三元系シクロデキストリンの開発

Communications Biology volume 5、記事番号: 1234 (2022) この記事を引用

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臨床的に検証された古い抗生物質に有用な機能を設計することは、間違いなく深刻な健康上の脅威である有効な抗生物質の世界的な不足に対して最も経済的な解決策を提供することを約束します。 今回我々は、シクロデキストリン (βCD) サイクルとリンカーとしてアルギニン (arg) の表面化学を使用すると、より安定な三成分系抗生物質複合体 (βCD-arg-cpx) が得られることを示します。 抗生物質の溶解度を変えるだけの古典的な安定性の低い包接複合体とは対照的に、ここで提示した三元複合体はより安定であり、薬物放出を制御します。 複合体の成分は細菌膜との相互作用を強化し、細菌細胞内での薬物の利用可能性を高め、それによって抗菌効果と安全性プロフィールを向上させます。 薬物を作用部位に運び、その有効性を最大化し、光学的検出可能性を提供する、薬物送達システム自体として製剤化された多機能抗生物質は、感染症との戦いにおける将来として構想されている。 多耐性株に対するツールとしてのそれらの役割は、さらなる研究の余地がある興味深い課題として残っています。

世界保健機関が最近指摘したように、有効な抗菌薬の減少は現代世界における世界の健康に非常に深刻な脅威をもたらしています1。 過去数十年間に市場に出回った新規の抗生物質はわずかであり、1980 年以降まったく新しい種類の抗生物質は発見されていません2。莫大な費用と予測不可能で短期的な効果があるため、新しい抗生物質の発見は世界にとって主要な優先事項ではありません。製薬産業2、3。 臨床的に承認された医薬品の転用、再プロファイリング、または再利用には、特にパンデミックなどの新たな状況において、新薬候補を発見するよりも時間とコストの点で重要な利点があります4,5。 重要な利点は、とりわけ、予測可能な安全性プロファイル、製造手順に関する事前の知識、確立された試験プロトコル、より単純な規制要件、ベンチから市場までの期間の短縮です6、7。 したがって、過去 10 年間に承認された医薬品の約 3 分の 1 が古い医薬品の再利用であり、製薬業界の収益の 25% を占めていることは驚くべきことではありません 7,8。 現在の前臨床抗生物質パイプラインにおける取り組みの多くは、古い抗生物質を改変して有効性を高めること、特に他の薬剤や補助的な非薬剤成分との相乗効果に焦点を当てています9,10。 これを達成する上での主な科学的課題は、高用量治療に伴う浸透、排出、毒性の制限です9,10。

古い抗生物質を再設計するためのシンプルかつ非常に効果的なアプローチには、溶解性、安定性、生物学的利用能、透過性などの特性を変更する不安定な複合体の形成が含まれ、それによって治療結果に直接影響を与えます。 この文脈では、シクロデキストリン (CD) が特に適用可能です 11,12。 円錐台構造を持ち、親水性シェル (β-CD の場合、円錐の狭い端に向かって 7 つの一次基、広い端に向かって 14 個の二次糖ヒドロキシル基を有する) と疎水性コア ( β-CD の構造を構成する 7 つのグルコピラノース単位の炭素骨格）、薬物分子との相互作用に利用できます 11、13、14。 最も一般的には、抗生物質は薬物の疎水性部分が CD の疎水性内部コア領域と相互作用するときに包接複合体として製剤化され、その結果溶解度が数倍増加します 11。 このアプローチはさまざまな抗生物質 (β-ラクタム、ミクロライド、フルオロキノロン、スルホンアミド、テトラサイクリン、およびアミノグリコシド) に適用されており、それらの最小発育阻止濃度 (MIC) は 2 倍から 10011 以上に減少しました。このプロセスでは、ホスト-ゲスト CD-薬物複合体は化学結合を持たずに遊離薬物と平衡状態にあります12。 このアプローチは、CD 賦形剤を特別に選択された補助成分 (親水性ポリマー、アミノ酸、ヒドロキシル酸など) と組み合わせて三元複合体を形成するとさらに効果的になります 15、16、17、18。 薬物の疎水性部分はCD-薬物包接複合体を形成し、同時に親水性部分は補助成分との酸塩基反応を受けて塩を形成します。

良い例は、CD16、17、18と複合体を形成した酸性薬物（ナプロキセン、ゾロプロフェン、オキサプロジンなど）と塩を形成する塩基性アミノ酸であるアルギニンです。 その結果、安定性定数と錯体形成効率の重要な増加が得られます。 したがって、抗生物質を CD およびアルギニンと組み合わせて三元複合体を形成すると、その抗菌活性に大きな影響を与える可能性があると予想されます。 しかし、このような複合体に関する研究はこれまでにわずか数件しか行われておらず、その中でセフロキシムに関する研究では、CD およびアルギニンとの三成分複合体形成後に溶解度が大幅に増加することが示されています 19。

薬物の溶解度を高めるために通常形成される安定性の低い包接複合体の代わりに、シプロフロキサシン (cpx) が親水性表面に結合した、より安定な抗生物質三元系 β-シクロデキストリン-アルギニン-シプロフロキサシン (βCD-arg-cpx) 複合体を設計しました。アルギニン (arg) リンカーを介した βCD。 このアプローチでは、私たちの目標は、通常のように単に薬物の溶解度を高めることではありませんでした。 ここで、私たちが合成した複合システムは、重要なことに、抗生物質の放出を制御するためにより安定しており、細菌の細胞壁および膜との相互作用の強化を可能にし、細菌内部でのより高い透過性と利用可能性を提供し、その結果、抗菌治療の有効性を向上させます。 抗菌効果の向上に加えて、安全性プロファイルの大幅な向上が実証されました。

βCD-arg-cpx複合体は、数マイクロメートルの長さのロッド（図1b）としてよく組織化された3D構造（図1a）を形成し（図1b）、横方向に接続された厚さ数十ナノメートルのプレートで構成される高度に規則正しい放射状構造を形成します（図1a）。 1c)。 単一プレートとそれに関連する電子回折パターン（図1d）を詳しく見ると、それらが単結晶であることがわかります。 形態学的には、これらの集合体はβCD-cpxとは異なり、βCD-arg複合体は不規則な形状の集合していない粒子として検出されました（図1e〜g）。

arg-cpx 結晶コアと表面の βCD を備えた構造の図 (a)。 鋭いナノ厚エッジ（c）を備えた、βCD-arg-cpx 複合体の長く整列した棒状構造（b）を示す SEM 形態。 βCD-arg-cpx ロッドの高倍率 TEM 画像 (d) およびその結晶性を示す EDS パターン ((d) に挿入)。 βCD-arg-cpx (e)、βCD-cpx (f)、および βCD-arg (g) 間の違いを明らかにする TEM 構造。

