細胞壁リポタンパク質 CD1687 は、デオキシコール酸塩の生成中に DNA 結合タンパク質として機能します。

npj Biofilms and Microbiomes volume 9、記事番号: 24 (2023) この記事を引用

430 アクセス

1 オルトメトリック

メトリクスの詳細

細菌性病原体の再発性かつ持続的な感染を確立する能力は、多くの場合、バイオフィルムを形成する能力と関連しています。クロストリディオイデスディフィシル感染症は再発率が高く、バイオフィルムがその病原性と持続性に関与していると仮説が立てられています。 C. ディフィシルによるバイオフィルム形成はまだ十分に理解されていません。デオキシコール酸（DCA）やメトロニダゾールなどの特定の分子がバイオフィルム形成を誘導することが示されていますが、関与するメカニズムは依然として解明されていません。この研究では、DCA 誘導性バイオフィルム形成における C. ディフィシルリポタンパク質 CD1687 の役割について説明します。我々は、CD1685-CD1689遺伝子クラスター内のオペロンの一部であるCD1687の発現が複数の転写開始部位によって制御されており、一部はDCAに応答して誘導されることを示した。バイオフィルム形成には CD1687 のみが必要であり、CD1687 の過剰発現はバイオフィルム形成を誘導するのに十分です。 RNAseq分析を使用して、CD1687がトランスポーターと代謝経路の発現に影響を与えることを示し、プルダウンアッセイによって輸送関連細胞外タンパク質を含むいくつかの潜在的な結合パートナーを同定しました。次に、CD1687 が C. difficile の表面に露出しており、この局在化が DCA 誘導性バイオフィルム形成に必要であることを実証しました。この局在性と C. ディフィシルが eDNA に富んだバイオフィルムを形成するという事実を考慮すると、CD1687 が非特異的な方法で DNA に結合することが確認されました。したがって、我々は、CD1687は、eDNAに結合することによって細胞とバイオフィルムマトリックスとの間の相互作用を促進することによってバイオフィルム形成をもたらすDCAに対する下流応答の構成要素であると仮説を立てる。

胃腸感染症は公衆衛生上の主要な問題です。高所得国では、グラム陽性芽胞形成嫌気性菌クロストリディオイデス・ディフィシルが、抗生物質による治療を受けている成人における院内下痢や大腸炎の主な原因となっています1,2。さらに、クロストリジウム・ディフィシル感染症（CDI）は持続する可能性があり、抗クロストリジウム・ディフィシル感染症（CDI）治療後のCDIの管理における大きな課題となっています。抗生物質による治療が難しい。最初の CDI エピソードの治療のために抗生物質を投与された患者の 20% 以上で CDI の再発が発生し、新たな CDI エピソードの後にはこの割合が増加します 3,4。再発の原因は完全には解明されていません。再発は、新しい菌株による再感染または同じ菌株による再発のいずれかによって引き起こされる可能性があり、C. ディフィシルが消化管内に存続する可能性があることが示唆されています5。再発は当初、感染中に胞子形成し、抗生物質治療に抵抗する C. ディフィシルの能力と相関していました 6,7。しかし、再発はバイオフィルムとしての C. ディフィシルの存続と関連しているという仮説も立てられています 8,9。さまざまな病原体によって引き起こされる持続的かつ慢性的な感染症は、バイオフィルムの形成に関連していることが知られています10。すべての院内および慢性細菌感染症の少なくとも 60% はバイオフィルムに関連していると推定されています 11。この仮説を裏付けるように、C.ディフィシルは結腸微生物叢によって形成されたバイオフィルムを統合することが最近示され、このバイオフィルムはCDI9の実験室モデルにおいて持続および再発の貯蔵庫として機能する。

バイオフィルムは、表面に結合し、細菌種によって異なる自己生成細胞外マトリックスに包まれた構造化された微生物のコミュニティです12。 C. ディフィシレは、単一種として、または他の細菌とともに、さまざまな非生物表面およびいくつかの in vitro システムでバイオフィルムを形成できます 9、13、14、15。さらに、C. difficile はマウス感染中に in vivo で複数の種のコミュニティを統合することができ、粘膜バイオフィルムを統合する能力があることが示唆されています 16。さらに、クロストリジウム・ディフィシルは、単結合マウスモデルにおいて斑状のグリカンに富むバイオフィルム様構造を形成することができる17。 C. ディフィシルは消化管内で複数種のバイオフィルムを統合することができますが、胃腸環境に応じた C. ディフィシルバイオフィルム形成の生物学に関する知識は限られています。感染中、病原体は抗生物質、胆汁酸塩、浸透圧、さまざまな栄養源の存在などのいくつかの環境要因に遭遇し、これらは定着中のバイオフィルム形成の重要なシグナルであることが知られています 18,19。興味深いことに、C.ディフィシルは、栄養環境、胆汁酸塩代謝、浸透圧および酸化/ニトロソ化ストレスを変化させるため、腸内毒素症の際に異なる課題に直面すると考えられます20。これらの要因のいずれかがバイオフィルムの形成を誘導する可能性があります。例えば、CDI の治療に使用される抗生物質の阻害濃度以下の濃度は、in vitro でのバイオフィルム形成を促進します 21,22。さらに、我々は最近、二次胆汁酸塩デオキシコール酸塩 (DCA) の阻害濃度以下が C. ディフィシルバイオフィルム形成を促進することを実証しました 15。 DCA 誘導バイオフィルムでは、栄養細胞は DCA の毒性だけでなく、抗生物質や抗菌ペプチドからも保護されています 15。我々は、DCAによって誘導されるバイオフィルムが、利用可能な栄養素と排泄される代謝産物に依存する代謝適応と再プログラミングによって形成されることを示しました。全体として、排泄されたピルビン酸はバイオフィルム形成の誘導に重要です23。

バイオフィルム形成を誘導する環境因子に加えて、細胞表面成分や調節因子などのいくつかの細胞因子が、C. ディフィシルによるバイオフィルム形成に影響を与えることが示されています24。 DCAに応答して上方制御された遺伝子のうち、リポタンパク質（CD1687）をコードする遺伝子は、DCA15に応答してバイオフィルムを形成するのに必須である。この研究の目的は、DCA に応答したクロストリジウム・ディフィシルによるバイオフィルム形成中の CD1687 の役割を特徴付けることでした。我々は、CD1687 が細菌の表面に露出して活性化しており、in vitro で DNA に結合することを実証しました。これは、CD1687 がバイオフィルムマトリックスに存在する細胞外 DNA (eDNA) に細胞を固定するタンパク質として機能することを示唆しています。

