC) の 1:1 モル反応混合物を 37 °C で 2 時間反応させたものの 1H-NMR ズームスペクトル。シッフ塩基は、PLP と SMC の反応により形成されます。シッフ塩基のアルジミニックプロトンはδ ≈ 8 ppm で観察されます。ヘミメルカプタールは、PLP と NAC の反応により形成されます。ヘミメルカプタルのエノール性プロトンはδ ≈ 6.5 ppm で観察されます。 PLPとシステインの反応により、シッフ塩基、ヘミメルカプタール、チアゾリジン環(δ=6.05、6.10ppm)の存在が観察されます。

1H-NMR 分光法の場合、PLP とシステインを重水素水 (D2O) 中で 37 °C で 1:1 のモル比で 2 時間反応させました。 1H-NMRスペクトルの拡大版を図2Aに示します（フルスペクトルは図S1）。 PLPは、そのアルデヒド部分を通じてpH 5を超えるケト-エノール互変異性を示し、そのα-水素（4）はδ = 10.4 ppmで観察され、PLPのエノール型（4'）のそれはδ = 6.45 ppmで観察されます（図S2） )23. システインと反応した PLP は、PLP とシステインで形成されたチアゾリジン環のラセミ混合物のメチンプロトン (z) に対応するδ = 6.05 ppm および 6.10 ppm に現れる 2 つの新しいピークを示します24。 3 番目の新しいピーク (x) がδ = 8.09 ppm で観察されました。これは、PLP とシステインの間に形成されたシッフ塩基のアルジミニックプロトンに対応すると考えられます。 PLPとシステインをモル比1:10で反応させた場合、中間生成物に対応するピークは観察されず、代わりにチアゾリジン環のピークが観察されました（図S3）。アルジミニックプロトンの位置、ひいてはシッフ塩基の形成を確認するために、PLP と閉環用の遊離チオールを持たないシステイン類似体である S-メチルシステイン (SMC) を同様に反応させました。この反応により、SMCとPLPの間に形成されたシッフ塩基のアルジミニックプロトンに対応するδ = 8.05 ppmに新しいピーク（x）が生成されました（図2B、図S4のフルスペクトル）。 SMCとPLPは、反応混合物のUV-Visスペクトルにおける吸光度最大値の388 nm（通常はアルデヒド基に起因する遷移）から401 nmへのシフトによって観察されるように、反応時間2時間以内にシッフ塩基を形成します（図S5））。したがって、PLP-システイン反応のδ ≈ 8 ppm に現れるピークは、シッフ塩基構造の存在に起因すると考えられます。あるいは、システインはヘミメルカプタールの形成を通じて PLP と反応することもあります (図 2A)17。これは硫黄上の非共有電子対と PLP のエノール性プロトンとの相互作用によって可能です。小さなショルダーピーク（y）が図2Aのδ = 6.49 ppmで観察され、ヘミメルカプタルの形成の可能性を示唆しています。ヘミメルカプタールの形成を確認するために、PLP とヘミメルカプタール形成のための遊離チオールを持つがシッフ塩基形成のための遊離アミンを持たないシステイン類似体である N-アセチルシステイン (NAC) を反応させたところ、δ に 1 つの新しいピーク (y) が観察されました。 = 6.47 ppm。これは、NAC と PLP の間で形成されるヘミメルカプタールのエノール性プロトンに対応します (図 2C、図 S6 のフルスペクトル)。 NACとPLPを2時間反応させた後、UV-Visスペクトルの388 nmのPLPピークの強度の変化は観察されませんでした（図S7）。 NAC からの二級アミンがδ = 6.47 ppm で新しいピークを生成するシッフ塩基を形成しないことを確認するために、PLP と遊離アミンまたはチオールを含まないシステイン類似体である N-アセチルメチオニン (NAM) を反応させましたが、その後新しいピークは観察されませんでした。 2時間の反応により、δ ≈ 6.47 ppmのヘミメルカプタルプロトンの位置が確認されました（図S8）。これらの観察に基づいて、水中でのシステインとPLPの反応により、チアゾリジン環構造、シッフ塩基、およびヘミメルカプタールの3つの生成物すべてが形成されると提案できます。