単一ロッドβCD-arg-cpx複合体（図2a1）の元素マッピングにより、C（図2a2）、F（図2a3）、N（図2a4）、およびO（図2a5）元素が軸に沿って均一に分布していることが検出されました。結晶の広い面積。 さらに、Arイオンによるソフトエッチングの前後に、cpx薬物リファレンスおよびβCD-arg-cpx複合体について表面組成XPS分析を実行しました。 Nは抗生物質とアルギニンの両方に存在します(CDには存在しません)が、Fはcpxにのみ存在するため、cpxと比較して複合体中のN/F比が高いのはアルギニン結合によるものです。 一方、βCD-arg-cpx 複合体の表面からバルクまでの C/F 比および O/F 比の減少により、表面での βCD が確認されました。 cpx の F 側は錯体形成に含まれていないため、F1s スペクトルの 687.5 eV の最大値（CF 結合に相当）20 は、調査した 3 つのシステムすべてで変化しません（図 2b2）。 一方、N1（401.1 eVと399.7 eVに2つの最大値があり、CNCおよびC-NH結合に対応20、図2b4）は、アルギニンの結合により、複合体中の主アミンの割合が増加し、その後cpxフリーの薬物中に占める割合が増加していることを示しています。一部。 それらの増加は、複合体のバルク領域で観察されます。 C1s スペクトル (それぞれ C=O、CN、CC に対応する 287 eV、285.8 eV、284.8 eV に最大値)20 および O1s (533.1 eV および 531.5 eV に最大値、CO および (C=O)- に対応) OH、それぞれ)20) は、複合体形成への関与による、遊離 cpx 参照と比較して、複合体中の CO および CN 基に属する最大値の強度の減少を示しています。

STEM 画像 (a1) と元素マッピング分析。炭素 (C) (a2)、酸素 (O) (a3)、窒素 (N) (a4)、フッ素 (F) (a5) に対応します。 βCD-arg-cpx 複合体の表面とバルク (ソフト エッチング後に取得) の XPS 分析と、元の cpx 基準との比較 - C1s (b1)、F1s (b2)、O1s (b3)、および N1s (b4) の高分解能スペクトル。

高アスペクト比のβCD-arg-cpx複合体アセンブリは、鋭い多結晶回折極大によって示されるように、高度に結晶性です（補足図1a）。 検出された結晶構造は、基本的な脱プロトン化された cpx (参考文献 21 で観察されたもの) の構造と類似しており、回折極大がシフトし、新しいピークが出現しています。 また、βCD-NaOH-cpx 複合体（arg を NaOH に置き換えることによって沈殿した参照）で検出された構造ともわずかに異なり、arg-cpx（シプロフロキサシン - アルギニン塩に対応する参照）の構造と正確に一致します（補足図）。 1a) これは、cpx と arg の間の酸塩基性反応、塩の形成とその結晶化から生じます。 対照的に、βCD-cpxおよびβCD-arg複合体凝集体内の分離されたcpxおよびarg成分の結晶化は低く、強度が低く、回折極大が広くなります（補足図1a）。 アセンブリが存在しないため、これらの構造の結晶秩序は著しく低下します。 したがって、βCD-arg-cpx の結晶部分は、結晶表面に会合した非晶質 βCD 成分を有する arg-cpx 塩から構成されていました。

異なる種類の複合体間の大きな構造の違いは、特にFTIRスペクトルで観察できました（補足図1b）。 包接βCD-arg複合体のFTIRスペクトル（補足図1b）は、3300 cm -1 での幅広いOH伸縮と1640 cm -1 でのOH屈曲、2925 cm -1 でのCH伸縮、およびリング振動を伴う典型的なβCDバンドを示しました。 1152 cm-1、1026 cm-1、および932 cm-1 17、22、23での非対称COCおよびCC伸縮としてのバンド、および1554 cm-1でのアルギニンからのグアニジンCN伸縮モード（補足図2の詳細） 24. βCD からの OH 伸縮モードと曲げモードの強度は βCD-arg スペクトルで変化しましたが、追加のバンドは観察されませんでした（補足図 2）。 βCD-cpx 複合体では、包接複合体に典型的な、βCD コーン内部への分子の組み込みにより得られる cpx と βCD の芳香環振動に対応するバンドのわずかな位置シフトが観察されました (補足図 3)25。 、26。 さらに、1708 cm-1 の cpx のカルボキシル C=O 振動バンドは、中性の分子形態を示しました 25,26。 βCD-cpx複合体は追加のバンドを示さなかった（補足図3）。

βCD-arg-cpx複合体では完全に異なる状況が観察されました（補足図1b）。 βCD-cpx および βCD、arg、および cpx 成分の物理的混合物でも 1708 cm-1 で検出される伸縮カルボニル C=O 振動モードは、両方の複合体、βCD-arg-cpx および βCD-NaOH- のスペクトルでは欠落しています。 cpx、一方、錯体の非対称カルボン酸振動（物理的混合物とβCD-cpxの場合には欠落していた）は1578 cm-1に現れ、どちらもβCD-arg-cpxおよびβCD-NaOH-cpx内で両性イオンcpxの形態を示しています（補足図2、3）。 3およびS4）。 包接錯体 βCD-cpx のスペクトルおよび錯体からの成分の物理的混合物のスペクトルとは対照的に、βCD-arg-cpx では、3526 cm-1 の cpx OH 伸縮振動が欠落しており、脱プロトン化のもう 1 つの兆候です。複合体内で形成されます。 さらに、以前の複合体で観察された典型的な振動バンドが、より高い強度、変化した強度比、およびより高い分解能で βCD-arg-cpx のスペクトルに現れました。これは、構造秩序と結晶化度の増加を示しています（を含む配合物中のカルボニル基の振動で観察されるように）半結晶質（cpx）26． 新しい振動バンドが、特に指紋領域で検出されました（補足図4）。これは、複合体の個別の成分のいずれにも属さず（個別に、およびそれらの物理的混合物中に）、新しい複合構造の結果でした。 興味深いことに、βCD-arg-cpx で得られた新しいバンドのほとんどが、アルギニンまたは NaOH を使用して同じ pH に調整した arg-cpx と βCD-NaOH-cpx でも検出され、同様の構造がさらに確認されました。これら 2 つの酸性度調節剤を使用して形成される複合体。 しかし、βCD-arg-cpx内のアルギニンの存在は、βCDサイクルリング振動に影響を与え、1079および996cm-1でのβCDに典型的な振動の欠如として観察され、1178cm-1の新しいバンドを通じて追加の振動自由度が検出された。 、βCD-NaOH-cpxでは検出されませんでした。 βCD-arg-cpx 内のこれらの新しい相互作用は、より優れた複合体の安定性の源となる可能性がありますが、これについては後で示します。 βCD 複合体の光学的特性を研究することで、その構造的特徴をさらに洞察することが可能になりました。 βCD-arg-cpx および arg-cpx 複合体の蛍光発光スペクトル（補足図1c）は、βCD成分がarg-cpx塩に結合した場合に深色シフトを示しました。 βCDがβCD-arg-cpxまたはβCD-NaOH-cpx複合体に結合した場合、両方のケースでシフトが観察されました（補足図1c）。 この観察により、間接的に、脱プロトン化された cpx 結晶の上部にこの非晶質成分が存在することが確認され (XRD で検出され、さらに FTIR で明らかになった)、結合位置の証拠が得られました。 観察された蛍光は、ピペラジニル電子供与体および 4-オキソキノリン-3-カルボン酸電子受容体基を有する抗生物質分子に帰属されました27。 同様に、この場合、cpx は arg を介して、電子供与体の性質を持つピペラジニル基を介して βCD に結合します。 アルギニンリンカーを介してcpx分子をβCDに（またはβCD分子に直接）結合すると、その分子内運動が制限され、非放射緩和が排除され、遊離薬物形態と比較してシフトしたλmaxでの蛍光が可能になります。

