デスキャップキノコのテングタケ属とハラタケ属のパンゲノミクスにより、侵入範囲における毒素遺伝子の動的な進化が明らかになった

ISME Journal (2023)この記事を引用する

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メトリクスの詳細

欧州産の有毒キノコであるテングタケ属（「死の帽子」）がカリフォルニアに侵入している。デスキャップの有毒な二次代謝産物が侵入するにつれて進化しているかどうかは不明です。私たちは、毒性の根底にあるMSDIN遺伝子を同定するためのバイオインフォマティクスパイプラインを開発し、カリフォルニアの侵襲的集団およびヨーロッパ範囲からの88のデスキャップゲノムを調査し、コア要素とアクセサリー要素の両方から構成されるこれまで予想されていなかったMSDINの多様性を発見しました。各デスキャップ個体は独自の一連の MSDIN を所有しており、毒素遺伝子はカリフォルニアのサンプルとヨーロッパのサンプルで大きく異なります。 MSDIN 遺伝子は強力な自然選択によって維持されており、化学プロファイリングにより MSDIN 遺伝子が発現され、異なる表現型が得られることが確認されます。私たちの化学プロファイリングでは、新しい MSDIN ペプチドも特定されました。毒素遺伝子はゲノム内で物理的にクラスター化されています。私たちは、ハラタケ目全体のゲノムで MSDIN を探索することで発見を文脈化し、MSDIN の多様性が属間の独立した遺伝子ファミリーの拡大に由来していることを明らかにしました。また、「致死性のテングタケ属」クレード以外のテングタケ属で MSDIN が発見されたことも報告します。最後に、Clavaria fumosa における MSDIN 遺伝子とそれに関連するプロセシング遺伝子 (POPB) の同定は、MSDIN の起源がこれまで考えられていたよりも古いことを示唆しています。 MSDIN の動的な進化は、MSDIN が生態学的相互作用を媒介する可能性を強調しており、進行中の侵入に MSDIN が関与していることを示しています。私たちのデータは、収斂的に進化した動物の毒素との顕著な類似点を強調し、毒キノコの進化の歴史の理解を変えます。私たちのパイプラインは、他の担子菌の二次代謝産物を探索するためのロードマップを提供し、創薬の探索を可能にします。

膨大な科学文献には、新しい環境に導入された生物の成功を可能にする生態学的および進化的メカニズムが特徴付けられています [1、2]。研究は、生物侵入による生態学的および経済的被害の軽減を導くために使用されてきました[3]。しかし、侵入生物学は主に植物 [4] および動物 [5] 種に焦点を当ててきました。グラデューら。 [6] 真菌の侵入は植物や動物の侵入よりも一般的である可能性があり、真菌の目立たない性質が研究を妨げていることを示唆していると推測しています。一方、侵入性の菌類は森林を荒廃させ [7]、いくつかの両生類やコウモリを絶滅寸前に追い込み [8、9]、人間の病気を引き起こしています [10]。しかし、侵入性の非病原性（共生的で分解性）真菌が新しい環境で成功するための形質については、比較的ほとんど知られていない。

真菌の二次代謝産物 (SM) は、一次代謝産物とは異なり、生態学的相互作用を媒介すると考えられています [11]。 SM は多くの菌類に共通しており、競争を仲介し [12、13、14]、宿主範囲に影響を与え [15、16]、環境ストレス要因から保護することによって種のニッチを形成します [17、18、19]。最近まで、SM プロファイルは、種内での変動が比較的少ないかまったくなく、種を定義すると考えられていましたが、新しいデータは、局所的な適応が種内の SM 多様性の集団固有のパターンとして現れる可能性を示唆しています [20]。集団特異的な SM は種の地理的範囲に影響を与え、マクロ進化の推論に情報を与えます [20]。真菌 SM に関する研究のほとんどは子嚢菌を対象としています。キノコはその化学的性質、特に幻覚や中毒を引き起こす能力で悪名高いが、複雑な生活史、遺伝学、担子菌を操作する技術的課題により、キノコの SM の多様性をカタログ化するツールの開発が妨げられ、進化の歴史の記述が限られている。

「デスキャップ」テングタケ属 (Vaill. ex Fr.) Link は、悪名高い有毒な外生菌根性担子菌で、ヨーロッパ原産で、北米、特にカリフォルニアを含む他の地域に導入されました [21、22]。外生菌根菌は、植物種間の競争力学を変化させ[23]、土壌群集構造を変化させ[24]、金属恒常性を促進し[25]、栄養循環に影響を与える可能性がある[26]。カリフォルニアにおけるデスキャップの生息域拡大による潜在的な生態学的影響はまだ不明であるが、その豊富さ [27] と、そのキノコに関連するしばしば致命的な中毒 [28] により、多くの著者はそれが侵入的であると特定している [29]。非在来の外生菌根菌の蔓延と成功に寄与する要因は、一次継承モデルに基づいて特定されている[30]が、在来の生物多様性との競合的相互作用または防御的相互作用も蔓延を促進するかどうかは未調査のままである。種間の相互作用は SM によって媒介されることがよくあります。植物では、SM は種の侵入範囲で特に顕著な影響を及ぼし、「ナイーブな」在来生物と競合する場合に「新しい武器」を提供する可能性があります [31、32]。 A. phaloides のさまざまな個体群が武器を使用するか悪用するかは不明です。