以前のトランスクリプトーム実験では、CD1685-CD1689 クラスター内の大部分の遺伝子が、C. ディフィシル株 630Δerm15,23 によって形成された 48 時間の DCA 誘導バイオフィルムで上方制御されることを観察しました。しかし、CD1688 ではなく CD1687 の不活化は、DCA 誘導性バイオフィルム形成を妨げました。 CD1685-CD1689 遺伝子がオペロンを形成していることを検証するために、バイオフィルム誘導条件 (240 μM DCA を含む BHISG) で増殖させた細胞から抽出した RNA を用いて RT-PCR 実験を実施しました。我々は、CD1685からCD1689にわたる独特の転写物を観察し、この遺伝子座に少なくとも1つのポリシストロン性mRNAが存在することを示唆しました（図1a）。次に、qRT-PCRを実行して、DCAの存在下で48時間で5つの遺伝子が上方制御され、倍率変化にわずかな差しか見られなかったことを確認しました（補足図1a）。

a. さまざまな核酸テンプレートからプライマー EA043 および EA027 (補足表 1) を使用して実行された RT-PCR。 DCA (240 μM) を添加した BHISG 中で 48 時間増殖させたバイオフィルムから抽出した全 RNA を含む EA027 プライマーを使用して cDNA を取得しました。 b 5'RACEは、それぞれEA021およびEA018プライマー（補足表1）、次にP1686またはP1687プライマーと5'RACEキットのユニバーサル増幅プライマー（AAP）を使用して得られたポリグアニル化cDNAの増幅から得られます。。 RNA は、バイオフィルム誘導条件 (BHISG + 240 μM DCA) または非バイオフィルム誘導条件 (BHISG) で増殖させた 48 時間の細胞培養物から抽出されました。 c CD1685-CD1689クラスターの構成、RT-PCRに使用したプライマーの位置、およびP1686またはP1687プライマーを使用した5'RACE結果からのアンプリコン（アンプリコンのサイズは、Soutourinaらによって特定されたTSSから予測されました。（2020） ) and Fuchs et al. (2021). TSS: 転写開始部位; cDNA: 相補的 DNA; gDNA: ゲノム DNA. a と b のブロットは同じ実験に由来し、処理されていません。

以前の RNAseq 実験を見ると、CD1687、CD1688、および CD1689 に有利なシーケンスリードのマッピングバイアスが観察されました (補足図 1b)。興味深いことに、最近の分析では、CD1685-CD1689 遺伝子座の 3 つの転写開始部位 (TSS) が予測されました。1 つは CD1685 遺伝子の上流 (TSS1)、1 つは CD1686 遺伝子の上流 (TSS2)、もう 1 つは CD1686 のコード配列内 (TSS3) です。、２６（図１ｃ）。複数のTSSの存在を確認するために、DCAあり（すなわちバイオフィルム誘導）またはDCAなし（すなわち非バイオフィルム誘導）BHISG中で48時間増殖させた細胞から抽出した全RNAを用いて5'-RACE実験を実施した。最初の逆転写は、CD1686 (P1686) のコード配列または CD1687 (P1687) のコード配列のいずれかをアニーリングする 2 つのプライマーを使用して実行されました (図 1b、c)。 DCA が存在しない場合、CD1686 内の TSS に関連するアンプリコンが 1 つだけ観察されました。このアンプリコンは、P1686 プライマーを使用した場合には検出できましたが、P1687 プライマーを使用した場合には検出できませんでした。 DCA の存在下では、いずれかのプライマー (P1686 または P1687) を使用して 3 つの予測 TSS に対応するアンプリコンが観察され、P1687 ではさらに 2 つのアンプリコンが検出されました。これは、これらの追加の2つのTSS（TSSaおよびTSSb、図1c）がDCAの存在下で活性であり、これらのうちの1つ（TSSa）がすべてのTSSの中で最も活性であると思われることを示唆しています（図1b）。各アンプリコンの配列が決定されました (補足表 2)。TSS1、TSS2、および TSS3 の位置は、予測された位置とよく一致しました。ただし、TSSa と TSSb の配列には多様性があるため、正確な位置を特定することが困難でした。全体として、CD1685-CD1689 オペロンの転写は DCA の存在下で複数の TSS から開始され、細菌集団の状態を反映して CD1685-1689 オペロンの発現を調節するために複数の因子が組み込まれていることが示唆されます。

私たちは以前に Clostron システム 15 を使用して CD1687 を不活化しましたが、このアプローチにはいくつかの制限があることが知られています。 CD1687のみがバイオフィルム形成に必要であることを確認するために、CD1686、CD1687、およびCD1688-CD1689の欠失を生成しました（補足図2a）。以前に観察されたように、CD1687の欠失のみがバイオフィルムの形成と相補に悪影響を及ぼし、表現型を回復しました（補足図2bc）。興味深いことに、CD1686の欠失によりTSS3、TSSaおよびTSSbが除去されたことは、TSS1および/またはTSS2がDCAの存在下でのCD1687の転写に十分であり、結果としてバイオフィルム形成をもたらすことを示唆している。

CD1687 は DCA 誘導性バイオフィルム形成に必要であり、以前は細胞壁画分に局在していた 15 ため、我々は CD1687 が DCA 感知タンパク質であるという仮説を立てました。この仮説を検証するために、表面プラズモン共鳴を使用して CD1687 が DCA と直接相互作用する能力を検証しました。 CD1687 が DCA と相互作用できることを示しました (補足図 3)。ただし、解離定数は高く (Kd 1.65 ± 0.58 mM)、相互作用の推定化学量論は 1 つの CD1687 タンパク質に対して 5 ± 1 DCA 分子であり、相互作用が特異的ではないことを意味します。

興味深いことに、Δ1687変異体が誘導性プラスミド媒介CD1687（pDIA6920）で補完された場合、DCAの存在下およびある程度の非存在下でバイオフィルム形成の増加が観察されました（補足図2C）。増加は有意ではありませんでしたが、CD1687 が DCA の非存在下でバイオフィルム形成を誘導できることが示唆されました。この仮説を検証するために、pDIA6920 を野生型株に導入し、DCA の非存在下でバイオフィルムを形成するその能力を、誘導剤 ATC の添加の有無で評価しました。 CD1687 が過剰発現すると、24 時間および 48 時間でより強力なバイオフィルムが検出可能になりました (図 2)。総合すると、我々の結果は、CD1687の発現がその活性にDCAを必要としないバイオフィルム形成にとって重要であることを示唆している。

バイオフィルム形成は、コントロール空ベクター (pDIA6103) または CD1687 の発現を可能にするベクターのいずれかを含む野生型株 (630Δerm) を BHISG +/- ATC (100 ng/mL) 中で接種してから 24 時間または 48 時間後にアッセイされました。誘導性 Ptet プロモーター (pDIA6920)。各データポイントは、2 ～ 4 つの技術的複製で構成される独立した生物学的複製を表します。定量的データを表すために使用される箱ひげ図は、中央値、最小値、最大値、および上位四分位数と下位四分位数を示します。アスタリスクは、一元配置分散分析検定とそれに続くテューキーの多重比較検定による統計的有意性を示します (ns: 有意ではありません; ****p < 0.0001)。

CD1687 は DCA 誘導性バイオフィルム形成に必須であり、その過剰発現は DCA の非存在下でバイオフィルム形成を誘導する可能性があるため、バイオフィルム形成プロセス中に CD1687 の存在下で発現が変化する遺伝子を同定しようとしました。そのために、我々は 2 つのトランスクリプトーム解析を実行しました。1 つは野生型と DCA の存在下で 24 時間増殖させた Δ1687 変異体を比較し、2 つ目は CD1687 誘導性プラスミド (pDIA6920) または空のベクターを含む野生型を比較しました。両方とも、DCAの非存在下および誘導剤としてATCの存在下で24時間増殖させた。