pHとゼータ電位をモニタリングし、pH調整剤としてargをNaOHに置き換えることで、複合体形成に向けた重要なステップが明らかになりました（図3）。 最初、反応混合物のpH 7.5は、βCDが利用可能なOH基を持ち、argはグアニジンと脱プロトン化されたカルボキシル基にカチオン電荷を持つ両性イオンの形であり、cpxはピペラジニルと脱プロトン化されたカルボキシル基にカチオン性アミンを持っています（図1に示すように）。 .3a)。 βCD-arg-Cpx複合体の形成は、argのカルボキシル基がピペラジニルcpx側のカチオン性アミンと相互作用してarg-cpx塩を形成する酸ベースの反応から始まります（図3b）。 沈殿結晶化ステップにより、長いロッド構造の形成が可能になります。 形成された結晶の表面には、非晶質βCD成分を結合し、最終的なCD-arg-Cpx複合体を組み立てるために利用できる遊離のグアニジン基があります（図3b）。 アルギニンのグアニジン官能基のアミンは水素結合に対して非常に高い親和性を持ち、プロトン化アミンとプロトン化されていないアミンの両方が関与する最大 5 つの結合を形成する可能性があります 28。 したがって、形成された複合体では、アルギニンはリンカーの役割を果たし、カチオン性グアニジン基を使用してβCDを表面に結合し、イオン性カルボキシル基を使用してcpxを結合します。 βCDのゼータ電位（最初はpH = 6）は、アルギニンの添加後に変化します（図3の表）。これは、カチオン性グアニジン主鎖基とβCDの親水性外側のOH基との間の相互作用を示しています。

沈殿前の前駆体混合物の分子構造 (pH 7.5)、さまざまな複合体成分に対するゼータ電位の変化、およびアルギニンで pH 調整した場合の 2 時間混合後の沈殿 (およびアルギニンを NaOH に置き換えた場合の遅延 (βCD-NaOH- cpx)) (a)。 arg-cpx 塩の形成と βCD 結合を伴う沈殿 (pH 6.5)、その後の結晶化と集合 (b)。

形成された CD-arg-cpx 複合体構造は、すべての成分を混合した後 2 時間以内に光沢のある乳白色の沈殿として現れます。 アルギニンを添加せずにβCDをcpxと直接混合すると、溶液は沈殿せずに透明のままになります。 凍結乾燥粉末のゼータ電位を測定すると、不安定な βCD-cpx 複合体凝集体に対応する中性の値が得られます。 先に観察したように、βCD-cpx 包接複合体は、cpx 分子の疎水性 4-オキソキノリン-3-カルボン酸部分を βCD29 の疎水性コーン内に組み込むことによって形成されます。 (アルギニンの代わりに) NaOH を使用して最初の反応混合物の酸性度を調整した場合、arg を含まない複合体としての βCD-NaOH-cpx の沈殿ははるかに遅く、例のように 2 時間混合しても沈殿しませんでした。 βCD-arg-cpx の場合（図 3a の写真に示されています）、しかし、その後 24 時間遅れました。 βCD-NaOH-cpx は、pH 調整された βCD-cpx 複合体であり、βCD-arg-cpx で観察される安定性が欠けています。

βCD-arg-cpxアセンブリは、棒状構造とともに現れる強い青色蛍光を発しました（図4a）。 同様の蛍光は、βCD-cpx（複合凝集体の不規則な形状の構造に従って）でも観察されましたが（図4b）、βCD-arg（これも不規則な凝集体を形成します）では観察されませんでした（図4c）。 シプロフロキサシン誘導体は、シプロフロキサシンのピペラジニル基にアミジン結合で結合したパーフルオロアリール環とフェニル環を含む球状ナノ凝集体の形態で、凝集誘起発光（AIE）を示すことが以前に観察されています27。 しかし、我々の知る限り、βCD 含有シプロフロキサシン複合体における AIE はこれまで検出されたことがありません。

cpx 含有 (βCD-arg-cpx および βCD-cpx) 複合体の青色蛍光 (βCD-arg については検出されません) (a)。 水に溶解する前後のβCD-arg-cpxおよび遊離cpx（および同等のβCD-cpx複合体）の蛍光スペクトルは、異なる溶解メカニズム（溶解した複合体と溶解した遊離薬物）を確認します（b）。 βCD-arg-cpx および細菌の検出 (ヨウ化プロピジウムで染色した緑膿菌 PAO1 に 10 分間曝露した後の 100 μg/ml 複合体 (PI、赤色蛍光、死んだ細菌を検出)) (c)。

特に水に溶解する前後で、βCD-arg-cpx および βCD-cpx 複合体の蛍光スペクトルにも違いが観察されました（図 4b）。 固体粉末では、βCD-arg-cpx と遊離 cpx の蛍光スペクトルは同じではなく、アルギニン複合体構造のスペクトルの青方偏移を明らかにしました。 水に溶解すると、βCD-arg-cpx のスペクトルは固体複合体のスペクトルと同じままでしたが、遊離薬物および安定性の低い βCD-cpx 包接複合体のスペクトルは、まったく同じ形状の蛍光で赤方偏移しました。最大。 水に溶解した成分をさらに分析すると、遊離cpx（およびMSスペクトルで同定されたその二量体および三量体、補足図5a）が明らかになりましたが、βCD-arg-Cpxの場合、水性環境での老化中に複合体は遊離cpxを放出しました。 cpx-arg、arg、およびβCD（補足図5b）。

強力な青色蛍光により、βCD-arg-cpx に追加の検出機能が提供されます。 βCD-arg-cpx 複合体に短時間曝露した後、死んだ細菌を表す細胞の大部分におけるヨウ化プロピジウムの赤色蛍光によって検出されるように、細菌の生存能力は大きな影響を受けました。 また、強い抗菌活性を持つ複合体を放出するβCD-arg-cpx棒状集合体からの青色蛍光を検出することもできました（図4c）。

量的な文脈においてさえ、βCD-arg-cpxは古典的なβCD-cpx複合体とは異なりました（図5a）。 複合体形成後の溶液中に残った cpx の UV-vis スペクトルから決定されたように、βCD-arg-cpx には、アルギニンを含まない βCD-cpx の 3 倍の cpx 含有量が含まれていました。 アルギニンの存在と複合体形成におけるその役割は、複合体内の薬物含有量に影響を与えました。 βCD-cpxとβCD-NaOH-cpxのcpx含有量には1.5倍の違いが観察され（図5b）、pHの違いが複合体に含まれる薬物の含有量に影響を与えたことを示しています。 ただし、βCD-arg-cpx の場合、その効果は複合体形成中の pH の寄与だけによるものではありません。アルギニンを使用して pH を βCD-NaOH-cpx 複合体内の NaOH と同じレベルに変更すると、 βCD-arg-cpx の cpx コンテンツは 2 倍になります。