A. phaloides の悪名高い毒性を支えるいくつかの化合物が特定されており、これには α-アマニチン、ファロイジン、ファラシジンが含まれます [33]。これらの毒素は、保存されたアミノ酸「リーダー」モチーフ Met-Ser-Asp-Ile-Asn に基づいて、「MSDIN」と名付けられた最近発見された SM クラスの構成要素です。 MSDIN 遺伝子は、リボソームで合成され翻訳後修飾された短い (35 ～ 36 アミノ酸) ペプチド (RiPP) をコードしています [34]。 MSDIN 特異的プロリルオリゴペプチダーゼ (POPB) は、MSDIN プロタンパク質の保存されたリーダー部分と「フォロワー」部分を切断し、最終生成物となる、または最終生成物となる環状「コア」を生成します [35]。多様な MSDIN コアペプチドの環化は化学分析を通じて実証されていますが (Zhou et al. [36])、環化は高度に保存されたリーダーおよびフォロワーモチーフに基づく配列データから直接推測されることがよくあります。 SM 文献の象徴である MSDIN の研究は、単一または少数の参照ゲノムを使用して、さまざまな種からの新しい配列を特定することに焦点を当ててきました。種内のこれらの遺伝子の多様性についてはほとんど知られていません。現在までに、α-アマニチンをコードする MSDIN 遺伝子がハラタケ目全体に不連続に広がっており、ガレリーナ属、レピオタ属、およびテングタケ属にのみ存在することがわかっています [33]。何人かの著者は、MSDIN 遺伝子の不連続な分布を説明するために遺伝子の水平伝達を推測しています [33、37]。しかし、遺伝子の進化の歴史における水平伝達と垂直伝達の両方の相対的な重要性については疑問が残っています(Waltonによる総説[33])。 α-アマニチンの生合成に関与するさらなる遺伝子の最近の同定は、まだ同定されていない別の祖先種もMSDINの起源に関与している可能性を示唆している[38]。 α-アマニチンはガレリーナ種によって産生される唯一のMSDINである[39、40]が、MSDIN遺伝子ファミリーはテングタケ属で拡大し、その結果、さまざまな種で数十の固有のMSDINが見られるようになった[34、41、42、43]。 MSDIN は昆虫、線虫、その他の動物に対する防御を仲介すると仮説が立てられています [33]。しかし、これらの化合物の種内多様性に関する情報が不足しているため、テングタケ属の MSDIN の自然史と多様化を説明するために必要な、対象を絞った生態学的実験が不可能になっています。

私たちは、MSDIN 遺伝子の同定を自動化するバイオインフォマティクスパイプラインを開発することにより、侵襲的なカリフォルニア (CA) 集団における相互作用を形成する MSDIN 遺伝子産物の可能性を確立しようとしました。特に次のことを問いました: (1) カリフォルニアの A. phaloides 個体のゲノムはそれぞれコードをコードしているかMSDINS の同じスイートです。そうでない場合、MSDIN パンゲノムはどのように構造化されており、コア遺伝子とアクセサリー遺伝子は存在しますか? (2) 毒素遺伝子は自然選択によって維持されているのでしょうか? (3) MSDIN 遺伝子ファミリーの拡大は、テングタケ属の種分化よりも前から行われていたのでしょうか。そして、この拡張により、ゲノム内での MSDIN の物理的な分布はどのように形成されたのでしょうか? また、化学分析を使用して、よく知られているMSDIN製品の生成を確認し、新しいMSDINペプチドを探索しました。MSDIN遺伝子製品が発現および翻訳され、その結果、生態学的相互作用を媒介する可能性のある測定可能な表現型および化合物が得られることが強調されました。

A. phaloides のキノコは、米国カリフォルニア州ポイントレイズ国立海岸の単一侵入集団 (n = 68) とヨーロッパ全土の在来集団 (n = 20) から集中的にサンプリングされ、合計 88 のゲノムが得られました (表 S1)。。キノコは 1978 年から 2015 年の間に収集され、ほとんどのサンプリングは 2014 年と 2015 年に集中しました (表 S1)。また、カンザス州（A. thiersii）とアルゼンチン（A. foetens）でテングタケ属（Amanita thiersii）とテングタケ属（Amanita foetens）と推定されるキノコを収集し、これらのゲノムを比較分析および対照として使用しました。収集したキノコに 1 ～ 90 の番号を付けました (例: 1mAP、2mAP)。私たちの番号は、Pringle 研究所から生成された他の出版物で使用されている AmanitaBASE 番号に対応しています [44] (表 S1)。非常に品質の悪いアセンブリを持つ単一のキノコ (7mAP; 表 S1) が MSDIN 遺伝子の最初のスキャンで使用されましたが、その後の分析からは除外されました (7mAP アセンブリは、BUSCO の測定で 10% 完了しており、次に最も悪いアセンブリでした) A. phaloides の完成率はそれぞれ 72.1%、91%、92% でした)。

Wangらによって記載されているように、251 bpのペアエンドリードを備えたRapidモードのHiSeq2500 (Illumina)プラットフォームを使用してゲノムDNAを抽出し、配列決定した。 [45]。単一の分離株 (72mAP) も、ロングリード (N50 = 6310 bp) の PacBio RS II Sequel プラットフォームで配列決定され、データは参照ゲノムの構築に使用されました [45]。 SNP は、ベストプラクティス (https://gatk.broadinstitute.org/hc/en-us/articles/360035535932-Germline-) に従って、GATK パイプライン [46] (表 S1) を使用して呼び出されました (Wang et al. [45])。ショートバリアントディスカバリー-SNPs-Indels-)。次に、非モデル生物用の GATK ワークフロー (https://gatk.broadinstitute.org/hc/en-us/articles/360035890471) で定義されたパラメーター、特に: QD < 2.0 || を使用して、SNP をハードフィルター処理しました。 FS > 60.0 || MQ < 40.0|| MQRankSum < −12.5 || SNP の ReadPosRankSum < -8.0。 || および QD < 2.0 || FS > 200.0 || インデルの ReadPosRankSum < -20.0。同じ遺伝子に属するキノコ (単一の菌糸体個体によって生成されたクローン) は、Wang et al. に記載されているように同定されました。 [45]。簡単に言うと、クローンは 2 つの異なるアプローチを使用して同定されました。1 つ目はフィルター処理された SNP から得られるユークリッド距離行列を使用し、2 つ目は血縁分析に基づいています (Wang et al. [45])。さらに、過去の研究では処理されたが、（私たちの研究では明らかではなかった）低品質の配列の懸念のために使用されなかった単一の分離株（1mAP）は、ここで特定された系統発生的関係に基づいてクローン修正されました（図1）。どちらのアプローチでも、同じ遺伝的個体、またはジェネットが特定されました [45]。