バイオフィルム誘導条件下（+DCA）では、Δ1687変異体と比較して、野生型株では合計527個の遺伝子の発現倍率が0.5未満または2を超える有意な差次的発現を示しました（図3）。 DCAの存在下では、CD1687は主に細胞壁網状化（vanY2Y3）およびいくつかの未特徴の調節因子を下方制御すると思われます（補足図4、補足表3）。膜輸送体の変化があり、その結果、分枝鎖アミノ酸、鉄の輸入の増加、および糖輸送の変化が生じる可能性があるようです（補足表3）。代謝の観点から、細胞はコハク酸（CD2338-CD2344）、Wood-Ljungdahl経路、芳香族アミノ酸の生合成の利用から、アセトイン、ロイシン、分岐鎖アミノ酸、グリシンの発酵に移行します（補足図4）、補足表 3)。

この研究で行われた 2 つのトランスクリプトーム実験で差次的に調節される遺伝子のベン図 (補足表 4)。

CD1687が過剰発現すると、809個の遺伝子が差次的に発現し、343個の遺伝子が上方制御され、466個の遺伝子が下方制御された(図3)。補足図 4 に記載されているように、遺伝子発現の変化は、トランスポーター、代謝、および調節の変化を示しています。具体的には、いくつかの糖トランスポーターの発現が増加するのに対し、分岐鎖アミノ酸、メチオニン、アラニン、およびグリシントランスポーターの発現は下方制御されます（補足表3）。代謝の観点からは、アセトインの利用、芳香族アミノ酸またはロイシンを含むスティックランド発酵、ウッド-ユングダール経路、およびペントースリン酸経路に関与する遺伝子、およびヒスチジン、イソロイシンなどのいくつかのアミノ酸の生合成に関与する遺伝子が上方制御されます。、バリン、システイン (補足表 3)。 dltABCD オペロンは上方制御されており、テイコ酸 (dltABCD) の D-アラニル化の増加を示唆しています。興味深いことに、鞭毛をコードする遺伝子クラスターと胞子形成に関連する遺伝子が上方制御されていることがわかりました。

両方のトランスクリプトーム解析を比較したところ、両方の解析間で重複する遺伝子はほとんどありませんでした。同じ方向に変化した遺伝子は 69 個のみでしたが、47 個の遺伝子は反対方向に制御されました (図 3)。残りの 1220 個の遺伝子は、どちらの条件下でも差次的に発現されました (図 3)。両方の条件で調節される遺伝子には、システイン合成 (cysE、cysK)、スティックランド発酵におけるロイシン利用 (hadABCI)、アセトイン発酵 (acoABCL)、細胞壁タンパク質 (cwp9、cwp12)、いくつかのトランスポーター (アラニンを輸送する alsT) に関与する遺伝子が含まれます。またはグリシン、リボースを輸送するrbsK）および調節（sinRR'）。全体として、これは、CD1687 が、バイオフィルム形成につながる DCA に応答して起こる代謝再構成を含む代謝再構成を誘導することを示唆しています 23。

ただし、これらの変更は以前の分析と完全には一致していません23。我々は以前、DCAがブタン酸、乳酸、および酢酸発酵に関与する遺伝子の上方制御、スティックランド発酵における芳香族アミノ酸の使用から分岐鎖アミノ酸とグリシンの使用への移行、および下方制御を引き起こすことを観察しました。解糖、グルコース摂取、および胞子形成に関与する遺伝子23。これらの変化は、CD1687 が過剰発現した場合には観察されず、CD1687 がそれらのプロセスに関与していない、または DCA に対する即時応答を媒介していないことを示唆しています。 CD1687 はおそらく下流応答の一部であり、他のタンパク質と相互作用してこれらの変化を促進する可能性があります。

CD1687 は膜貫通ドメインを持たないが、おそらくミリストイルアンカー 27 を介して細胞表面膜に固定されている細胞壁タンパク質 15 であることを考えると、CD1687 は膜タンパク質と相互作用して外部シグナルを伝達し、転写変化を誘導するという仮説を立てました。これらの潜在的なタンパク質を見つけるために、DCAを含まないBHISGでC末端ヘキサヒスチジンタグ付きCD1687を過剰発現するC.ディフィシル細胞の粗抽出物を使用してプルダウンアッセイを実行しました（補足表5）。これらを、同じ条件で空のベクターを使用して C. ディフィシル変異体 Δ1687 から収集した対照抽出物と比較しました。 CD1687 タンパク質 (補足表 5) を含む、対照サンプルではなく試験サンプルでのみ同定された 43 個のタンパク質のうち、4 個は膜タンパク質であると予測されており、糖輸送体 (CD2667) の成分とナトリウム共輸送体が含まれています ( CD2693）。また、ABC トランスポーターおよび 1 ヌクレオチドホスホジエステラーゼ (CD0689) に関連する溶質結合タンパク質の大きなファミリーに属する 4 つのタンパク質も同定しました。これら 5 つのタンパク質は、さまざまな環境条件での適応を導くシグナル伝達と細胞応答に関与している可能性があります 28,29。膜タンパク質の中には、細胞壁多糖集合体に関与する推定リポタンパク質 (CD0747) および LCP (LytR-CpsA-Psr) ファミリータンパク質 (CD2766) も見つかりました 30。タンパク質パートナーの 1 つのコード遺伝子 (CD0037) のみが両方のトランスクリプトームで上方制御されていることに注目しました (補足表 5)。これは通常、細胞質に局在しています。プルダウン実験によって同定された膜タンパク質のほとんどは膜輸送に関与する細胞壁タンパク質であるため、CD1687 がさまざまな栄養素の輸送に直接影響を与えている可能性があり、トランスクリプトームで観察された効果と一致しています。

CD1687 は細胞壁画分で検出されたため 15、CD1687 が細胞表面に露出しているかどうか疑問に思いました。これを検証するために、本発明者らは、CD1687に対して産生されたウサギポリクローナル抗体を使用して、C.ディフィシル630Δerm株およびその誘導体の落射蛍光顕微鏡分析を行った。 DCAの有無にかかわらずBHISG中で48時間増殖させた場合、Δ1687変異体ではシグナルが観察されず、抗体の特異性が確認されました（図4および補足図5）。野生型株については、DCAの非存在下で増殖させた場合に弱いシグナルが観察され、このタンパク質が非バイオフィルム誘導条件下で低レベルで発現されることが確認されました。 CD1687 の発現は集団内で均一ではありませんでしたが、DCA の存在下ではシグナルがより強くなりました。対照的に、CD1687のシグナルは、相補されたΔ1687株の集団では均一です（図4および補足図5）。実験中に細胞は透過化されず、PFA は膜透過性に大きな影響を与えないため 31、我々は、CD1687 が細胞壁に輸送され、細胞表面で露出すると結論付けました。

示されているように、DCA (240 μM) の存在下または非存在下で、BHISG + ATC (100 ng/mL) 中で増殖させた 48 時間バイオフィルムに対して、in situ 落射蛍光顕微鏡分析を実行しました。試験した株は、対照ベクターpDIA6103を保有する野生型株(630Δerm)と、誘導性CD1687を有するプラスミド(pDIA6920)または対照プラスミド(pDIA6103)を保有するΔ1687株であった。 DNA は DAPI (青) で染色され、CD1687 は特定の抗 CD1687 ウサギ抗体で標識され、TexasRed 結合ヤギ抗ウサギ抗体 (赤) で検出されます。写真は 3 つの生物学的複製の代表であり、Nikon Eclipse Ti 倒立顕微鏡 (Nikon、日本) で撮影されました。スケールバー: 10 μm。