イオン強度および温度の生理学的条件におけるPLPとシステインの相互作用は、吸収分光法で測定されました。 PLP とシステインをリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 中で 37 °C で 2 時間反応させました。実験から潜在的な反応生成物を決定するために、潜在的な生成物のUV-Visスペクトルがハイブリッド密度汎関数理論を使用して計算的に計算されました（図S9の構造のxyz座標）。

計算された PLP 吸収スペクトル (図 3A) は、228 nm と 392 nm に主なピークを持つ UV 範囲の強い光学応答によって特徴付けられます。強度の低いピークが 205 nm と 250 nm に現れます。 PLPのHOMO-LUMO遷移は、リン酸基から芳香族基への電子密度の移動に対応して、2.33 eVまたは532 nmと計算されます（図S10A）。注目のピーク (392 nm) では、自然遷移軌道は芳香族グループ内の電子密度状態の再分布を示しています (図 3A)。 PBS 中の PLP 溶液の実験スペクトルは、225 nm と 388 nm に 2 つの主要なピークを示し、計算されたスペクトルとよく一致します (図 3A)。実験スペクトルには 328 nm にショルダーピークもありますが、これは計算スペクトルには存在しません。この追加のピークは、PLP25、26、27 の追加の両性イオン平衡状態に起因すると考えられます。ショルダーピークに加えて、実験スペクトルは計算でよく再現されます。 PLPはpH 5を超えるとアルデヒド部分を通じてケト-エノール互変異性を示す可能性があるため、PLPのエノール型のUV-Visスペクトルも計算されました（図S11）。計算されたスペクトルには、451 nm、290 nm、および 223 nm に主なピークがあります。計算されたピークは実験データと一致しないため、PLP はイオン強度と温度の生理学的条件ではアルデヒドの形としてのみ存在することが示唆されます。

(A) PLP、(B) PLP-システインシッフ塩基、(C) PLP-システインチアゾリジン環構造の実験吸収スペクトル (実線) と計算吸収スペクトル (青色の破線) の比較。各パネルの左側は分子構造を示し、各パネルの右側は対象のピークにおける自然遷移軌道を示します。 PLP の実験スペクトルは計算スペクトルとよく一致します。 PBS 中で 2 時間後の PLP-システイン反応の実験スペクトルは、チアゾリジン構造の形成と一致しますが、シッフ塩基とは一致しません。

PLP-Cys シッフ塩基の計算された吸収スペクトル (図 3B) は、441 nm と 387 nm に主要なピークを示し、これらが合わさって 428 nm にガウスピークを生成します。 201 ～ 262 nm の範囲にあるいくつかのそれほど強度の低いピークにより、203 nm の幅広いガウスピークが強調されます。 PLP-Cysシッフ塩基構造のHOMO-LUMO遷移は、リン酸基から芳香族基およびシステインに接続されたシッフ塩基への電子密度の移動に対応して、1.46 eVまたは849 nmであると計算されます（図S10B）。注目のピーク (441 nm) では、自然遷移軌道は芳香族基内の電子密度状態の再分布と、カルボン酸基からアルジミン構造への転移を示しています (図 3B)。同様に、PLP-Cys チアゾリジン構造の計算された吸収スペクトル (図 3C) は、333 nm と 212 nm に主要なピークを示します。 204 ～ 220 nm の範囲にある強度の弱いピークがいくつかあり、210 nm の幅広いガウスピークが強調されます。 PLP-Cysチアゾリジン構造のHOMO-LUMO遷移は、リン酸基から芳香族およびチオフェン基への電子密度の移動に対応して、2.49 eVまたは497 nmと計算されます（図S10C）。注目のピーク (333 nm) では、自然遷移軌道は芳香族基内の電子密度状態の再分布とチオフェン基への転移を示しています (図 3C)。