38 個の A. phaloides、1 個のテングタケ属 thiersii および 1 個のテングタケ属 foetens 標本間の系統関係が、ゲノムワイド SNP を使用して構築された最尤法ツリーで描かれています。色付きのボックスは、特定の「コア」配列によって定義される MSDIN 対立遺伝子の存在を示します。ゲノム内の特定の物理的位置にある対立遺伝子または対立遺伝子のグループを表す遺伝子座は、空白の列で区切られています。 1 より大きいカウントは、同一の対立遺伝子をコードする重複した遺伝子座を示します。高品質の参照ゲノムでは 3 つの重複を検証しました (補足方法を参照) が、他のゲノムでは重複を検証できず、アセンブリエラーが発生する可能性があります。この理由から、我々は参照ゲノム (*) から 3 つの重複遺伝子座を折りたたみ、他の推定上の (ただし未解決の) 重複との一致を提供しました。コア配列が SNP データから推定された場合、ゲノムアセンブリ内に見つからなかったとしても、そのカウント値は 1 に設定されました。図の下部にある「既知」の決定は、MSDIN コア配列または化学製品の特性に関する以前のレポートに基づいています。遺伝子座名 (黒文字) は、参照ゲノムアセンブリに存在する対立遺伝子に基づいています (太字の 72mAP を参照)。参照ゲノムに見つからない単一遺伝子座の名前 (FILAPIIP) はアルファベット順に選択されました。ヒートマップの上のパネルは、カリフォルニア人 (赤) とヨーロッパ人 (オレンジ) の間の対立遺伝子頻度の違いを示しています。各遺伝子座における対立遺伝子頻度の大きな違いは、分子分散分析に基づいています。遺伝子座 AFPHFYVPP、FFPIVFSPP、FIFPPFFIPP、および SFFFPIP は、一部のコールにおける不確実性のため、対立遺伝子頻度解析には含まれませんでした (結果を参照)。 † これらの MSDIN 配列は、毒素として特徴づけられた生物活性を持つ成熟産物に関連付けられています。左から右へ: ファラシジン (AWLVDCP)、ファロイジン (AWLATCP)、β-アマニチン (IWGIGCDP)、α-アマニチン (IWGIGCNP)。

アダプターと低品質の配列は、BBMap v38.32 [47] を使用して生のリードからトリミングされました。トリミングされたリードは SPAdes v3.5.0 [48] を使用してアセンブルされました。既存のソフトウェアを使用してゲノム内の MSDIN 遺伝子にアノテーションを付ける試みは、遺伝子アノテーターが既知の MSDIN セットでトレーニングされた場合でも失敗しました。したがって、私たちは目的の遺伝子を特定するための独自のパイプラインを開発しました。

ゲノムアセンブリ内の MSDIN 配列を特定するために、カスタマイズ可能なバイオインフォマティクスパイプラインを作成しました。アセンブリデータから得られた MSDIN の有無の推論は、以下に説明するように、アライメントデータに基づいて検証されました。簡単に説明すると、一連の既知の MSDIN 配列が、ゲノムの最初の tBLASTn [49] 検索で使用されました (表 S2)。発表された研究[43]と一致するカットオフである100未満のe値を持つヒットは、すべてのリーディングフレームで翻訳され、MEME[50]で特定されたリーダーおよびフォロワーモチーフで訓練されたMASTを使用してMSDIN様モチーフをスキャンされました。リーダー配列モチーフがフォロワーモチーフの上流で見つかり、MEME によって e 値が 100 未満と決定されたタンパク質は、さらなる分析のために保持されました。考えられるすべてのイントロン (非標準 GC-AG イントロンを含む) が同定され、得られたタンパク質は MSDIN 遺伝子の既知の特性に基づいてフィルタリングされました (Walton [33]; Supplementary Methods によって詳述)。私たちのパイプラインは、補足資料で入手可能な一連の自己完結型で簡単にカスタマイズ可能なスクリプトで構成されています。私たちのパイプラインは、よく研究されたゲノム内で以前に同定されたすべての MSDIN 遺伝子を見つけます (補足方法を参照)。

ただし、新規 MSDIN の同定を可能にする戦略として、「MSDIN 様」配列も出力に含まれるようなバイオインフォマティックパイプラインパラメーターを選択しました。最終的に、Agrocybe cylindracea (この種の名前は NCBI との一貫性を保つために残されていますが、現在は Cyclocybe cylindracea として知られています) と Mycena chromophos のゲノムで見つかった 3 つの MSDIN 様配列をさらなる分析から除外しました。これらの配列はパイプラインの最小カットオフ値に該当し、既知のMSDIN配列との系統学的関係と、対応するゲノムにPOPBが存在しないことは、それらが実際にはMSDINではないことを示唆しています（補足結果;図S1）。

アセンブリエラーや断片化に関連する問題を回避するために、MSDIN の有無の呼び出しはすべて、アライメントベースの方法を使用して検証されました。 MSDIN パイプラインによって生成されたファイルは、ターゲットゲノム内の MSDIN 領域を識別し、アライメントデータをサブセット化できるようにします。我々は、BWA MEM [51]を使用して、A. phaloides のすべてのゲノムからのリードを参照ゲノムにアライメントしました。 MSDIN 遺伝子座の読み取り深度は、BEDTools [52] を使用して決定されました。大規模な欠失を伴わないアライメントの場合、SAMTools faidx [53] と VCFTools [54] の vcf-consensus を使用して、インデルと SNP (Wang et al. [45] から) を参照ゲノム配列に再挿入しました。次に、SNP/インデルの再挿入から得られた配列をアセンブリ結果と比較しました。 MSDIN の存在がアライメントデータによって強く裏付けられているが、配列がアセンブルされていない場合は、アセンブルエラーを推測し、アライメント結果から直接 MSDIN を推測しました。アライメント結果とアセンブリ結果の間に不一致が見つかった場合、IGV [55] を使用して、影響を受けていないアライメントと並べて関連するアライメントを視覚化しました。アセンブリデータとアライメントデータの間の不一致は、SPAdes [48] が 1 つの対立遺伝子のみを組み立てる 2 つの可能な MSDIN 配列をもたらすヘテロ接合 SNP の発生によって最も頻繁に説明されます。遺伝子座の小さなサブセットでは、複数のヘテロ接合性 SNP がバリアント呼び出しソフトウェアによってフェーズ化されませんでした (つまり、二核内の一方または他方の相同染色体と関連付けられていません)。これらの場合、我々は再び IGV を使用して、すべての (クローン補正された) アライメントを視覚化することで SNP フェーズを手動で確認しました [55]。