CD1687 の細胞局在に基づいて、増殖中に抗 CD1687 抗体を添加すると DCA 誘導性のバイオフィルム形成を防止できるのではないかと考えました。図5aに示すように、バイオフィルム誘導条件（BHISG + 240μM DCA）下で増殖させた細胞に抗CD1687ポリクローナル抗体を添加すると、用量依存的にバイオフィルム形成が強力に阻害されました。未発表の非特異的抗体をバイオフィルム形成を阻害する最高濃度の抗 CD1687 で使用した場合、阻害効果は観察されませんでした (データは示さず)。さらに、バイオフィルムアッセイで使用した濃度に関係なく、細菌の増殖は抗体の影響を受けませんでした（図5b）。したがって、CD1687 の細胞外機能を阻害するとバイオフィルムの形成が防止され、CD1687 が細胞表面に露出していることと、細胞壁の表面での CD1687 の存在が DCA 誘導性のバイオフィルム形成にとって重要であることが示されています。

a 630Δerm 株のバイオフィルム形成を、異なる濃度の抗 CD1687 ウサギ抗体 (0.05 mg/mL ～ 0.2 mg/mL) の存在下、DCA (240 μM) 培養物を含む BHISG 中で 48 時間アッセイしました。 b さまざまな濃度の抗CD1687ウサギ抗体（0.05 mg/mL〜0.2 mg/mL）を添加したPBSまたはDCAを含むBHISG培地におけるWT（630Δerm）の増殖動態（OD600nm）。 Ab: 抗体。 nsAb: 非特異的抗体。 c CD1687のalphafold2予測構造は、N末端シグナルペプチドS（赤）がリンカーペプチド（緑）によってαベータドメイン（紫）に接続されており、C末端領域に別の同様のβベータドメイン（黄色）があることを示しています。。 d 48時間のバイオフィルムは、空のベクター（pDIA6103）、または完全長CD1687（pDIA6920）を過剰発現するプラスミド、または除去された2つのドメインのいずれか1つを欠く切断型CD1687（pDIA7242およびpDIA7243、補足表1）を増殖させたプラスミドで補完されたさまざまなΔ1687株によって形成されます。 ATC (100 ng/mL) および DCA (240 μM) を含む BHISG。各データポイントは、2 ～ 4 つの技術的複製で構成される独立した生物学的複製を表します。定量的データを表すために使用される箱ひげ図は、中央値、最小値、最大値、および上位四分位数と下位四分位数を示します。アスタリスクは、一元配置分散分析検定に続いてダネットの多重比較検定 (a) (ns: 有意でない; **p < 0.01) またはテューキーの多重比較検定 (d) (ns: 有意でない; ***) による統計的有意性を示します。 *p < 0.001)。

CD1687 の構造と機能に関する洞察を得るために、ソフトウェア AlphaFold232 を使用して CD1687 の 3D タンパク質構造を予測しました。図5cに示すように、CD1687はαヘリックスN末端シグナルペプチドと2つの推定βドメインを持っています。ベータドメインの考えられる機能を探索するために、CD1687 の推定構造が Dali サーバーを介して Ekhidna データベースで分析されました 33 が、機能は検出されませんでした。 CD1687 の機能は 2 つのベータドメインの 1 つに割り当てられる可能性があるため、2 つのドメインのいずれかを除去して CD1687 を過剰発現し、バイオフィルム誘導条件 (BHISG + 240 µM DCA) でこれらの株を増殖させることにより、Δ1687 変異体を補完しました。の変異体は観察されず、DCA誘導性バイオフィルムを形成するにはC.ディフィシルがCD1687の両方のβドメインを必要とすることを示している（図5d）。

CD1687 の構造から潜在的な機能を特定できなかったため、CD1687 が、eDNA 依存性バイオフィルム形成を促進する黄色ブドウ球菌リポタンパク質で観察されるような DNA 結合活性を持っているかどうかを判定しようとしました 34。 C. ディフィシルバイオフィルムマトリックスは主に eDNA15 で構成されているため、エレクトロモビリティシフトアッセイ (EMSA) を実行することにより、CD1687 の DNA への結合能力をテストしました。精製された CD1687 タンパク質を大腸菌 DNA プラスミド pUC9 または C. ディフィシル DNA (CD1438 領域の配列から) から生成された PCR 生成アンプリコンとともにインキュベートすると、DNA の移動がCD1687 の存在と CD1687 濃度の増加は、保持力の増加と相関します (図 6a、b)。しかし、CD1687を熱不活化した場合、またはDNA断片をシフトさせる最高濃度のCD1687でBSAを対照として使用した場合には、シフトは観察されませんでした。 CD1687が細菌のeDNAへのアンカーリングを可能にするかどうかをテストするために、C.ディフィシル細菌全体を使用してDNA結合実験を実行しました（図6d）。 CD1687を産生するか産生しないΔ1687 pDIA6920株（補足表1）を添加する前に、EMSAで使用したのと同じアンプリコン（図6b）をマイクロアレイプレートに共有結合させました。次に、ウェルに DNAse I を添加した後、DNA に結合した細菌を数えました (図 6d)。 DNAまたはCD1687が存在しない場合よりも、CD1687が産生された場合には、細菌がウェル内のDNAにより多く付着することが判明した（図6c）。したがって、この実験と EMSA の結果から、CD1687 は非特異的に eDNA に結合できると結論付けます。この結合活性により、C. ディフィシルはバイオフィルム内の eDNA に自身を固定できると考えられます。

電気泳動移動度シフトアッセイ (EMSA) は、16 μM の熱不活化 ( HI) CD1687 または BSA を対照として使用。 c 接着アッセイから測定された C. ディフィシル CFU。 (d)に記載されているように、ATcに応答してCD1687を発現するかまたは発現しないΔ1687 pDIA6920株を使用した。接着アッセイのスキーム。共有結合した DNA を含むウェルまたは含まないウェルで、CD1687 を発現する細菌とそうでない細菌の接着を比較しました。このスキーマは biorender.com で作成されました。定量的データを表すために使用される箱ひげ図は、中央値、最小値、最大値、および上位四分位数と下位四分位数を示します。各データポイントは、独立した生物学的複製を表します。アスタリスクは、一元配置分散分析検定に続いてダネットの多重比較検定を行った場合の統計的有意性を示します (**p < 0.01; ***p < 0.001)。 a と b のブロットは同じ実験から得られたものであり、処理されていません。

この研究では、CD1685-CD1689 クラスター内の CD1687 のみが DCA 誘導性バイオフィルム形成に必要であり、これには細胞表面での CD1687 の局在化が必要であることを確認しました。