複合体合成後に得られた上清中の Cpx (およびβCD 複合体中の計算された cpx 含量) (CD-arg-Cpx 複合体から放出される薬物を青色、CD-NaOH-Cpx 複合体からオレンジ色、CD-Cpx から黒色で示す) (a ）およびβCD-cpx（黒）、βCD-arg-cpx（ダークグレー）およびβCD-NaOH-cpx（リスグレー）からの薬物放出動態の比較（b）。 n = 3; 誤差バーは薬物放出の SD を指します。

アルギニンは、形成、集合、取り込まれた薬物内容への寄与に加えて、複合体からの薬物の放出にも影響を与えました。 古典的な封入体βCD-cpx複合体では、薬物とβCD疎水性コーンの間の動的バランスが安定していないため、cpxの放出が速くなります（図5b）。 PBS バッファー中で 37 °C でインキュベートした後、10 分間のインキュベーション後に薬物の 60% 以上が放出されました。 複合体の完全な分解と、組み込まれたすべての cpx の放出は、最初の 24 時間以内に起こりました。 βCD-NaOH-cpxの場合、放出速度はわずかに遅くなりました（図5b）：最初の放出は約40％であり、24時間の終わりには、複合体は組み込まれた薬物の最大70％を放出しました。

薬物送達システム（カプセル化ポリマー球体など）では、薬物放出は薬物担体の特性（すなわち、ポリマーマトリックスの分解、膨潤、T-/pH依存性反応）に依存し、これにより捕捉された薬物の物理的放出または脱着が可能になります。 現在の場合、複合体の一部としての薬物は薬物送達システムの一部であり、その放出は複合体の安定性と溶解性に依存します。 アセンブリの違いにより、βCD-arg-cpx複合体は、βCD-cpxの包接複合体およびpH修飾βCD-NaOH-cpx複合体よりも安定であり、最も遅い放出を示しました（図5b）。 天然の CD および薬物複合体の自己集合は、それらの溶解性に影響を与えることが知られています 12。 最初、この複合体は組み込まれた薬物の 20% のみを放出しましたが、放出はゆっくりと続き、24 時間後には薬物の最大 30% が放出されました。 βCD を賦形剤として使用すること、またはアルギニンを使用して βCD-薬物複合体内で薬物塩を生成することは、薬物の溶解性を高める便利な方法です。 対照的に、新規の βCD-arg-cpx 複合体はゆっくりと分解し、薬物の溶解を減少させ、薬物放出の制御を可能にします。 薬物の溶解度に対する観察された寄与は、薬物と他の 2 つの成分との結合の違いの結果です (図 3 に示すように)。 薬物の疎水性部分をβCD コーン内に組み込み、アルギニンをその親水性部分（通常は βCD コーンの外側に残る）に結合する代わりに、薬物はアルギニン リンカーを介して βCD 表面に結合するため、全体の構造が抗がん剤に対してより安定になります。解散。 さらに、βCD-arg-cpx の長い棒状の集合体を保持する力も、分解の速度を遅くし、解放の制御に寄与します。 抗生物質の修飾に使用される利用可能なすべての CD 関連プラットフォームとは対照的に、我々の知る限り、βCD から徐放性抗生物質薬物送達システムを作成する際にアルギニンを使用する可能性はこれまでに与えられていません。

βCD-arg-cpx アセンブリからの型破りな溶解度の低下と抗生物質の放出の遅延を観察したので、次に抗菌効果と毒性試験における複合体の効果を調査しました。 まず、βCD-arg-cpx および βCD-cpx 複合体とその前駆体成分である βCD、βCD-arg、および cpx の感受性と最小発育阻止濃度 (MIC) を、グラム陰性大腸菌を含むいくつかの細菌株に対して調査しました。 MG1655 (ATCC 47076)、緑膿菌 PAO1 (ATCC 15692)、グラム陽性黄色ブドウ球菌ローゼンバッハ (ATCC 12600) を表 1 にまとめました。調査した細菌株のいずれも、βCD または βCD-arg に対する感受性を示しませんでした。 βCD-cpx については、大腸菌の MIC 値は 0.056 μM、緑膿菌および黄色ブドウ球菌の MIC 値は 0.21 μM であることがわかりました (表 1)。 βCD-cpx の 19 wt% cpx 含有量と、37 °C で 24 時間のインキュベーション中の最大 70% の薬物放出を考慮すると (図 5b)、MIC は 0.0074 μM および 0.028 μM の遊離薬物に相当します。同等品。 cpx 基準と比較して、βCD-cpx 包接複合体は、試験したすべての細菌株の抗菌活性を約 28 倍増加させました。 βCD-arg-cpx の抗菌効果は他のものよりも高く、MIC は大腸菌に対して 0.0045 μM、緑膿菌に対して 0.018 μM、黄色ブドウ球菌に対して 0.060 μM でした。 58重量％のcpx含有量および最大30％の薬物放出（図5b）では、MICはそれぞれ0.0008μM、0.003μMおよび0.010μMの遊離cpx当量に等しかった。 したがって、cpx 参照と比較して、βCD-arg-cpx は、試験した細菌株に対してそれぞれ 260 倍、260 倍、および 78 倍増加した抗菌活性を示しました。

哺乳動物細胞における細胞毒性は、肺上皮細胞（A549）を使用して評価されました（表1および図6a）。 βCD-arg-cpx 複合体は、無毒であることが特徴付けられました (CC50 値が 2000 μg/ml (1220 μM) と高い)。 高濃度用量（>1000μg/ml（610μM））のβCD-arg-cpxのみが、用量依存的に細胞生存率の低下を示しました（図6b）。これは、約100,000〜800,000倍高いMICに相当します。 cpx と βCD の複合体形成により毒性が減少します (表 1)。 さらに、可溶性 cpx と比較して、さまざまな細菌検査で選択性指数 (SI) が増加したことに注目することが重要です (大腸菌では 13 倍、緑膿菌では 17 倍、黄色ブドウ球菌では 42 倍) (表1）。 言い換えれば、ナノモル濃度は効率的な抗菌活性を示しましたが、毒性効果にはミリモル濃度が必要であり、この複合体を安全に適用するための広範な治療領域を提示し、可溶性の市販cpxと比較して生体内での有効性を高める可能性があります。

肺上皮 A549 細胞に対する βCD-arg-cpx およびその成分の細胞毒性 (a)。 プロットは、さまざまな濃度の βCD 複合体 (0 mg/ml (黒)、0.5 mg/ml (パターン)、1 mg/ml (明るい灰色)、1.5 mg/ml (濃い灰色) とインキュベートした後の A549 細胞生存率のパーセンテージを示します。 ) および 2 mg/ml (黒枠)。DMSO を毒性のポジティブコントロールとして使用し、未処理の A549 単層を細胞毒性のネガティブコントロールとして使用しました; n = 3; エラーバーは、未処理と比較した生存率の SD を指します。 βCD-arg-cpx (0.03 μg/ml または 0.020 μM) (紫)、βCD-NaOH-cpx (0.2 μg/ml または 0.132 μM) (緑) の存在下での緑膿菌 PAO1 増殖 (白色) の比較。 )、βCD-cpx (0.2 μg/ml または 0.140 μM) (青)、βCD-arg (0.03 μg/ml または 0.0023 μM) (オレンジ)、および βCD (0.03 μg/ml または 0.0026 μM) (バラ) (b) ; n = 3; エラーバーは光学濃度 SD を指します。