MSDIN 遺伝子座が参照ゲノムに存在しない場合、すべてのゲノムからのリードを新規 MSDIN および最高品質のアセンブリ (BUSCO スコアによって決定) を含むゲノムにアライメントしました。このような場合、上記のように軌跡を精査しました。ただし、これらの例はまれであるため、SNP は再度呼び出されず、代わりに、IGV のアライメントデータの視覚化を通じてバリアントが手動で推測されました [55]。まれに、非常に密接に関連した遺伝子座間のリードの不整列が観察されましたが、これは通常、整列した分離株の対応する遺伝子座が参照に存在しない場合に発生します。

参照ゲノムへの SNP の再挿入は、MSDIN が同じ遺伝子座で共起する強力な証拠を提供しました。遺伝子座の構造は、コンティグの大規模なアラインメントによってさらに検証されました (補足方法で詳しく説明されています)。遺伝子座 AFPHFYVPP はロングリード参照ゲノムでは組み立てられませんでしたが、ショートリード (72 mAP) のみを使用したアセンブリでは明らかでした。遺伝子座は通常、参照ゲノムで見つかった対立遺伝子に基づいて命名されます。ただし、FILAPIIP 遺伝子座は参照ゲノムには見つからず、その名前はアルファベット順に選択されました。

MSDIN の物理的なクラスタリングは、MSDIN の分布を評価するために二項式を使用して評価されました。さらに、補足方法で詳述されているように、順列テストを実行して、MSDIN 遺伝子座間の観察された距離をランダム分布と比較しました。物理的距離と遺伝的距離の間の相関は、R で実装されたピアソンの相関検定を使用して計算されました。R パッケージ ggplot2 [56]、ggtree [57]、および ggtreeExtra [58] を使用して、A. phaloides 個体間の MSDIN の分布を視覚化しました。

私たちの結果に系統学的コンテキストを提供するために、2021 年 11 月 22 日に NCBI から入手可能な 249 のハラタケ目ゲノム (163 種に相当) をダウンロードしました (表 S3)。真菌全体で保存されている単一コピーのオルソログのセット (OrthoDB v9) は、BUSCO を使用してすべてのゲノムで同定されました [59]。 MAFFT v7.475 [60] を「-auto」設定で使用して BUSCO シーケンスを調整しました。結果のアライメントは、「-automate1」パラメータを指定したtrimAl v1.2を使用してトリミングされ、制約された「-mset」パラメータを使用して最適なモデルをテストした後、IQ-TREE v1.6.2 [61]で最尤ツリーを構築するために使用されました。 RAxML 互換モデル内。必要に応じて、超高速ブートストラップ近似の 1,000 回の複製を使用して、IQ-TREE でブートストラップが実行されました。 BUSCO 木のコンセンサス系統発生は ASTRAL を使用して推定されました [62]。我々は、UpSetR [63] で生成された UpSet プロットを使用して種間の MSDIN コア配列を比較し、Luo らのデータを追加しました。 [38] 違いと重複を特定します (表 S2 および S4)。我々は、VCFtools [54]を使用して 1 kb より近い SNP がないように間引きされたフィルター処理された 2 対立遺伝子 SNP データから、ここで使用した A. phaloides、A. thiersii、および A. foetens 分離株間の系統関係を確立しました。 SNP のこのサブセットは、上記のように IQ-TREE を使用して処理されました。

POPB 遺伝子は、MSDIN プロタンパク質の翻訳後修飾に必要な酵素をコードしており、それらを同定するために、NCBI から POPB および POPA (POPA は密接に関連した遺伝子であり、MSDIN の成熟に影響を与えない) タンパク質配列のセットを入手しました (図) .S2および表S5）。我々は、tBLASTn を使用して、e 値が 0.01 未満のすべてのヒット (非常に短いアラインメントを含む) に基づいて、すべてのハラタケ目ゲノム内の標的領域を特定しました。 SAMtools faidx [53] を使用して、各ヒットの両側に隣接する 6 kb (合計 12 kb、関連するコンティグの最後に到達した場合はこれより少なくなります) を抽出しました。事前に構築されたLaccaria bicolor遺伝子モデルを備えたAUGUSTUS v3.4.0 [64]を使用し、既知のPOPAおよびPOPB配列からのタンパク質キューを使用して、標的領域内の候補遺伝子を特定しました（表S5）。標的領域で見つかったすべてのタンパク質について、BLASTp を使用して既知の POPA および POPB 配列を再度調べました。各ゲノムからの上位 10 の POPA および POPB ヒット (ビットスコアによってソートされ、利用可能な場合は最大 20 配列) が分析されました。これらのタンパク質配列は、MAFFT を使用して既知の POPA および POPB 配列と位置合わせされ、trimAl を使用してトリミングされ、系統発生的関係が分析されました。それらの中には、上で詳述したように、IQ ツリーを使用して決定されたものもあります。得られた系統発生は手動で検査され、候補配列が他の既知の POPB 配列と単系統クレードを形成する場合に、POPB の存在が推測されました。

予備的なバイオインフォマティクスデータに基づいて、MSDIN の多様性を可能な限り表すために、3 つのヨーロッパ産 (5mAP、9mAP、および 29mAP) と 3 つのカリフォルニア産 A. phaloides 標本 (21mAP、23mAP、および 75mAP) が選択されました。各乾燥キノコの少量のサンプルを粉砕して細かい粉末にしました。各サンプルを 10 mL の 100% メタノールで抽出し、濾紙に通しました。抽出物を空気中で乾燥するまで減量し、重量を量り、最終濃度 1 mg/mL で 100% メタノールに再懸濁しました。

UHPLC-HRMS は、陽イオン化モードで動作する Thermo Scientific Q Exactive ハイブリッド四重極オービトラップ質量分析計に接続された Thermo Scientific Vanquish UHPLC システムで実行されました。 Waters Acquity UPLC BEH-C18 カラム (2.1 × 100 mm、1.7 μm) をアセトニトリル (0.1% ギ酸) および水 (0.1% ギ酸) とともに流速 0.2 mL/min で使用しました。スクリーニング勾配法は次のように実行されました: 10% 有機物で 5 分間開始し、続いて 20 分かけて 90% 有機物まで直線的に増加し、2 分間で 98% 有機物までさらに直線的に増加し、98% 有機物で 5 分間保持します。、3分間で10%の有機物に戻し、最後の2分間は10%の有機物を維持し、合計37分間。分析のために各サンプル 10 マイクロリットルがシステムに注入されました。 3 つのよく知られた MSDIN 毒素、α-アマニチン、ファロイジン、およびファラシジンは、プロファイルを Cayman Chemical (米国ミシガン州アナーバー) から購入した標準と比較することによって同定されました。これら 3 つの化合物の絶対定量は、標準曲線 (0.1 ～ 10 ppm) と比較して計算されました。