実際、このタンパク質は細胞表面だけでなく細胞壁でも検出されます15（図4および5a）が、膜アンカーリポタンパク質として検出および記載されています27。このタンパク質の小さいサイズとその予測された構造は、このタンパク質が細胞壁の表面よりも膜に近いはずであることを示唆しています。 CD1687 は細胞壁画分から容易に回収できるため、これは、ミリストイルアンカーを切断してタンパク質が細胞壁に結合できるようにする、まだ記載されていない翻訳後修飾が CD1687 に存在する可能性を示唆しています。我々は、顕微鏡観察で観察されるように、集団の細胞表面でのCD1687の発現と局在についてDCAに応答して重大な不均一性があることに注目しました（図4および補足図5）。これは、集団レベルでの CD1685-CD1689 遺伝子クラスターの転写レベルが比較的低いことを説明します 15。興味深いことに、細胞集団内でCD1687が均一に発現されるほど、形成されるバイオフィルムの量も増加します（図4、補足図2c）。我々の知る限り、クロストリジウム・ディフィシルでは重要なバイオフィルム成分の発現の不均一性はまだ報告されていない。バイオフィルムにおける表現型の不均一性は、他のいくつかの細菌種でもよく特徴付けられており、クローン細菌集団における表現型の多様化と分業をもたらします 35。例えば、細胞の部分集団は、B. subtilis におけるバイオフィルム形成中にエキソ多糖マトリックスを合成します 36。 C. ディフィシルの浮遊細胞では表現型の不均一性が報告されており、これが鞭毛と毒素の発現に影響を与えました 37。この場合、不均一性は、RecV38 と Rho 因子 39 によって媒介される特定の DNA 組換えイベントによって制御されます。さらに、C. ディフィシルのコロニー形態も表現型の不均一性を受け、細菌の生理機能や病因に変化をもたらします。これは CmrRST シグナル伝達系発現の位相変化によって起こります 40,41。

CD1687 が 2 成分制御系 (CD1688-1689) を持つオペロンを形成し、CD1687 が細胞壁タンパク質であることを考慮すると、我々は最初に、CD1687 が DCA に応答した転写修飾を引き起こすシグナル伝達に関与しているという仮説を立てました。しかし、CD1687 は DCA に結合しなかったため、DCA 感知タンパク質としての CD1687 の推定上の役割はなくなりました。さらに、胞子形成を除いて、CD168842によって調節される遺伝子の重複は限られており、CD1687がCD1688-CD1689シグナル伝達カスケードの一部ではない可能性があることを示唆しています。これは、プルダウンアッセイに CD1689 と CD1688 が存在しないことと一致しています。ただし、いくつかの溶質結合タンパク質とトランスポーター関連タンパク質がプルダウンアッセイで単離されました。これと転写分析は、CD1687 が C. ディフィシルの代謝に影響を与えるという証拠を提供します。これを裏付けるように、CD1687 が過剰発現すると、成長期の代謝の優先順位を管理する調節因子 (Spo0A、CodY、および SinRR') が差次的に調節されました 43、44、45。さらに、毒素をコードする遺伝子や胞子形成に関与する遺伝子の発現にも影響があり、これらのプロセスは C. ディフィシルの代謝状態に依存することが知られています。 DCA誘導条件下でCD1687の非存在下で差次的に制御される遺伝子と、DCAの非存在下でCD1687が過剰発現したときに差次的に制御される遺伝子を比較したところ、異なる代謝経路や輸送に関与する遺伝子を含む共通遺伝子は69個のみでした。しかし、代謝関連遺伝子のこれらの変化は、DCA誘導性バイオフィルム形成中の遺伝子発現に関するこれまでの解析とは重複しておらず23、CD1687はDCAに対する即時応答の一部ではなく、おそらく下流の応答で役割を果たしていることが示唆されました。総合すると、我々のデータは、CD1687がDCAに応答して代謝の優先順位を再編成するのに役立つことを示唆していますが、この仮説だけではDCAなしのバイオフィルム形成におけるCD1687の役割を説明できません。したがって、CD1687 には追加の役割がある可能性があります。

興味深いことに、細菌の細胞表面に見られる多くのタンパク質は、バイオフィルムマトリックスに見られる eDNA と相互作用し、これがバイオフィルムの組織化と構造安定性に寄与しています 46。膜リポタンパク質は、eDNA と直接相互作用し、バイオフィルムの構築に関与することがすでに示されています。黄色ブドウ球菌では、バイオフィルムマトリックスの eDNA と相互作用するいくつかの膜付着リポタンパク質が、黄色ブドウ球菌バイオフィルム形成を促進することが確認されています 34。ここで我々は、CD1687が、精製タンパク質およびCD1687を産生する細菌の両方において、in vitroでDNAと非特異的に相互作用することを確認した。その産生レベルは細菌のeDNAへの接着を増加させるのに十分である。これらの結果は、CD1687 が細胞表面上に eDNA のアンカーポイントを作成することにより、バイオフィルム形成中に eDNA 結合タンパク質として機能するという仮説を裏付けています。 CD1687での我々の観察と同様に、黄色ブドウ球菌でeDNA結合タンパク質を過剰発現させると、表面eDNAの保持が増加し、バイオフィルムバイオマスが増加しました。しかし、黄色ブドウ球菌リポタンパク質の欠失はバイオフィルム形成への影響は最小限でしたが、バイオフィルムの多孔性は増加し、リポタンパク質と eDNA の相互作用がバイオフィルム全体の構造に寄与していることが示されました。黄色ブドウ球菌で見出されるリポタンパク質とは異なり、CD1687 の欠失または不活化によりバイオフィルム形成が消失しました 34。 CD1687 と eDNA の相互作用は、DCA 誘導性バイオフィルム形成の重要な部分であると思われます。他の構造も eDNA と相互作用する可能性があります。最近、C. ディフィシル T4P の 2 つのマイナーサブユニット (PilW および PilJ) が eDNA と直接相互作用してバイオフィルム形成を促進することが示されました 47。どちらのサブユニットも、CD1687 で観察されたような予測された DNA 結合モチーフを持っていません。 T4P は、DCA の非存在下または存在下でバイオフィルムの形成を促進する構造です 48,49 23。 DCA の存在下では、PilW は上方制御されますが、バイオフィルムの形成には必要ありません 15,23。さらに、pilW 遺伝子はトランスクリプトーム内で異なって制御されていました。 DCA分析ありのWT対Δ1687では上方制御され(有意ではあるが閾値未満)、DCA分析なしのWT対過剰発現CD1687では下方制御された。したがって、CD1687 と T4P は相補的な役割を果たしている可能性があり、これらの成分のいずれかによる eDNA 結合の欠如により、バイオフィルム形成中の C. ディフィシルの挙動が変化する可能性があります。

eDNA結合タンパク質および代謝におけるCD1687の潜在的な役割にもかかわらず、CD1687の過剰発現が、CD1687と他の膜タンパク質およびトランスポーターとの相互作用を通じて細胞壁の特性を改変することを除外することはできません(補足表5)。これらの相互作用はさまざまなセンサーによって検出され、フィードバックループを活性化して細胞壁や細胞表面タンパク質の組成を変更する可能性があります。たとえば、DCA の非存在下で CD1687 が過剰発現されると、dltABCD オペロンが上方制御されました。 DltABCD タンパク質はテイコ酸の D-アラニル化に関与し、細胞壁と表面の電荷を変化させます50。 CD1687 の過剰発現も細胞形態に影響を与えました。 DCAに応答して、高レベルのCD1687を発現する細胞は、サイズと形状の歪みの減少を示します（図4および補足図5）。全体として、CD1687 の過剰発現は C. ディフィシルの生理機能に下流の影響を与える可能性があり、これらの変化はバイオフィルムの形成に寄与する可能性があります。