次に、緑膿菌の場合について図6bに示すように、MIC値と細菌増殖の動態を分析することにより抗菌活性を調査しました。 βCD-arg-cpxおよびβCD-cpx複合体、CD-argおよびCD補助成分に対して実行された微量希釈試験の詳細、およびβCD-arg-cpxと遊​​離cpx薬物の直接比較については、補足図6に示されています。複合成分、βCD、βCD-arg は細菌の増殖を変化させませんでした。 一方、0.2 μg/ml では、βCD-cpx と βCD-NaOH-cpx (アルカリ性培地で得られた βCD-cpx バージョンとして) (それぞれ 0.140 μM と 0.132 μM モル濃度) の両方が、明らかな静菌作用で細菌の増殖を遅らせました。 βCD-arg-cpx では 0.03 μg/ml (0.018 μM) で殺菌効果が得られました。 これらの結果は、βCD-arg-cpx の抗菌活性の向上は、複合体が形成される pH の結果ではないという明確な証拠を提供しました (ただし、βCD-NaOH と βCD-arg-cpx は類似した構造を持っています)。 さらに、リンカーとしてのアルギニンの特別な役割を直接反映しています。 古典的な安定性の低いβCD-cpx包接複合体とより安定なβCD-arg-cpx集合体との間のMICの減少は、それらがどのように放出および分解されるかの結果である可能性がある。 包接複合体中の抗生物質とβCD間の相互作用は弱いため、抗生物質が溶解すると複合体が分解し、遊離薬物の放出が可能になります。 一方、アルギニンがβCDとcpxを結合すると、結合力がより強くなり、棒状構造が分解されると、遊離cpxが徐々に放出され、より活性な薬物形態としてcpx-argも放出されます。

形態学的文脈では、グラム陰性菌（大腸菌および緑膿菌）の cpx および βCD-arg-cpx 処理後、細菌のフィラメント形成が観察されました（それぞれ図 7 および 8）。 これは、cpx の主要な抗菌機構が変化していないことの証拠であり、薬物が βCD-arg-cpx 複合体アセンブリ内にある場合にも観察されました。 Cpx は、細菌の細胞分裂を阻害する DNA ジャイレースを標的とすることで DNA 複製に影響を与えることがよく知られています 30,31。 抗生物質誘発性のストレス下では、細胞分裂を停止した細菌は、細胞分離を阻害し、その長さを増加させ、長いフィラメントを形成することによって増殖を継続します 32。 ストレス条件に応じて、フィラメント内の細菌は生き残ることもあれば死ぬこともあります 30。 フィラメント内で接続された個々の細胞単位が生存し続け、長い多細胞鎖を形成すると、進化する抗生物質耐性株でストレスが軽減されます 31。 この文脈において、cpx の抑制以下の濃度は、cpx 耐性菌株への進化への移行段階として桿菌のフィラメント化を誘導します 32。 非常に低い、抑制以下の cpx 濃度、大腸菌では 0.003 μg/ml (0.008 μM)、緑膿菌では 0.03 μg/ml (0.08 μM) で処理した後、大腸菌では非常に強力で長いフィラメント形成が観察されました (図 1)。 7b、e、h）（未処理の参照（図7a、d、g）と比較）、一方、緑膿菌は、非常に長いフィラメントのケースがほとんどなく、細胞の伸長のみを示しました（図8b、e、h）（これは、参照では検出されません (図 8a、d、g)) SEM 画像で観察された連結分裂隔壁は、細菌による細胞分裂の阻害によって生じました 生/死染色で明らかになったように、一部の糸状細胞のみが死んでいましたが、大部分は細菌細胞膜は無傷のままであり（表面のみをFM464で染色することで示されるように）、フィラメントに沿っていくつかのヌクレオソームが明確に示されました（図7e、8e）。 DAPI）（図7h、8h）また、フィラメントの端に接続された通常サイズの細菌も観察され（図7h）、これはデバッグと抗生物質耐性株の形成の可能性を示しています。

低 cpx 濃度 (0.003 μg/ml または 0.008 μM) (b) および βCD-arg-cpx 中の同等の cpx (0.003 μg/ml または 0.002 μM) に曝露する前 (a) および曝露後の大腸菌細胞の形態および表面(c); Live/Dead 色素で染色した生大腸菌 (d)、および 0.003 μg/ml (0.008 μM) cpx (e) および βCD-arg-cpx (0.002 μM) (f) で処理した生存大腸菌細胞の画分。 FM464/DAPI 色素で染色した野生型大腸菌 (g)、および 0.003 μg/ml の純粋な cpx (0.008 μM) (h) および CD-arg-cpx 複合体 (0.002 μM) (i) で処理した細菌の膜構造。

低 cpx 濃度 (0.03 μg/ml または 0.08 μM) (b) および βCD-arg-cpx 中の同等の cpx (0.03 μg/ml または 0.02 μM) (c) に曝露する前 (a) および曝露後の PAO1 細胞の形態および表面。 Live/Dead 色素で染色した生緑膿菌 PAO1 (d)、および 0.03 μg/ml cpx (0.08 μM) (e) および βCD-arg-cpx (0.02 μM) (f) で処理した生細胞の画分。 FM464/DAPI 色素で染色した野生型緑膿菌 PAO1 (g)、および 0.03 μg/ml の純粋な cpx (0.08 μM) (h) および βCD-arg-cpx 複合体 (0.02 μM) (i) で処理した細菌の膜構造。

可溶性cpxに使用したのと同じ濃度のβCD-arg-cpx複合体を処理すると、完全に異なる状況が見られました（図7、8）。 大腸菌では、非常に低いcpx濃度（0.003μg/ml（0.002μM）のβCD-arg-cpx複合体）が細菌の増殖を効果的に停止させ、フィラメント状細胞の数を減少させました（図7c）。フィラメントには無傷の細胞膜が含まれていました。最も重要なことは、検出されたすべての細菌 (通常サイズおよび糸状菌) が死んでいることが確認されたことです (図 7f). 同様の結果が、低 cpx 濃度に曝露された緑膿菌でも得られました。 βCD-arg-cpx複合体（0.03μg/ml（0.02μM））を添加すると、形成されたフィラメントの数は増加しましたが、その表面を詳しく見ると強い損傷が見られ、環境下では分解後に多くの細胞断片が残存していました（図1）。 8c). 高 cpx 用量 (0.2 μg/ml (0.52 μM)) への曝露後にも同様の緑膿菌の分解が検出され、その結果、爆発性細胞溶解機構によって誘導される膜小胞形成の増加が生じました 30。糸状緑膿菌はすべて死んでいました（図2）。 8f）。 FM646/DAPI は、多核構造と小胞への膜変形を明らかにしました (図 8i)。 膜の変形、小胞形成、および爆発的な細胞溶解による細胞損傷は進行性であり、βCD-arg-cpx複合体濃度に依存しました（補足図7）。 より低い濃度 (0.03 μg/ml (0.02 μM)) では、フィラメントと通常サイズの細胞の両方が検出されました。それらはすべて、小さな穴を含む損傷した細胞壁を持ち、部分的に小胞 (サイズ 200 nm) に分解されました。 arg-cpx 濃度 (0.1 μg/ml (0.06 μM)) では、フィラメントは検出されなくなり、残りの通常サイズの細胞はすべて完全に溶解して、サイズ約 100 nm の小胞様細胞壁断片になりました。進行性の細胞損傷が示されました。 βCD-arg-cpx 複合体をはるかに低い濃度で使用した場合、膜の激しい変形、細胞構造への損傷、そして最終的には抗菌活性を含む同様の変化が、複合体にロードされた cpx によって引き起こされるストレスの増加に対する反応を示しました。遊離 cpx 薬物よりも、グラム陽性株である黄色ブドウ球菌でも観察されました（補足図 8）。