集団遺伝分析では、クローン補正されたデータセットを使用して人口統計パターンを特定しました。 PopGenome R パッケージ [65] を使用して、アラインメントデータから 500 bp ウィンドウで Tajima の D および多様性統計を計算しました。ヨーロッパとカリフォルニアの間の MSDIN 遺伝子含有量の差異は、GENALEX の MOlecular VAriance (AMOVA) 分析を使用して計算されました [66]。ヨーロッパとカリフォルニアのサンプル間の遺伝子分離は、poppr R パッケージで実行される主成分の判別分析 (DAPC) を使用してさらに検証されました [67]。

dN/dS 比を測定するために、MAFFT を使用して MSDIN ヌクレオチド配列をアラインメントし、上記のパラメーターを使用して IQ-TREE で系統発生を構築しました。配列アラインメントは、Pal2Nal [68]を使用して再フォーマットされました。次に、PAML を使用して系統全体にわたる単一の dN/dS 比を推定しました [69]。

当社の MSDIN 探索バイオインフォマティックパイプラインとその後の手動検証により、88 個の A. phaloides ゲノムから 43 個の固有の MSDIN アミノ酸配列（成熟ペプチドとなる MSDIN のコア領域によって定義される）を表す 2940 個の MSDIN 配列が特定されました（表 S1）（表 S2））。固有の MSDIN シーケンスのうち 13 個が新しいものです (図 1、表 S2)。これらの新しい配列のうち 2 つ (FLPPFLP および IWGKGCDP) は 1 人の個体でのみ発見され、特定の遺伝子座と明確に関連していません。両方をさらなる分析から除外しました。クローン補正を使用して、同一またはほぼ同一のゲノムを 1 つのデータポイントにまとめました [45]。クローン補正されたデータセットで、38 匹の A. phaloides 個体の合計 1,308 個の MSDIN 配列を特定しました (図 1)。これらのヨーロッパ人 16 人とカリフォルニア人 22 人で見つかった固有の MSDIN 配列の数は 25 ～ 32 の範囲で、中央値は 29 でした。A. phaloides の MSDIN パンゲノムは、15 のコアゲノム (すべての分離株で見つかった) と 26 のアクセサリーゲノム (見つかった) で構成されています。一部の分離株のみ）MSDIN。アクセサリーゲノム MSDIN のうち 2 つが、1 人を除く全員で見つかりました (図 1)。組み立てられたゲノムは平均して 94.1% 完成していましたが、平均 42,500 個のコンティグに断片化されていました (表 S1)。見つかったMSDINの数は、ゲノムの完全性と正の相関はありませんでした（図S3）。

41 個の固有の MSDIN 配列が 31 個の異なる遺伝子座にマッピングされました。各遺伝子座は 1 ～ 3 つの対立遺伝子をコードします (図 1)。これらの遺伝子座のうち 30 個が参照ゲノムで見つかりました (表 S6)。参照ゲノムアセンブリに存在する対立遺伝子に基づいて遺伝子座に名前を付けました（図1の下部の黒いテキストを参照、補足方法）。 3 つの MSDIN、IWGIGCDP (β-アマニチン)、AWLATCP (ファロイジン)、および LIQRPFAP (特徴付けられていない) はそれぞれ、参照ゲノム内の 2 つの異なる (重複した) 遺伝子座で見つかりました。ただし、私たちが使用したゲノムアセンブラーは通常、同一の対立遺伝子を単一の配列に分解します。実際、密接に関連している（ただし異なる、つまりヘテロ接合性の）対立遺伝子でさえ、SNP データからのみ明らかになる場合がありました。逆に、二核生物の核における MSDIN 付近の配列変異により、同じ遺伝子座にある 2 つの同一の配列が 2 つの異なる対立遺伝子としてアセンブリ内に現れる可能性があります。高品質の参照ゲノムで IWGIGCDP、AWLATCP、および LIQRPFAP の重複を検証することはできましたが (補足方法を参照)、他のゲノムでの他の MSDIN の重複を検証することはできませんでした。これらの理由から、我々は保守的なアプローチを選択し、これら 3 つの重複遺伝子座を折りたたんで、アセンブリ内の対立遺伝子の複数のコピーの存在 (つまり、特定の配列の「数」) が未解決の重複を示唆していることを強調しました (図1）。

さらに、遺伝子座 FFPIVFSPP と FIFPPFFIPP は物理的に非常に近く、同じ対立遺伝子をコードしているように見えることが多く、データの非特異的マッピングに関する懸念が生じます。参照ゲノムではこの遺伝子座が欠落しているため、参照ゲノムにアラインメントするときに、AFPHFYVPP からのリードの非特異的アラインメントが時々観察されました (補足方法を参照)。同様に、参考文献に存在しない SFFFPIP 遺伝子座の重複により、SFFFPIP 配列を解決する能力について懸念が生じました (3 つの対立遺伝子の数を含む分離株を参照、図 1)。これらの推定上の未解決の重複に関連する解釈エラーを回避するために、FFPIVFSPP、FIFPPFFIPP、AFPHFYVPP、または SFFFPIP はさらなる分析には含めませんでした。私たちの結果はMSDINの遺伝子座構造を解きほぐし始めていますが、これらの密接に関連した配列を完全に解明するには、新たなロングリード技術が必要になるでしょう。