最後に、我々の仮説は、DCAの存在下でのバイオフィルム形成のメカニズムは、DCAが存在せずCD1687が過剰発現されている場合のメカニズムとは異なるというものです。 DCA の存在下では、C. ディフィシルが代謝の再組織化を行うことがわかっており 23、我々のデータに基づくと、CD1687 は長期的な適応のための代謝の優先順位付けに役立つと考えられます。十分な eDNA が存在すると、CD1687 は eDNA 結合と相互作用し、アンカーポイントとして機能します。 CD1687 が DCA とは独立して過剰発現すると、集団内の CD1687 表面局在の均一性が高まり、eDNA の複数のアンカー部位として機能し、その結果、強力に接着するバイオフィルムが形成されます。黄色ブドウ球菌で観察されたように、他のリポタンパク質はクロストリジウム・ディフィシルのeDNAに結合する可能性があり、いくつかはDCA23に応答して上方制御されます。黄色ブドウ球菌で特徴付けられたリポタンパク質とは異なり、リポタンパク質 CD1687 はおそらく DCA に応答した代謝において重要な機能を持っており、他のリポタンパク質は機能的冗長性を提供しません。これは、バイオフィルム形成の促進における CD1687 の重要性を強調しています。これら他のリポタンパク質のバイオフィルムへの役割と寄与を理解するには、さらなる研究が必要となるでしょう。

この研究で使用した細菌株とプラスミドは補足表 1C にリストされています。ディフィシレ株は、TY培地（30 g/Lトリプトン、20 g/L酵母エキス）またはBHISG培地（0.5%（w/v）酵母を含むBHI）中で嫌気性（5% H2、5% CO2、90% N2）で増殖しました。抽出物、0.01 mg/mL システインおよび 100 mM グルコース）、必要に応じてセフォキシチン（250 μg/ml）、D-シクロセリン（8 μg/ml）およびチアンフェニコール（15 μg/ml）を補充します。さらに、100 ng/mL のアンヒドロテトラサイクリン (ATC) を添加して、C. ディフィシルにおける pRPF185 ベクター誘導体の Ptet プロモーターを誘導しました。大腸菌株は、クロラムフェニコール (15 μg/mL) およびアンピシリン (100 μg/mL) を添加した LB ブロス中で増殖させました。

適切な抗生物質を含むTY培地で増殖させたクロストリジウム・ディフィシルの一晩培養物を、所望のサプリメント（240μM DOC、100ng/mL ATCまたは両方）を含む新鮮なBHISGに1/100に希釈しました。アッセイに応じて、希釈した培養物を 24 ウェルプレート (ポリスチレン組織培養処理プレート、Costar、米国) に 1 ウェルあたり 1 mL ずつ、または 96 ウェルプレート (ポリスチレン黒色組織培養処理プレート) に 200 μL ずつ分注しました。処理プレート、Greiner Bio One、オーストリア）。プレートを嫌気性環境下、37℃で48時間インキュベートしました。バイオフィルムバイオマスは、確立された方法を使用して 24 ウェルプレートで測定されました 15。顕微鏡検査に使用した 96 ウェルプレートでのバイオフィルムアッセイでは、使用済みの培地をピペッティングによって注意深く除去し、4% のパラホルムアルデヒド (PFA) を補充した 200 μL の PBS を添加しました。プレートを室温で1時間インキュベートし、その後培地をピペッティングにより注意深く除去した後、PBSを4℃で48時間添加した。すべてのアッセイにおいて、滅菌培地をネガティブコントロールおよびアッセイのブランクとして使用しました。

C. ディフィシルにおける遺伝子欠失は、Peltier et al.51 に記載されているように実行されました。目的の遺伝子の上流および下流の領域を、補足表 1 に記載のプライマーペアを使用して PCR 増幅しました。PCR フラグメントと線状化 pDIA675451 を混合し、Gibson Assembly (NEB、フランス) を使用して組み立て、熱ショックにより大腸菌 NEB 10β に形質転換しました。歪み。プラスミド構築は配列決定によって検証され、正しい配列を持つプラスミドが大腸菌 HB101 (RP4) に形質転換されました。得られた株を、関連するクロストリジウム・ディフィシル株との結合アッセイにおけるドナーとして使用した。次に、Peltier et al.51 に記載されているように、逆選択を使用して欠失変異体が得られました。

C.ディフィシル株を、チューブ内のATCを含む20mLのBHISG培養物中で48時間嫌気的に増殖させた。細胞とバイオフィルムを遠心分離 (10 分、14,000 × g、4 °C) によって回収し、冷リン酸緩衝液 (50 mM、pH = 7.0、4 °C) で洗浄しました。次に、エンドリシン CD27L の精製触媒ドメイン (3 μg/mL) を含む同じリン酸緩衝液 1 ml に細胞を再懸濁し、懸濁液を 37 °C で 1 時間インキュベートして細菌細胞を溶解しました。次いで、全抽出物を１分間ボルテックスし、大腸菌発現からのＣＤ１６８７精製について以下に記載するように、Ｎｉ－ＮＴＡビーズを用いたプルダウンアッセイに使用した。各条件の 5 つの生物学的複製をプルダウンアッセイで使用しました (補足表 5)。

CD1687 遺伝子（補足表 1）を保有する pET20 由来プラスミドを含む大腸菌株 Bli5 を使用して、シグナルペプチドなしのヘキサヒスチジンタグ付き CD1687 タンパク質を過剰発現させました。細胞を、グルコース (1% w/v) および抗生物質 (アンピシリン 100 μg/mL およびクロラムフェニコール 15 μg/mL) を添加した LB 中で 37 °C で一晩増殖させました。一晩培養したものを 1 L の同じ培地に移し (1/100)、37 °C でインキュベートしました。培養物のOD600nmが0.5に達したら、IPTGを添加し(最終濃度0.1mM)、培養物をさらに3時間インキュベートした。次に細胞を遠心分離 (5000 × g、10 分、4 °C) によって回収し、ペレットを冷 PBS で洗浄しました。遠心分離後、上清を廃棄し、得られたペレットを-20℃で凍結させた。次いで、ペレットを１５ｍＬの溶解緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ＝８．０；３００ｍＭＮａＣｌ）に再懸濁し、超音波処理した。遠心分離 (5000 × g、10 分、4 °C) 後、上清を収集し、Ni-NTA ビーズと混合し、4 °C で 1 時間インキュベートしました。次いで、ビーズを溶出カラムに移し、洗浄緩衝液(50 mM リン酸ナトリウム pH = 8.0; 300 mM NaCl; 10 mM イミダゾール)で洗浄した。タンパク質を、300 mM NaClおよび50 mMから500 mMの範囲のイミダゾールの勾配を補充した2 mlのリン酸ナトリウム緩衝液(50 mM、pH = 8.0)で溶出した。溶出したタンパク質をウェスタンイムノブロッティングで分析し、CD1687 を含む画分を Slide-A-Lyzer 透析ユニットを使用して TAE バッファー (Tris-base (20 mM)、酢酸 (10 mM)、EDTA (0.5 mM)、pH = 8.5) で透析しました。（サーモフィッシャーサイエンティフィック、米国）。ポリクローナル抗 CD1687 抗体を産生するために、2 匹の雌ウサギ (ニュージーランドホワイト) に 50 μg の精製 CD1687(His6) (0.5 mL の抗原と 0.5 mL の完全フロイントアジュバントを D0、D14、D28、および D42 に) を 4 回注射しました。）Covalab社（フランス）と提携。抗体は免疫化の D53 で精製されました。