βCD-arg-cpx 複合体の in vivo 毒性と有効性は、抗菌効果と毒性を評価するために事前に最適化された動物モデルとしてガレリア メロネラ ワームで調査されました (図 9)。 毒性は複合体の高濃度（最大 2421 mg/kg）で調査され、調査されたすべての濃度で 100% の生存が観察されました。 抗菌効果の研究では、線虫に緑膿菌 PAO135 を事前感染させました。 何も治療しなければ、24 時間後には 100% が死亡しました。 5 mg/kg (3.3 mM) および 10 mg/kg (6.6 M) の濃度の βCD-arg-cpx による感染後処理により、100% の生存率が得られました。 参考として、5 mg/ml (13.3 mM) 遊離 cpx での治療では、生存率はわずか 20% でした。 遊離薬物と比較して、βCD-arg-cpx複合体による治療の有効性がより優れていることは、複合体に含まれるcpxが58重量％のみであり、組み立てられた構造からゆっくりと放出されるという事実によってさらに裏付けられます（図5に示すように）。 。

βCD-arg-cpx 複合体の毒性は、試験した全濃度範囲 (最大 2421 mg/kg) で非常に高い幼虫生存率を示しました (a)。 PAO1 (濃青色) に感染し、βCD-arg-cpx 複合体 (薄緑色と茶色) および遊離 cpx 薬剤 (濃緑色と紫) で処理した幼虫における抗菌効果の比較研究 (5 mg および 10 mg cpx/の同等の cpx 含有量)これは、複合体による処理後の、事前感染した線虫の生存率が高いことを示しています (b)。 アスタリスク: ログランク検定における緑膿菌 PAO1 対照との統計的有意差 (**p 値 < 0.01)。 n = 5。この図は、同じ実験を数回繰り返し、毎回同じ結果が得られたことを表しています。

組み立てられた βCD-arg-cpx 複合体薬物における抗菌作用の基本的なメカニズムは、遊離型薬物のメカニズムと同じままです。 βCD-arg-cpx 複合体は、遊離 cpx で通常得られる細胞分裂の進行を阻害する能力と、膜小胞形成によって引き起こされるフィラメント形成や爆発的溶解などの細菌における同様のストレス関連変化を誘導する能力と同じ能力を持っています。 これら 2 つの薬剤形態は同じ作用機序を使用しますが、それらの有効性の違いは明らかであり、バイオアベイラビリティの違いに起因すると考えられます。 細胞壁成分との相互作用を高めることが知られている βCD 成分の存在 12 は、膜を通した薬物の移動を確かに促進し、その結果、細菌細胞内の利用可能な濃度での抗菌効果を高めます。 しかし、安定性の低いβCD-arg包接体とより安定性の高いβCD-arg-cpx複合体の直接比較後に見られたように、その効果はβCDの存在のみに起因するものではない。 包接複合体における結合の可逆的な性質により、可溶化により、βCD 分子とバランスのとれた遊離薬物の形態が提供されます。 このタイプのバランスは、膜を通過する薬物の移動を促進しますが、より安定した βCD-arg-cpx 複合体が形成されるため、効果ははるかに低くなります。 βCD と cpx がアルギニン リンカーを介して結合されている、より安定した βCD-arg-cpx により、βCD が薬物分子の構築成分として機能できるようになります。 βCD に加えて、膜を通した薬物の移動はアルギニンの存在と薬物分子への結合によっても影響を受けます。

その結果、複合体cpxはより効果的にその標的（DNAジャイレース）に伝達され、はるかに高濃度の遊離cpxと同じレベルのストレスを誘発することができた。 複合体濃度が十分に高かった場合（遊離薬物の有効濃度よりもはるかに低い場合でも）、薬物に結合したβCDおよびアルギニンと細菌壁成分との相互作用は、細菌細胞構造を崩壊させ、爆発的な溶解プロセスを誘発するのに十分であった。 これらすべての事実は、非常に低濃度の βCD-arg-cpx で誘発されるストレスが抗菌活性の重要な増強を可能にすることを示しています。 耐性株を生み出す適応進化プロセスを阻止する複合薬剤形態の可能性についての詳細な研究は、今後の興味深い課題として残っている。

この革新的なタイプの βCD 複合体は、リンカーを使用して βCD と薬剤の間のより安定した結合を形成しており、以前に承認され臨床的に使用されている抗生物質の有効性を高める可能性を秘めています。 このような複合体は、非常に単純で、技術的に要求が少なく、非常に経済的な化学を使用して生成されるため、さまざまな薬物の再利用、再プロファイリング、または再利用のための非常に有望なツールとなる可能性があります。 この分野における将来の研究は、抗生物質耐性株を開発して影響を及ぼし、薬物毒性を緩和し、生体適合性を強化する能力など、この種の複合体内の薬物の生物学的利用能を高めることによってもたらされるすべての可能性を探ることに焦点を当てるべきである。 このような複合体は、抗生物質パイプラインに追加のオプションを提供することができ、製薬業界が古い抗生物質のより効果的な形態を探索し、現代において永続的で非常に深刻な健康問題として有効な抗生物質が世界的に不足している問題の解決に積極的に参加することを奨励することができます。

この複合体は、L-アルギニン (arg、L-2-アミノ-5-グアニジノペンタン酸、C16H14N4O2、Sigma-Aldrich、ドイツ)、シプロフロキサシン塩酸塩 (cpx、Cayman Chemical Company)、および β-シクロデキストリン (βCD、Sigma-アルドリッチ C4805、ドイツ）。 使用した化学薬品と試薬はすべて分析グレードのものでした。 すべての実験は、実験室で製造された超蒸留水を使用して実行されました。

複合体を形成する前に、アルギニン(50ml、0.4mg/ml)およびシクロデキストリン(50ml、2mg/ml)を室温で15時間連続撹拌(200rpm)しながら水に溶解した。 予め混合した溶液をシプロフロキサシン水溶液（０．８ｍｇ／ｍｌ）に添加し、撹拌（２００ｒｐｍ）を次の２４時間続けた。 シプロフロキサシン添加の２時間後に白色沈殿物が現れた。 ２４時間混合した後、上清を遠心分離（８０００ｒｐｍ）により分離し、沈殿を５ｍｌの蒸留水に再分散させた。 分散液をドライアイスで凍結し（3 時間）、凍結乾燥しました（24 時間、Christ Alpha 1-4、Martin Christ）。 対照サンプルは、アルギニンをNaOH水溶液に置き換えてβCD-NaOH-cpxを形成し、アルギニンを蒸留水に置き換えてβCD-cpxを形成した以外は、同じプロトコールに従って形成した。 対照サンプルには沈殿がなかったので、混合物の全量を凍結し、凍結乾燥した。 すべての粉末は蓋付きのガラス容器に保管され、さらなる試験のために周囲条件下で保管されました。