PBS 中の PLP システイン混合物の実験スペクトルは、220 nm のショルダーピークを伴う 203 nm の広いピークと、294 nm のショルダーピークを伴う 333 nm の 2 番目の主要なピークを示します。 333 nm にピークが存在し、400 nm を超える吸収が存在しないことは、PLP とシステインがシッフ塩基を形成していないか、シッフ塩基が不安定で急速に環化して環を形成していることを示唆しています。興味深いことに、実験データは計算された PLP-Cys チアゾリジン吸収スペクトルと一致します。 294 nm のショルダーピークは予測されておらず、PLP の両性イオン平衡状態のシフトに起因すると考えられます。

1H-NMR および UV-Vis 分光法の結果と計算された吸収スペクトルにより、PLP-Cys 反応によるチアゾリジン環の存在が確認されます。同様に、ヘミメルカプタールの形成は 1 H-NMR 分光法によって裏付けられています。ただし、シッフ塩基アルジミニック構造は、溶媒が D2O である NMR 分光法では観察されるが、溶媒が PBS である UV-Vis 分光法では観察されないことに注目するのは興味深いことです。これは、反応物質の濃度、溶媒のイオン強度、またはシッフ塩基が不安定で急速に環化してチアゾリジン環を形成する pH の違いによるものである可能性があります 17。 10 mM 未満の PLP 濃度は 1H-NMR スペクトルで検出できず、0.1 mM を超える濃度では、対象のピークである 388 nm の UV-Vis シグナルが飽和するため、さまざまな濃度の PLP が使用されました。 PLP とシステインの間のさまざまな中間体の形成を検証するために、脱イオン水および PBS 中の PLP とシステインの反応混合物を LC/MS で分析しました。 PLP-Cys シッフ塩基、チアゾリジン環、およびヘミメルカプタールと一致する質量の中間イオンが非常に少量存在することが観察されました（図S12）。 PLP-Cys シッフ塩基のシグナルは、コントロールよりも有意に高くはありませんでした。これらの中間体の存在は NMR および UV-Vis 分光法と一致していますが、検出された LC/MS シグナルはこれらの中間体の形成を確認できるほど強力ではなかったことに注意する必要があります。特に移動相が酸性であるため、中間体は MS 分析中にカラムまたは気相で安定していない可能性があります: 0.1% ギ酸 (水中 95%、アセトニトリル中 5%)。

PLP とシステインの時間依存性相互作用は、UV-Vis 分光法を使用して研究されました。 PLPとシステインをPBS中で37℃、モル比1:10で14日間反応させた。反応をモニターするためにそれらの吸光度スペクトルが得られました (図 4A)。上で論じたように、pH = 7.2 での PLP の吸光度スペクトルは 388 nm で最大値を示します 28。システインの添加後、388 nm での吸収は直ちに減少し、ヘミメルカプタールおよびチアゾリジン構造の形成が示唆されます 17。このピークは 2 時間で完全に消失します。これは、PLP のアルデヒド基がシステインと完全に反応し、333 nm でピークの増加が観察されるチアゾリジン環を形成したことを示唆しています。 UV-Vis スペクトルは、反応時間が 24 時間になるまで同じ傾向を示し、チアゾリジン環の吸収が強くなります。これは文献と一致しています 15。しかし、24 時間後には、PLP のアルデヒド基に対応する小さなピークが 388 nm に現れます。 388 nm のピークの強度は時間とともに (7 日および 14 日) 増加し、同時に 333 nm のチアゾリジンのピークが減少します。この逆転は、チアゾリジン環が変換されて PLP 形態に戻っていることを示唆しています。 S-(p-置換フェニル)システインを弱アルカリ性条件下でPLPと反応させてPLP18を再生すると、副生成物としてS-(p-置換フェニル)類似体が観察されました。したがって、我々は、PLP が金属イオンの非存在下でシステインを異化して硫化水素 (H2S) を形成するための弱い触媒として機能すると提案します。