すべての実験は、バッファー TAE (20 mM トリス塩基、酢酸 10 mM、EDTA 0.5 mM、pH = 8.5) 中で 25 °C で平衡化した Biacore T200 機器 (Cytiva、米国) で実行されました。 CD1687(His6) (100 µg/ml) は、NiCl2 をロードした NTA センサーチップ上で 2 µl/min で 600 秒間捕捉され、表面密度 1000 ～ 1200 RU (共鳴単位; 1RU ≈ 1 pg/mm2) に達しました。次に、DCA (16 ～ 2000 µM) を 10 µl/min で 120 秒間、CD1687 表面と非特異的シグナルが差し引かれた空のリファレンスチップに同時に注入しました。

タンパク質は、5 mM TCEPを使用して室温で30分間還元されました。還元されたジスルフィド架橋のアルキル化は、10 mM ヨードアセトアミドを使用して室温、暗所で 30 分間実行されました。次に、タンパク質を 2 段階で消化しました。最初に 250 ng r-LysC Mass Spec Grade (Promega) を使用して 30 °C で 4 時間、次にサンプルを 100 mM Tris HCl pH 8.5 および 500 ng シーケンスグレード修飾トリプシンで 2 M 尿素未満に希釈しました。 2 回目の消化のために 37 °C で一晩添加しました。タンパク質分解は、最終濃度 5% でギ酸 (FA) を添加することによって停止されました。得られたペプチドを、製造業者の指示に従って、AssayMAP Bravo プラットフォーム (Agilent) 上の AssayMAP C18 カートリッジを使用して洗浄しました。ペプチドを濃縮乾固し、LC-MS 注入の直前に 2% アセトニトリル (ACN) および 0.1% FA に再懸濁しました。

LC-MS/MS 分析は、Proxeon EASY-nLC 1200 (Thermo Fisher Scientific) と組み合わせた Q ExactiveTM Plus Mass Spectrometer (Thermo Fisher Scientific) で実行されました。 500 ngのペプチドを自家製の37 cm C18カラム（粒子1.9 μm、細孔径100 Å、ReproSil-Pur Basic C18、Dr. Maisch GmbH、アンマーブーフ・エントリンゲン、ドイツ）に注入しました。カラムの平衡化とペプチドのローディングは、バッファー A (0.1% FA) 中で 900 bar で行われました。ペプチドは、3 ～ 6% バッファー B (80% ACN、0.1% FA) で 5 分間、6 ～ 31% バッファー B で 80 分間、31 ～ 62% バッファー B で 20 分間の多段階勾配で分離されました。流量250nL/分。カラム温度は 60 °C に設定しました。 MS データは、Xcalibur ソフトウェアを使用し、データ依存の方法で取得しました。 MS スキャンは 70,000 の解像度で取得され、MS/MS スキャン (固定の最初の質量 100 m/z) は 17,500 の解像度で取得されました。サーベイスキャンと MS/MS スキャンの AGC ターゲットと最大注入時間は、それぞれ 3E6、20 ミリ秒、1E6、60 ミリ秒に設定されました。最も強度の高い 10 個の前駆体イオンの自動選択 (上位 10) が、30 秒間の動的除外で有効化されました。 HCD フラグメント化のために、分離ウィンドウは 1.6 m/z に設定され、正規化された衝突エネルギーは 27 に固定されました。強度閾値 1.7E5 に対応するアンダーフィル率 1.0% を使用しました。未割り当ての前駆体イオンの荷電状態、および 1、7、8、および >8 の荷電状態は拒否され、ペプチドの一致は無効になりました。

取得した生データは、MaxQuant ソフトウェアバージョン 2.1.1.052 を使用し、Andromeda 検索エンジンを使用して分析されました53,54。 MS/MS スペクトルは、C.difficile 630 データベース (3957 エントリ) に対して検索されました。

すべての検索は、可変修飾としてメチオニンの酸化とタンパク質の N 末端アセチル化、固定修飾としてシステインカルバミドメチル化を使用して実行されました。トリプシンは、最大 2 回の切断ミスを許容するプロテアーゼとして選択されました。最小ペプチド長は 7 アミノ酸に設定され、ペプチド質量は最大 4600 Da に制限されました。ペプチドおよびタンパク質の同定に関する誤発見率 (FDR) は 0.01 に設定されました。主要な検索ペプチド許容値は 4.5 ppm に設定され、MS/MS 一致許容値の場合は 20 ppm に設定されました。 2 番目のペプチドにより、共断片化イベントを特定できるようになりました。 1% の誤検出率カットオフがペプチドおよびタンパク質レベルに適用されました。質量分析プロテオミクスデータは、データセット識別子 PXD038282 とともに PRIDE パートナーリポジトリを介して ProteomeXchange コンソーシアムに寄託されています。プロテオミクスデータの統計分析は、以前に記載されているように実行されました55。簡単に言うと、条件ごとに 4 つの生物学的複製が取得されました。 2 つの条件間で有意に量が異なるタンパク質を強調するために、次のデータ分析パイプラインを通じて差分分析を実施しました。(1) 逆タンパク質および潜在的な汚染タンパク質を削除します。（２）誤同定を制限し、最小限の複製可能性を確保するために、比較した２つの条件のうちの１つで少なくとも２つの定量値を有するタンパク質のみを保持する。 (3) タンパク質の残りの強度の log2 変換。 (4) R パッケージ DAPAR56 の NormalizeD 機能により、条件内の中央値中心化によって強度を正規化します。 (5) 比較した両方の条件のいずれかで値のないタンパク質を脇に置きます。タンパク質は、ある条件では定量的に存在し、別の条件では存在しないためです。、それらは差次的に豊富なタンパク質とみなされ、(6) 条件間で最小倍数変化 2 を要求し、p 値の適応ベンジャミニ・ホッホベルグ補正と組み合わせた LIMMA t 検定 57,58 を使用することにより、統計的差分分析を実行します。 Rパッケージcp4p59のadjust.p関数のおかげです。 Pounds と Cheng の堅牢な方法を使用して、一連の統計検定における真の帰無仮説の割合を推定しました60。 1% の FDR レベルよりも低い調整された p 値に関連するタンパク質は、有意に異なる量のタンパク質であると考えられています。したがって、最終的に、目的のタンパク質は、ある条件では定量的に存在せず、別の条件では存在するタンパク質によって補足された、この統計分析から出現するタンパク質です。

細胞は 24 ウェルプレートで増殖させ、プレートあたり 10 ウェルを使用して 1 つの条件について 1 つの複製を作成しました。バイオフィルム条件では、プレートを反転することによって上清を除去し、バイオフィルムを注意深く2回洗浄し、その後3 mLのPBSに再懸濁しました。他の条件では、細菌集団全体を収集し、遠心分離 (10 分間、8000 × g、4 °C) によって細胞を収集し、1 ml の PBS に再懸濁しました。 PBS 中の細胞懸濁液を最後に遠心分離し (10 分、8000 × g、4 °C)、ペレットをさらに使用するまで -80 °C で凍結しました。細菌からの全 RNA の抽出と qRT PCR アッセイは、Saujet et al.43 に記載されているように実行されました。

各条件のトランスクリプトーム分析は、4 つの独立した RNA 調製物を使用して実行されました。ライブラリーは、Illumina Stranded Total RNA Prep Ligation with RiboZero Plus (Illumina、USA) キットを使用して構築しました。リボ除去ステップは、クロストリジウム・ディフィシルのリボソーム配列を標的とするために特別に合成された特異的プローブを使用して実行されました（補足表1）。リボ除去後、供給者の推奨に従ってライブラリを調製した。 RNA シーケンスは、Illumina NextSeq 2000 プラットフォームで、サンプルあたり 10 M リードのターゲットに対して 67 塩基を使用して実行されました。