カリフォルニアとヨーロッパのコレクションは遺伝的に異なり、ここでサンプリングされたヨーロッパの単一の場所が、カリフォルニアでサンプリングした侵入死キャップの供給源ではないことを示唆しています（図S4）。天然標本と侵入標本の間のアクセサリーゲノム対立遺伝子の頻度の違いが異なる進化の歴史を反映しているかどうかを明らかにするために、AMOVAを使用してMSDIN遺伝子座における遺伝的分散の有意な分割をテストしました。 MSDIN 対立遺伝子の頻度は、すべての遺伝子座にわたって有意に区別されました (p = 0.001、ΦPT = 0.31)。個々の比較により、それぞれ ΦPT > 0.24 を有する 4 つの有意に区別された遺伝子座 (多重比較補正後 p < 0.005) が特定されました (図 1)。コア配列 IFLVFPIPP、LPILPIPPLP、GVILIIP、GFPPFFFPP、および FFLIVFFPP はヨーロッパの標本でのみ見つかります。カリフォルニアの侵入者集団における潜在的な創始者効果と一致して、カリフォルニアに固有の MSDIN 配列は存在しません。ただし、一部の対立遺伝子はカリフォルニアでより頻繁に見つかります。たとえば、IIGILLPP 遺伝子座の IVGILGLP 対立遺伝子はカリフォルニアでは優勢な対立遺伝子ですが、ヨーロッパの標本の中では比較的まれです (図 1 の上部の棒グラフを参照)。ヨーロッパが単一のパンミック集団である可能性は低く[21]、侵襲的範囲におけるMSDIN対立遺伝子頻度がヨーロッパ内の現在不明の発生源集団と比較してどのように変化したかを明らかにするには、より多くの収集が必要である。

MSDIN ペプチドは、いくつかの一般的なペプチドおよび/またはその誘導体の極度の毒性により悪名が高いです。致死毒素には、α-アマニチン (IWGIGCNP)、β-アマニチン (IWGIGCDP)、ファロイジン (AWLATCP)、およびファラシジン (AWLVDCP) が含まれます [33]。これらのペプチドをコードする遺伝子は、パンゲノムの高度に保存された構成要素です (図 1)。 6 つの抽出物の LC-MS/MS プロファイルは、対応するキノコのそれぞれが α-アマニチン、ファロイジン、およびファラシジンを合成したことを明確に示していますが、相対量はサンプル間で異なりました（図 S5）。キノコ間の遺伝的差異が毒素生成の変動に影響を与えるかどうかは不明ですが、生態学的および発生上の変数は胞子果に見られる毒素の量に寄与しています（Walton et al. [33]によるレビュー）。化学的に未記載のMSDIN製品であるシクロアマニドG（GFFPPFFFPP）も、イタリアでサンプリングされた5mAPキノコの抽出物中に同定されました（図S6）。この配列は、新たに同定されたアクセサリー遺伝子と正確に一致しました (図 1)。簡略化と過去の研究 [33] との一貫性のために、翻訳後修飾により成熟 MSDIN 製品が異なる化学分類に分類される場合があるにもかかわらず、共通の生合成を持つすべての MSDIN 化合物を「シクロアマニド」と呼びます。

属間および A. phaloides 内での MSDIN の比較により、毒素遺伝子が選択中であることが明らかになりました。コアのα-アマニチン配列に作用する強力な精製選択は、属間の比較で明らかです (図 2)。 A. phaloides 内では、高度に保存されたリーダー領域とフォロワー領域も選択の純化を示唆していますが、非常に可変性の高いコア領域は選択の多様化を反映している可能性があります (図 2)。 MSDIN コア領域の多様化の推進力として中立的な進化を排除することはできません。その情報サイトはすべてのアライメントで飽和しているからです。 dN/dS 比は種内で確実に単調ではないため ([70] で概説)、A. phaloides 内の個々の MSDIN コア配列に作用する選択についてはテストしませんでした。選択は、サイトの周波数スペクトルの人口レベルの指標から推測することもできます。しかし、私たちのサンプリング戦略は、ヨーロッパの多様性の範囲内で単一のカリフォルニア人集団の多様性を文脈化することに焦点を当てていました。カリフォルニアとヨーロッパの間のサンプリングの違いのため、個々の 500 bp ウィンドウ内に収まる特定の MSDIN 遺伝子座に関連する Tajima の D の推定値を解釈することをためらっています (ただし、これらの値は補足結果と図 S7 に示しています)。個々の遺伝子座で特定された傾向の確実な証拠を提供するには、選択のパターンに対処するために特別に設計された今後の研究が必要です。すべてのスライディングウィンドウの分布におけるゲノム全体のパターンは、カリフォルニア州の人口における Tajima の D の分布におけるプラスの変化を示しています。この変化は、創始者イベント後の希少対立遺伝子の喪失を示している可能性があり、希少対立遺伝子を回復するための人口増加に十分な時間がなかったことを示唆している可能性があります。ヨーロッパのサンプルからの Tajima の D のほぼゼロの中央値は、遺伝的平衡と一致しています。ゲノム全体にわたるTajimaのD測定値の分布（図S7）は、カリフォルニアに移入された集団とヨーロッパ固有の集団の自然史を裏付けていますが、サンプリング関連および人口統計上の影響を完全に排除することはできません（たとえば、実現されていない集団構造にわたる不均一なサンプリング）は、Tajima の D にプラスのシフトをもたらす可能性がありますが、この説明は、カリフォルニア州の地理的に限定されたサンプリングでは考えにくいと考えられます。図 S7、補足結果) [21]。

配列ロゴ内の大きな文字は、所定の部位における特定のアミノ酸残基のより高い頻度に対応します。 PAML で計算された dN/dS 比 (ロゴの上に表示) を使用して、MSDIN のリーダー、コア、フォロワー部分と配列全体に作用する選択を推測しました。 A. phaloides のコア配列 (下、中央) に作用する選択を測定することはできませんでした。これは、この非常に多様な領域全体にわたって有益な部位が飽和しているためです。

MSDIN 配列は、A. phaloides 参照ゲノム内の他の遺伝子と比較して有効なコドンの数が非常に少なく (図 S8)、1 つの仮説は、MSDIN 遺伝子に作用する選択が MSDIN コドンを最適化したことを示唆しています [71]。ただし、MSDIN 遺伝子のパターンは、ゲノム全体のコドンバイアスのパターンを一貫して反映しているわけではなく (図 S8)、他の説明がある可能性があることを示唆しています。コドンの使用法が異なると遺伝子の共制御が可能になり[72]、突然変異率が増加することで結果として得られるアミノ酸配列の多様性に寄与する可能性がある[73]。後者の機能は、イモガイの毒からの環状ペプチドについて示唆されている[74]。 MSDIN 配列におけるコドン使用の重要性を明らかにするには、さらなる研究が必要です。