(A) 0 時間、2 時間、24 時間、および 14 日目に監視された生理学的条件における PLP とシステインの間の化学相互作用の UV-Vis スペクトル。 (B) 脱イオン水、PBS の各成分、および 37 °C、24 時間における PBS 中の PLP とシステインの反応による H2S 生成。 PBS では、脱イオン水の 9 倍の H2S 生成量が発生します。

PLP がシステインの分解を触媒して H2S を生成する能力を検証するために、ペーパークロマトグラフィー (酢酸鉛分析) を実行し、副生成物の 1 つとして H2S ガスの生成を検出しました。生理的 pH 29、30 では、生成される H2S の 20% 未満が気相にあることに注意する必要があります。 PBS中での生理学的条件でのPLPとシステインの反応により、24時間でほぼ70μMのH2Sが生成されました（図4B）。 PLPの非存在下ではH2S生成は観察されませんでした（図S13A）。興味深いことに、反応を脱イオン (DI) 水中で実行した場合、H2S 発生は 8.8 μM でした (図 4B)。 PBS は pH 7.4 で、137 mM 塩化ナトリウム (NaCl)、2.7 mM 塩化カリウム (KCl)、8 mM リン酸水素二ナトリウム (Na2HPO4)、および 2 mM リン酸二水素カリウム (KH2PO4) で構成されます。各塩の存在下での PLP とシステインの反応により、24 時間以内に 137 mM NaCl でほぼ 7.6 μM の H2S、8 mM Na2HPO4 で 58.9 μM の H2S、および 2 mM KH2PO4 で 11.1 μM の H2S が生成されました。これらの結果は、PBS 中の Na2HPO4 の存在が H2S 生成の主な原因であることを示唆しています。これは、水中の Na2HPO4 が中程度の塩基性 (pH 8.86) であり、水酸化物イオンを放出してリン酸を形成するためである可能性があります。放出された水酸化物イオンは、PLP-Cys シッフ塩基 (図 5 で説明) から α プロトンを抽出し、反応を推進して H2S を生成する際の塩基として機能する可能性があります。 PLP 触媒によるシステイン分解は塩基性培地中で加速されるため 18、弱アルカリ性条件の存在下では H2S 生成が増加すると予想されます。さらに、アルカリ性条件のPLP溶液は、脱イオン水中のPLP溶液と比較して、PBS中のPLP溶液で見られるように、より深い黄色を示します（図S13B）28。

酵素非依存性のPLP触媒によるシステインの分解により、金属の非存在下で生理学的条件下でH2Sが生成されるという、もっともらしい反応機構が提案された。

14 日間の反応時間の後、333 nm でのチアゾリジン基の吸光度ピークは減少し、388 nm でのアルデヒド基の吸光度ピークは比例して増加します。これは、PLP が生理学的条件で H2S を生成するとともに、ゆっくりと再生して触媒として機能することができることを示唆しています。これらの結果は、PLP が生理学的条件下でシステインを分解して H2S を生成する触媒として機能できることを示しています。最も重要なことは、(i) 酵素、(ii) 塩基、および (iii) 金属イオンの非存在下で PLP がシステインの分解を触媒して H2S を生成することを初めて示したことです。

私たちの結果と文献に基づいて、図 5 に示すように、PLP が PBS 中でシステインを分解して H2S を生成する、もっともらしい反応機構を提案します。PLP とシステインの反応は 2 時間以内に完了してチアゾリジン環を形成するため、 H2S 生成経路は、開環機構を通過する必要があります。酵素、塩基、金属イオンが存在しない場合、加水分解によりチアゾリジン環が開く可能性があります (図 S14)31。図5に示すように、環の加水分解は、Iの正に帯電した窒素基に対する水の攻撃によって進行し、IIの環上の硫黄を攻撃するヒドロニウムイオンを生成し、開環を引き起こし、おそらくシッフ塩基を形成する可能性があります。 Ⅲ．シッフ塩基は非常に不安定であるため17、水分子または弱塩基がIIIのシステインの活性化メチンからαプロトンを引き抜き、ヒドロニウムイオンとキノノイド構造IVを生成する可能性があります。このキノノイド構造は、チオール基の β 脱離によって V を形成し、H2S を生成することでそれ自体を安定化できます。形成された構造 V は分解してアンモニアとピルビン酸を形成し、PLP VI を再生します。これらの反応中間体または副生成物は 1H-NMR または UV-Vis 分光法では観察されなかったため、さらなる調査が必要です。