これらのアッセイでは、大腸菌から新たに精製した CD1687 のみを使用しました。 CD1687 (0.5 μM ～ 16 μM) を DNA (pUC9 または PCR 産物) とともに 10 μl のリン酸ナトリウム緩衝液 (50 mM; pH = 8.0) 中で室温で 30 分間インキュベートしました。サンプルを TAE 緩衝アガロースゲル (1% w/v) にロードし、100 V で 90 分間移動させました。コントロールは、アッセイ前に 100 °C で 15 分間変性した CD1687 を用いて実行されました。ゲルを臭化エチジウムで染色し、Amersham ImageQuant 800 (Cytiva) で写真を撮影しました。 pUC9 プラスミドは、Nucleospin プラスミドキット (Macherey-Nagel、ドイツ) を使用して大腸菌ストックから調製し、使用した PCR アンプリコンは、DNA テンプレートとして C. ディフィシル 630Δerm と CD1438 の領域を標的とするプライマーを使用して生成しました (補足表 1)。。 DNeasy Blood & Tissue Kit (QIAGEN, Netherlands) を使用して、細胞培養物から gDNA を抽出しました。

５'ＲＡＣＥは、ｃＤＮＡ末端の急速増幅のための５'ＲＡＣＥシステム、バージョン２．０キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）を使用して実施した。簡単に言うと、cDNA は全 RNA 抽出物からの逆転写とそれに続く RNA の分解によって生成されました。次に、cDNA を用いて dC テーリングを実行し、得られた dC テーリング DNA をキットの説明書に記載されているように PCR の鋳型として使用しました。 PCR産物をアガロースゲル電気泳動(TAE緩衝液中1%アガロース)によって分析した。転写開始部位を同定するために、メーカー (Promega, USA) の説明に従って、PCR 産物を pGEM-T easy ベクターキットに挿入しました。次に、インサートを PCR 増幅し、得られた PCR 産物の配列を決定しました。

顕微鏡検査のために、上記のように 96 ウェルプレート (黒、Greiner) で 48 時間バイオフィルムを生成し、洗浄し、PBS (400 ng/mL) で希釈した 50 μl のポリクローナル抗 CD1687 抗体を各ウェルに添加してインキュベートしました。 4℃で一晩。ウェルをＰＢＳで２回注意深く洗浄し、続いてＤＡＰＩ（１／１０００希釈）および二次抗体（テキサスレッドと結合したヤギ抗ウサギ；１／５０００希釈；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ：Ｔ－２７６７）を含む溶液を添加した。 PBS。プレートを室温で２時間インキュベートした。次いで、ウェルをＰＢＳで注意深く洗浄し、データ収集のために２００μｌの新鮮なＰＢＳを加えた。画像は、Nikon Eclipse Ti 倒立顕微鏡 (Nikon、日本) で撮影されました。

C6 アミンで一端が修飾され、CD1438 遺伝子の領域に対応する 433 bp アンプリコンを使用して、メーカーのガイドラインに従って DNA-BIND Surface 96 ウェルプレート (Corning, USA) を共有結合的にコーティングしました。簡単に説明すると、結合バッファー (50 mM リン酸ナトリウムバッファー pH = 8.5; 1 mM EDTA) で調製したアンプリコンの 250 nM 溶液 100 μL をウェルに入れ、プレートを 4 °C で一晩インキュベートしました。対照ウェルは結合バッファーのみを使用して作成しました。次に、ウェルを 200 μL の PBS で 3 回洗浄し、プレートを嫌気チャンバーに導入しました。 ATc誘導物質の有無にかかわらず、BHISGおよび適切な抗生物質で増殖させたΔ1687pDIA6920株の指数相培養物（補足表1）をOD（600 nm）0.5に希釈し、これらの細菌懸濁液200μLをDNAのウェルに入れました。 - コーティングされたプレート。プレートを嫌気的に37℃で20分間インキュベートし、その後BHISGで2回洗浄した後、各ウェルに25μgのDNAse Iを含む200μLのBHISGを添加した。プレートを嫌気的に37℃で20分間インキュベートし、BHI寒天プレート上の懸濁液から細菌を計数しました。修飾アンプリコンを取得するための PCR 増幅は、CD1438 の領域を標的とするプライマーを使用して C. ディフィシル 630Δerm の染色体 DNA を用いて実行されました (補足表 1)。

バイオフィルムアッセイ、細菌 DNA 結合アッセイ、および RT-qPCR は、一元配置 ANOVA テストに続いて Tukey の多重比較テストまたは Dunnett の多重比較テストを使用して分析されました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Research レポートの概要をご覧ください。

この研究で生成された RNA-Seq データは、アクセッション番号 GSE218475 で NCBI-GEO で入手できます。質量分析プロテオミクスデータは、データセット識別子 PXD038282 とともに PRIDE パートナーリポジトリを介して ProteomeXchange コンソーシアムに寄託されています。

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この研究は、パスツール研究所、フランス政府の「プログラム投資計画」の枠組みで資金提供された「新興感染症の統合生物学」(LabEx IBEID)、およびANR DifBioRel AAPCE5から資金提供を受けました。 EA はパリシテ大学の博士研究員です。 LH はソルボンヌ大学の博士研究員です。

パスツール研究所、パリシテ大学、UMR-CNRS 6047、嫌気性細菌の病因研究室、F-75015、パリ、フランス

エミール・オーリア & ブルーノ・デュピュイ

パスツール研究所、パリシテ大学、INSERM UMR1222、治療および病理学における抗体ユニット、パリ、フランス

リセ・ユノー

ソルボンヌ大学、INSERM、CNRS、免疫感染症センター (CIMI-パリ)、F-75013、パリ、フランス

リセ・ユノー

分子生物物理学プラットフォーム、パスツール研究所、CNRS UMR3528、パリ、フランス

パトリック・イングランド

バイオミクス技術プラットフォーム、パスツール研究所、パリ、フランス

マーク・モノ & ジュリアナ・ピポリ・ダ・フォンセカ

プロテオミクスプラットフォーム、パスツール研究所、パリ、フランス

マリエット・マトンド & マガリー・デュシャトー

サスカチュワン大学生化学、微生物学、免疫学部、サスカトゥーン、サウスカロライナ州、カナダ

ヤニック・DN・トレンブレイ

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EA と BD は研究と実験を設計しました。 EA、LH、PE、JPF、MD、BD が実験を実施しました。 M.Monot と M.Matondo は、それぞれトランスクリプトーム分析とプロテオーム分析を支援しました。 EA と BD が原稿の起草と編集を行いました。 PE、M.Monot、MD、M.Matondo、YDT が執筆と編集を手伝ってくれました。著者全員が最終原稿を読んで承認しました。

ブルーノ・デュピュイへの手紙。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

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転載と許可

アウリア、E.、ユノー、L.、イングランド、P. 他。細胞壁リポタンパク質 CD1687 は、クロストリディオイデスディフィシルにおけるデオキシコール酸誘導性バイオフィルム形成中に DNA 結合タンパク質として機能します。 npj バイオフィルムマイクロバイオーム 9、24 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41522-023-00393-5

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受信日: 2022 年 12 月 6 日

受理日: 2023 年 4 月 27 日

公開日: 2023 年 5 月 11 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41522-023-00393-5

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