粉末 X 線回折分析 (pXRD) は、Bruker AXS D4 Endeavor 回折計を使用して、0.02° ステップ サイズおよび 1 ステップあたり 2 秒の記録で 2 ～ 70° 2θ の範囲で実行されました。 フーリエ変換赤外分光法 (FTIR) の調査は、DRIFT 技術を使用する Perkin Elmer Spectrum 400 MIR 分光光度計によって実行されました。 スペクトルは、5 mg のサンプルと 80 mg の KBr を混合することによって得られた粉末で記録されました。 X 線光電子分光法 (XPS) は、単色 Al-Kα X 線源を使用して Versaprobe 3 AD (Phi、Chanhassen、US) で実行されました。 各測定では、ペレットを非導電性の二重テープ上に置き、電荷中和剤をオンにして 200 μm のスポット サイズでスペクトルを取得しました。 サーベイスペクトルは 280 eV パスエネルギーおよび 1 eV ステップで測定され、高分解能スペクトルは 27 eV パスエネルギーおよび 0.025 eV ステップで測定されました。 電荷の中和が使用されたため、XPS スペクトルのエネルギー スケールは、炭素の C1s ピークを 284.8 eV の結合エネルギーにシフトして補正されました。 XPS データは PHI Multipak ソフトウェアで分析されました。 ペレットの表面層を除去してその下にある表面を調べるために、アルゴンクラスターによるサンプルのスパッタリングが使用されました。 サンプルは 2 × 2 mm の領域にわたって 5 kV および 20 nA で 1 分間スパッタリングされ、続いて 200 μm の高解像度点分析が行われました。 溶解生成物は質量分析法を使用して同定されました。 測定は、大気圧イオン化 (API) 源を備え、超高性能液体クロマトグラフ (TOF MS/アップLC）。 検出は、ポジティブ モードのエレクトロスプレー イオン化 (ESI) 源を介して実行されました。 形態走査型電子顕微鏡 (SEM、Nova NanoSEM) では、粉末を水に分散させ、カーボンテープに貼り付けて 5 nm のカーボンでコーティングした 50 nm フィルター膜上に堆積させました。 構造透過型電子顕微鏡分析 (TEM、Tecnai Spirit 120 kV) は、水に分散され、銅グリッド上に堆積されたサンプルに対して実行されました。 STEM 画像は、Verios 4 G HP (Thermo Fisher Scientific、米国マサチューセッツ州ウォルサム) 走査型電子顕微鏡 (SEM) を STEM モードで使用して撮影しました。 Ultim Max 65 検出器と AZtec ソフトウェア (Oxford Instruments Abingdon、英国) を備えたエネルギー分散型 X 線分光法 (EDXS) システムを EDS マッピングに使用しました。 DS-Qi2 Nikon カメラと組み合わせた Nikon 倒立蛍光顕微鏡 ECLIPSE Ti-S/L100 (Nikon) を使用して、顕微鏡スライド上に滴下した水分散粉末の蛍光イメージングを実行しました。 ゼータ電位は、Mavern Nanosizer を使用して測定されました。

抗菌試験は、大腸菌 MG1655 (ATCC 47076)、緑膿菌 PAO1 (ATCC 15692)、および黄色ブドウ球菌ローゼンバッハ (ATCC 12600) を使用して実施されました。 菌株を、大腸菌および緑膿菌については液体増殖培地（Luria Bertani、LB）（Scharlab、スペイン）、黄色ブドウ球菌についてはトリプシンソイブロス（TSB）（Scharlab、スペイン）中で37℃で一晩培養しました。 細菌サンプルを増殖培地中に 30 秒間超音波分散して (A = 18%、W = 250 W、オン:オフ = 2:1 秒)、2 mg/ml ストックを形成し、さらに試験濃度まで希釈しました。 マイクロタイタープレートのウェル（96ウェルアッセイプレート、組織培養処理ポリスチレン；Costar 3595、Corning Inc.、ニューヨーク州コーニング）に100μlの細菌（OD550 = 0.05）および試験した細菌の特定の段階希釈液100μlを接種した。サンプル。 対照には、処理されていない増殖培地および細菌が含まれていました。 インキュベーションは、Infinite M200 Pro マルチモード マイクロプレート リーダー (Tecan) で 37 °C で 14 時間、連続的に軌道振盪しながら実行されました。 細菌の増殖は、15 分ごとに 550 nm での光学密度を測定することによって評価されました。 すべての濃度を 3 回繰り返してテストしました (n = 3)。

細菌の生存率を評価するために、試験サンプルを LB または TSB 増殖培地に 30 秒間分散させ (A = 18%、W = 250 W、オン:オフ = 2:1 秒)、最終容量 1 ml になるまで細菌と混合しました。 (OD550 = 0.3)。 12時間のインキュベーション後、100μlを6000rpmで5分間遠心分離し、上清をSYTO9およびヨウ化プロピジウム（PI）を1Xで含む25μlのLive/Dead BacLight細菌生存率テスト（Invitrogen、Thermo Fisher Scientific）と交換した。リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) を 1:1 の比率、濃度 3 × 10−6 mg/ml で加えます。 続いて暗所で 15 分間インキュベートして細菌を染色しました。 蛍光細菌は、DS-Qi2 Nikon カメラ (Nikon) と組み合わせた Nikon 倒立蛍光顕微鏡 ECLIPSE Ti-S/L100 (Nikon) によって視覚化されました。

膜の完全性を評価するために、試験サンプルを LB または TSB 増殖培地に 30 秒間分散させ (A = 18%、W = 250 W、オン:オフ = 2:1 秒)、細菌と最終容量 1 ml になるまで混合しました。 (OD550 = 0.3)。 12時間インキュベートした後、100μlを6000rpmで5分間遠心分離し、上清を50μlのFM 464(N-(3-トリエチルアンモニウムプロピル)-4-(6-(4-(ジエチルアミノ)フェニル)と交換した。 )ヘキサトリエニル)ピリジニウムジブロミド、Invitrogen、Thermo Fisher Scientific)/DAPI (ハンクス平衡塩類溶液 (HBSS) 中のジアミジノ-2-フェニルインドール (DAPI; Biotium, Fremont, CA) (5 mg ml-1 FM 464 0.4 μl および1 μl の 125x DAPI) サンプルを氷中で 15 分間染色し、遮光し、その後 Nikon 蛍光 ECLIPSE Ti-S/L100 顕微鏡を使用して分析しました。

調査された複合体によって影響を受けた細菌細胞の形態学的分析は、FEISEM (Nova NanoSEM) を使用して実行されました。 複合体とともに１２時間インキュベートした細菌１００マイクロリットルを６０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、増殖培地を５０μｌのグルタルアルデヒド（３重量％）で置換した後、固定した。 固定ステップは室温で 3 時間実行されました。 固定された細菌を、弱真空下での濾過によって多孔質膜上に堆積させ、PBSで3回洗浄し(各洗浄で15分間)、段階希釈したエタノール(30、50、70、90、および100重量%、30分間で30分間)で脱水した。各濃度）。 サンプルは重要な点で乾燥されました。