テングタケ属における MSDIN 遺伝子ファミリーの拡張から生じる MSDIN の物理的分布を文書化すること。まず、100 kb ウィンドウを使用して A. phaloides 参照ゲノムをスキャンしました。それぞれ 2 つの MSDIN 遺伝子座を含む 2 つのウィンドウ、それぞれ 3 つの遺伝子座を含む 3 つのウィンドウ、およびそれぞれ 6 つの遺伝子座を含む 2 つのウィンドウを特定しました (表 S6)。全体的に、MSDIN 遺伝子座は物理的にクラスター化されています (二項式、p < 0.000001)。観察されたMSDIN遺伝子座間の平均距離をランダム化分布と比較したところ、ランダムな偶然で説明できるよりもMSDIN遺伝子座が互いに著しく接近していることが確認されました（p < 0.001）（図3）。さらに、物理的にクラスター化された遺伝子座でコードされた MSDIN 配列は、より離れた遺伝子座の配列よりも相互に密接に関連しています。つまり、完全なコード配列 (p < 0.001 r = 0.6) とイントロン配列のみ (p = 0.002、r = 0.49) (図 3)。

イントロンを含む全長配列から決定された 4 属の MSDIN コア配列間の遺伝的関係を示す最尤法ツリー。この木は、種間の既知の関係を反映するために、早期に分岐した菌類であるクラバリアフモサに根を張っています。ブートストラップサポート値は、テングタケ属を含むクレード内のトポロジを強調するために、ノードのサブセットに含まれています。 MSDIN は完全には解決されていません。いくつかのテングタケ属。読みやすくするために省略されています。すべての種のMSDINにわたるブートストラップ値の完全なセットを図S9に示します。ヒントは一致するように色分けされています。 b A. phaloides と A. subjunquillea の両方のゲノムに共局在する複数の MSDIN 遺伝子座をコードする単一領域の例。 c A. phaloides の MSDIN 遺伝子座間の物理的距離の順列分析は、観察された MSDIN 間の距離 (赤) がヌル分布 (青) よりも大幅に小さいことを示します (破線で示すように p < 0.001)。 d MSDIN コーディング (左) またはイントロン (右) 配列全体からの遺伝的距離は、物理的距離と有意に相関しています (相関検定の場合、それぞれ p < 0.001、r = 0.6、p = 0.002、r = 0.49、最良適合株の場合)それぞれ、R2 = 0.414 および R2 = 0.349)。

他の種の MSDIN 遺伝子座も物理的にクラスター化されています。 Lepiota venenata では、2 つの新規 MSDIN 配列 (以下を参照) が互いに 5 kb 以内に位置しています。 A. ビスポリゲラの 5 つのコンティグはそれぞれ 15 kb 以内に 2 つ以上の MSDIN 遺伝子座をコードしていましたが、このゲノム内の MSDIN 遺伝子座をマッピングする能力は広範な配列断片化によって妨げられました。高品質のテングタケゲノムにおいて、約 13 kb 内の 5 つの MSDIN をコードする 1 つの領域を含む、物理的にクラスター化された遺伝子座を持つ 4 つのゲノム領域を特定しました。 A. subjunquillea および A. phaloides アセンブリのアラインメントにより、この領域が 6 つの MSDIN 遺伝子座をコードする A. phaloides 参照ゲノムの約 25 kb 領域とオルソロガスであることが明らかになりました (図 3)。この領域では、A. phaloides 参照の IRLPPLFLPP 遺伝子座が A. subjunquillea ゲノムに欠落しています。この遺伝子座の 2 つの対立遺伝子のうちの少なくとも 1 つは、すべての A. phaloides 分離株に存在します (図 1)。 A. subjunquillea におけるこの遺伝子座の存在に種内変異があるのか、A. subjunquillea から失われたのか、あるいはこれら 2 つの系統の分岐後に A. phaloides で進化したのかどうかは、未解決の疑問のままです。

テングタケ属の MSDIN 配列の系統解析そしてレピオタはダイナミックな進化の歴史を示唆しています。コード配列は選択の対象となる可能性がありますが、MSDIN イントロン配列は信頼性の高い系統解析を行うには短すぎる (52 ～ 58 bp) ため、コード配列とイントロンの両方を含むエンドツーエンド配列を使用することを選択しました。この系統発生では、異なる属の MSDIN が別個のグループを形成しており (図 3 および S9)、遺伝子ファミリーの拡大が各属で独立して発生したことを示唆しています。 L. venenata と G. marginata のα-アマニチンのクラスター化配列は、一般的なパターンの唯一の例外です。

すべての既知の MSDIN 産生真菌のゲノムは、2 つのプロリルオリゴペプチダーゼ (POP) 酵素をコードしています。最初の遺伝子である POPA は、ハラタケ目全体に広く分布している可能性があり、タンパク質分解ハウスキーピング遺伝子として機能すると考えられています (Walton によって示唆された仮説 [33])。しかし、プロリルオリゴペプチダーゼは、ハラタケ属の種に見出されます。オーソロガスではない可能性があります[37]。 2 番目の遺伝子である POPB は、これまで MSDIN 生産種でのみ発見されており、MSDIN プロタンパク質の成熟に必要です。我々は、これまでに同定されたMSDIN産生種の利用可能なすべてのゲノムにおいてPOPBオルソログを確認した（図4）。また、我々はテングタケ属ポリピラミスのゲノム内でPOPBオルソログを同定した（図4）。これは、POPB遺伝子がテングタケ属内ではあるが「致死性テングタケ属」の単系統クレードの外で発見されたのは初めてである[33]。さらに、初期分岐したハラタケ目の菌類であるクラバリア・フモサにおいてPOPB遺伝子を発見しました。系統解析により、POPAとPOPBの両方が見つかったすべての種でその同一性が確認されました（図S2）。私たちの分析では、一部の種がPOPBと密接に関連するものも含めてPOP遺伝子のセットを拡大していることも明らかにしており（図S2）、将来の研究の別のターゲットとしてPOP遺伝子ファミリーの拡大が示唆されています。より大きなPOPBクレード内の1つの小さな早期分岐サブクレードには、単一のテングタケ属の配列が含まれています（図S2）。このサブクレードに代表的なものを含む他のすべての種は、より大きな POPB クレード内に入れ子になっている追加の POPB 配列を持ち (たとえば、A. phaloides は 2 つの推定 POPB 配列を持っています)、これらの遺伝子の機能について疑問が生じています。 MSDIN 配列のないゲノムにおける POP 遺伝子の潜在的な機能と進化を解明するには、さらなる研究が必要です。