我々は、PLPが(i)酵素、(ii)塩基、および(iii)金属イオンの非存在下でシステインの分解を触媒し、生理学的条件でH2Sを生成することを初めて示した。 PLP はシステインと完全に反応し、反応後 2 時間以内にチアゾリジン環を形成します。環形成は 1H-NMR および UV-Vis 分光法で観察されました。計算によって得られた UV-Vis スペクトルは、PLP とシステインの間のチアゾリジン環構造の形成を確認するのに役立ちました。システインとPLPの間のシッフ塩基およびヘミメルカプタル形成の直接観察はこれまでに報告されていない。チアゾリジン環はゆっくりと分解して、24 時間以内に 70 µM の H2S を生成します。興味深いことに、脱イオン水では生成される H2S の量が少なく (8.8 μM)、イオン強度と pH が支配的な役割を果たしていることが示唆されました。 24 時間を超えると、PLP の再生の証拠が UV-Vis 分光法で観察されます。これは、PLP が生理学的条件で H2S を生成するとともに、ゆっくりと再生して触媒として機能することができることを示唆しています。提供された分光学的証拠と計算的証拠に基づいて、PLP 触媒のもっともらしい反応機構が提案されました。酵素非依存性 PLP 触媒作用のこの化学的研究は、身体にとって必須の栄養素である H2S の生成における生物学的関連性から重要であり、その内因性欠乏はいくつかの健康への悪影響と関連しています。

ピリドキサール-5'-リン酸水和物 (PLP)、L-システイン (Cys)、リン酸水素二ナトリウム (Na2HPO4)、およびリン酸二水素カリウム (KH2PO4) は、Alfa Aesar (MA, USA) から入手しました。酸化重水素 (D2O)、N-アセチルシステイン (NAC)、N-アセチルメチオニン (NAM)、塩化ナトリウム (NaCl)、および酢酸鉛 (II) 三水和物は、Sigma-Aldrich (ミズーリ州、米国) から入手しました。 S-メチルシステイン (SMC) は TCI America (オレゴン州、米国) から入手しました。すべての化学薬品はさらに精製せずに使用しました。

核磁気共鳴 (NMR) 分光法 D2O 中の 20 mM PLP と 20 mM Cys を NMR チューブ内で混合し、37 °C のインキュベーター内に置きました。 1H-NMR分光法を使用して反応生成物をモニタリングした。 Bruker 400 MHz 分光計 (米国マサチューセッツ州) を使用して、D2O 中の 1H-NMR スペクトルを 16 回のスキャンで記録しました。同様の実験を、それぞれ２０ｍＭＰＬＰおよび２０ｍＭＳＭＣ、２０ｍＭＮＡＣ、２０ｍＭＮＡＭを使用して実施し、それらの反応生成物をモニタリングした。

UV-Vis 分光法 37 °C に予熱した PBS (pH = 7.2) 中の 0.1 mM PLP と 1 mM Cys を石英キュベット内で混合しました。反応生成物の基底状態吸収スペクトルは、Perkin Elmer Lambda 1050 UV-Vis-NIR 分光光度計 (マサチューセッツ州ウォルサム) と 37 °C の温度制御キュベットホルダーを使用して取得しました。

H2S 測定のためのペーパークロマトグラフィーアッセイ脱イオン水中の 1 mM PLP および 10 mM Cys を、96 ウェルポリプロピレンプレート内で、37 °C のインキュベーター内で 24 時間反応させました。同様の実験を、137 mM NaCl、8 mM Na2HPO4、2 mM KHPO4、および PBS で調製した反応物を用いて実行しました。反応から発生したガス状 H2S は、酢酸鉛紙分析を使用して定量されました。酢酸鉛紙の分析とその分析は、以前に報告されているように実行されました 32。