試験はヒト肺上皮 A549 細胞 (ATCC® CCL-185™) で実施されました。 細胞は、1% (v/v) ペニシリン - ストレプトマイシン (Gibco、Thermo Fisher Scientific) および 10% (v/v) の非補体ウシ胎児血清 (Gibco、Thermo Fisher Scientific) を添加した DMEM/F-12 (Gibco、Thermo Fisher Scientific) で培養しました。 Thermo Fisher Scientific）を使用し、37 °C、5% (v/v) CO2 の加湿インキュベーター (Memmert) で培養しました。 試験した複合体を DMEM に 30 秒間超音波分散させて (A = 18%、W = 250 W、オン:オフ = 2:1 秒)、ストック溶液 (2 mg/ml) を形成しました。 96ウェルプレートでコンフルエントになるまで増殖した細胞を複合体の段階希釈で処理し、37℃、5% CO2で24時間インキュベートしました。 細胞毒性アッセイは、ウェルあたり 20 μl の 10 x Presto blueTM Cell Viability Reagent (Molecular Probes、Invitrogen、Thermo-Fisher Scientific) を添加し、30 分間インキュベートし、励起 λ = 560 nm および発光 λ = 590 nm で蛍光を記録することによって実行されました。 。 参照には、DMEM 中の細胞を含まない複合体、DMEM 中の純粋な色素、複合体を含まない細胞 (ネガティブ コントロールとして)、および DMSO を含む細胞 (ポジティブ コントロールとして) が含まれていました。 すべての濃度を 3 回繰り返してテストしました (n = 3)。 生存率は、処理なしの細胞に対して正規化されています(ネガティブコントロールに対する生存率%)。

in vivo モデル 35 として使用されたガレリア メロネラ幼虫は、体重 200 ～ 250 mg になるまで 34 °C で成長しました。 調査対象の複合体は、毒性研究中に超音波 (30 秒、A = 18%、W = 250 W、オン:オフ = 2:1 秒) を使用して PBS に分散され、5 mg/ml の原液が形成されました。 複合体分散液（異なる濃度）の接種材料１０μｌを、ハミルトン２２ゲージ注射器を使用して幼虫の右上前脚領域に注射した。 各濃度の複合体を、試験グループあたり 5 匹の幼虫に注射しました (n = 5)。 対照群には、１０μｌの１×ＰＢＳ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を同様に接種した。 接種後、幼虫を 37 °C で最大 72 時間維持しました。 幼虫の死亡率は 16 ～ 24 時間ごとに観察されました。 テストは繰り返し行われました。 生存曲線はカプラン・マイヤー分析を使用してプロットされ、統計的有意差は片側ログランク検定 (GraphPad 9.0 ソフトウェア) によって決定されました。

有効性研究中に、G. メロネラ幼虫の右上プロレッグ領域に感染量の緑膿菌 (PAO1) (6.4 × 103 cfu/ml) 10 μl を事前注射しました。 感染の１時間後、ＰＢＳ中に分散させた異なる濃度の試験した複合体を含む１０μｌの接種材料を左上のプロレッグに注射した。 以下の手順は毒性試験の場合と同じでした。 対照は、1x PBSを注射された幼虫(陰性対照)、および10 mg/kgのシプロフロキサシン(複合体なし)を注射された幼虫(陽性対照)であった。 試験した各グループには 5 匹の幼虫 (n = 5) が含まれていました。

実験は少なくとも 3 回行い、2 ～ 3 回繰り返しました (実験によって異なります)。 結果は平均値 ± SD として表示されます。 グループ間の差異は、片側ログランク検定 (GraphPad 9.0 ソフトウェア) によって評価されました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Research レポートの概要をご覧ください。

この研究中に生成または分析されたすべてのデータは、この公開された論文とその補足情報ファイルに含まれています。 図の背後にあるソース ファイルは次のとおりです。 2、4、5、6、および 9 は、それぞれ補足データ 1 ～ 5 ファイルに示されています。 補足図の背後にあるソース ファイル。 1 ～ 4 および 6 は、それぞれ補足データ 6 ～ 10 ファイルで提供されます。

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著者らは、ゼータ電位測定に関してカタルーニャ生物工学研究所のスマート ナノ バイオ デバイス グループの Angel Blanco Blanes 氏と Samuel Sanchez 博士、および Jozef Stefan Institute の質量分析センターの Dušan Žigon 博士に感謝します。 ToF MS分析。 欧州委員会は、Horizo​​n 2020 の Marie Skłodowska-Curie Actions COFUND スキーム (助成契約番号 712754) およびスペイン科学競争力省のセベロ オチョア プログラム (助成金 SEV-2014-0425 (2015-2019)) によってこの研究に資金を提供しました。 ）。 ET は、スペイン経済競争大臣 (MINECO/FEDER) (RTI2018-098573-B-100)、カタルーニャ州政府 (2017SGR-1079 および CERCA プログラム)、カタルーニャ嚢胞性線維症協会、ラ カイシャ財団からの助成金によって支援されました。 。 追加の資金援助は、スロベニア研究庁 (ARRS) からの助成金 (助成金 J2-8169、N2-0150、および P2-0091) によって MV に提供されました。

先進材料部門、Jozef Stefan Institute、Jamova 39、リュブリャナ、スロベニア

マリヤ・ヴコマノビッチ、レア・ガスヴォダ、マリオ・クルチャク、ブラジュ・ヤクリッチ

ジョゼフ ステファン国際大学院、Jamova 39、リュブリャナ、スロベニア

マリヤ・ヴコマノビッチ、レア・ガスヴォダ、ブラジュ・ヤクリッチ

電子顕微鏡および微小分析センター (CEMM)、Institute Jozef Stefan、Jamova 39、リュブリャナ、スロベニア

ジトカ・フレシュチャク

細菌感染症: 抗菌療法、カタルーニャ生物工学研究所 (IBEC)、科学技術研究所、Baldiri Reixac 15-21、08028、バルセロナ、スペイン

ローラ・モヤ＝アンデリコ、マリア・デル・マール・チェンドラ、エデュアルド・トレント

バルセロナ大学生物学部微生物学セクション、遺伝学、微生物学および統計学部、643 Diagonal Ave.、08028、バルセロナ、スペイン

エデュアルドトレント

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MV 研究のコンセプト、総合と特性評価、初稿の作成。 LG XRD および FTIR 分析、MK TEM および EDS 分析、JH STEM および元素マッピング分析、BJ XPS 分析、LM-A。 in vivo 研究、MC in vitro 毒性、ET の指導と資金提供。 著者全員がテキストの最終版への編集に協力しました。

Marija Vukomanovic または Eduard Torrents への対応。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Communications Biology は、この研究の査読に貢献してくれた John-Sigurd Svendsen と他の匿名の査読者に感謝します。 主な取り扱い編集者: Christina Karlsson Rosenthal。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

Vukomanovic、M.、Gazvoda、L.、Kurtjak、M. 他安定性が向上した三元系シクロデキストリン - アルギニン - シプロフロキサシン抗菌複合体の開発。 Commun Biol 5、1234 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s42003-022-04197-9

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受信日: 2022 年 5 月 12 日

受理日: 2022 年 10 月 31 日

公開日: 2022 年 11 月 12 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-022-04197-9

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