PLP-システイン相互作用に関する計算研究この研究のすべての計算は、密度汎関数理論 (DFT) とハイブリッド B3LYP 汎関数 34、35、36、37 を使用して、General Atomic and Molecular Electronic Structure System (GAMESS) 2018-R1 コード 33 を使用して実行されました。すべての計算には、溶媒として水を使用した標準的な分極性連続体モデル (PCM) が使用されました。分子の初期デカルト座標は Avogadro (オープンソースの分子ビルダーおよび視覚化ツール) を使用して取得され 38、基底状態の分子構造は 6-311G(d, p) 基底関数セットを使用して最適化されました。形状が最適化された分子の時間依存密度汎関数理論 (TDDFT) 計算は、閉殻制限ハートリー・フォック (RHF) 波動関数を使用して実行されました。自然遷移軌道、波長 (励起エネルギー) の関数として発振器の強度を表すスペクトル、およびガウス広がり (半値全幅 0.08 eV) によって得られた曲線は、Chemissian ソフトウェアで取得されました。

液体クロマトグラフィー質量分析法液体クロマトグラフィー質量分析法 (LC-MS) は、ラーナー研究所のプロテオミクスおよびメタボロミクスの中核施設で実施されました。逆相クロマトグラフィーを使用した非ターゲットメタボロミクスは、Thermo に接続された 60 °C で寸法 100 × 2.1 mm、粒子サイズ 1.5 μm の Thermo Accucore Vanquish C18 カラムに各サンプル 4 μL を注入して実行されました。移動相 A が水中の 0.1% ギ酸であり、移動相 B がアセトニトリル中の 0.1% ギ酸である、勾配溶出による Vanquish UHPLC。 Orbitrap Q Exactive HF は、分解能 120,000 の MS1 によるターゲット選択イオンモニタリング (t-SIM) を使用して、56 ～ 850 Da の質量範囲にわたる異なる LC-MS 実行で正および負のエレクトロスプレーイオン化モードで動作しました。

著者らは、この研究の結果を裏付ける他のすべてのデータが論文および補足情報内で入手可能であることを宣言します。

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著者らは、Puzzitelio Family Foundation、Barney Family Foundation、Center for Transformative Nanomedicine、および Lerner Research Institute からのシード資金からの資金援助に感謝しています。 CC は、ケースウェスタンリザーブ大学からの学部研究と創造的取り組みのサポートによって部分的に支援されました。著者らは、PLP-システイン混合物の LC-MS 分析について、クリーブランドクリニックのメタボロームコアのベリンダウィラード博士とレベッカウィリアムズ博士に感謝します。著者らはまた、LC-MS 分析用のサンプルを準備してくれた Alan Chen に感謝します。ここに記載されている意見、調査結果、結論、または推奨事項は著者のものであり、必ずしも資金提供機関の見解を反映しているわけではありません。

生体医工学部、ラーナー研究所、クリーブランドクリニック、クリーブランド、オハイオ州、44195、米国

プラジャカッタ・ムーレー、シンディ・チェン、ヴィジェイ・クリシュナ

生物医工学部、クリーブランドクリニックラーナー医科大学、ケースウェスタンリザーブ大学、クリーブランド、オハイオ州、44106、米国

ヴィジェイ・クリシュナ

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PM、CC、VK がアイデアを考案し、実験を設計し、データを分析しました。 CC と PM は、UV-Vis 分光法と酢酸鉛/硫化鉛の実験を実施しました。 PMはNMR実験と解析を実施した。 VK は量子化学計算を実行しました。 PM、CC、VK が原稿を書きました。

ヴィジェイ・クリシュナへの通信。

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転載と許可

Mulay, P.、Chen, C. & Krishna, V. ピリドキサール-5'-リン酸によるシステインの酵素非依存性異化。 Sci Rep 13、312 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-022-26966-6

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受信日: 2022 年 8 月 5 日

受理日: 2022 年 12 月 22 日

公開日: 2023 年 1 月 6 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-26966-6

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下呂サイエンス (2023)

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