a 私たちの分析と以前に公開された結果に基づいて、種間の MSDIN コア配列の重複を示す UpSet プロット (表 S2 および S4)。セットサイズは、種のすべてのゲノムについて報告された固有の MSDIN コアシーケンスの総数を反映します。種によって利用可能なゲノムの数が異なる可能性があるため、この指標の違いは慎重に解釈する必要があります。交差サイズは、各列の下に黒丸でマークされた種に存在する MSDIN を示します (たとえば、テングタケ属には他の種には見られない 26 個の MSDIN があります。MSDIN IWGIGCNP (α-アマニチン) は、クラバリアを除くすべての種に存在します)フモサおよびテングタケ属ポリピラミス）。公表された研究から特定された MSDIN は再検証されていません。 b シングルコピーオルソログのタンパク質配列（すなわち、BUSCO）の289の最尤ツリーのコンセンサスから決定された、ハラタケ目にわたるMSDIN産生種の系統関係。末端分岐の長さは計算されません。種を分離するすべてのノードの事後確率は 0.93 を超えます。 MSDIN 関連プロセシング酵素 POPB の存在、および MSDIN 配列の数が (それぞれ) 内側のリングと外側のリングに示されています。 249 のゲノムで MSDIN を検索しましたが (表 S3)、このツリーには、少なくとも 1 つの MSDIN と POPB を持つことが判明した種を持つ分類学的ファミリーのみが含まれています。 MSDIN 遺伝子と POPB 遺伝子の両方を持つことが判明したゲノムは星印で強調表示されており、星印の大きさは各種で見つかった総 MSDIN 数も反映しています。 † これらの MSDIN 配列は、毒素として特徴づけられた生物活性を持つ成熟産物に関連付けられています。左から右へ: ファロイジン (AWLATCP)、ファラシジン (AWLVDCP)、β-アマニチン (IWGIGCDP)、α-アマニチン (IWGIGCNP)。 *MSDINを持たない種であるテングタケ属のゲノムは、小さくて初期に分岐したPOPBサブクレードに見られる配列をコードしています（図S2）。この遺伝子が機能するかどうかを明らかにするには、さらなる研究が必要です。

POPB遺伝子の我々の発見と一致して、A.ポリピラミスとC.フモサのゲノムはそれぞれ、これまで同定されていなかった単一のMSDIN（それぞれMSDINATRLP FLPPILP HYAPDDVNYTMLSDSLCとMFDTNDTRVP NWAGFFGWP CSPDTAGDTLNRGKDLC）をコードしている（図4）。我々は、A. ポリピラミスのゲノムにおける 2 番目の推定 MSDIN (MSNVNATRIP GPRPLAFP FFGDEENNALNCGESLC) の同定は、そのコア領域とフォロワー領域の配列の品質が低いため決定的ではないと考えています。これらのゲノムはどちらも標準的な α-アマニチン遺伝子が欠落しているように見えますが、その見かけの欠如はゲノム構築が不完全であることが原因である可能性があります。

α-アマニチン遺伝子は、L. venenata の唯一の MSDIN として報告されています [40] が、Walton は著書の中で Lepiota subincarnata の 6 つの MSDIN 遺伝子を報告しています [33]。我々は、α-アマニチン遺伝子 (MDANATRLP IWGIGCNP WTPESVNDTLTKDLS) に加えて、公開されている [40] L. venenata ゲノム (図 4) で 2 つの追加の MSDIN 配列 (MSDANNTRLP FFVPGLPFPP WTGENADHILARSKDLC および MSDANNTRLP FFAPGLPFPP WTGENADHILARSKDLC) を同定しました (図 4)。これらの配列は Luo らによっても同定されました。 [38]、イントロンを正しく解析することで、結果はフォロワー配列を解決しました。これらの配列の 2 kb 以内にある 4 番目の MSDIN 配列 (MSDLNNTRLP VVTVLFTPPP WSGESVDHSLTRSKDLC) は、スクリプトの可能なイントロン範囲パラメーターを 30 bp 増加した場合にのみ見つかりました。この MSDIN の長いイントロン長が生物学的に関連しているのか、それとも対応する配列データ内に約 30 bp の低品質配列が存在するため、この結果が配列決定エラーを反映しているのかは不明です。私たちの調査結果は、自動化された MSDIN 検索パイプラインの有用性を強調しています。 MSDIN を大規模に識別することも、これまで見落とされていた配列を認識することもできます。

カリフォルニアとヨーロッパのデスキャップ間での毒素遺伝子の動的な進化は、毒性を示唆しており、MSDIN の有無は中立ではありません。異なる個体は異なる一連の遺伝子を所有し、遺伝子は測定可能な表現型をもたらし、少なくともいくつかの配列 (コード化された配列を含む)典型的な MSDIN α-アマニチン) は強力な自然選択を経験します。現在進行中の範囲拡大 [75] は、在来の生息地および侵入した生息地でこの真菌によって生成される毒素の生態学的役割を理解する重要な必要性を強調しています。当社の MSDIN 探索バイオインフォマティクスパイプラインは、A. phaloides 内だけでなく、ハラタケ目全体のパターンを解明し、「敵の放出」 [76] 仮説と新兵器 [31] 仮説の両方のテストを含む、将来の実験のための強固な基盤を構築します。。

デスキャップに見られる毒素に類似した環状ペプチドと構造的に類似した化合物は、イモガイ、ヘビ、クモなどのいくつかの動物種の毒に存在しており[33]、これは収斂進化の顕著な例である。動物では、毒の多様化は、特定の毒素に対する多様な獲物の感受性の違いによって課せられる選択圧に起因することが多く[77、78]、毒成分の数は食事の幅と関連している[79]。私たちのデータは、MSDIN 遺伝子に作用する選択圧についても同様の動態を示唆しています (図 2)。 A. phaloides MSDIN 遺伝子ファミリーのリーダー領域とフォロワー領域は強力な精製選択を受けていますが、コア領域は多様化しています。コア領域は非常に多様であるため、配列を整列させて多様性が中立進化によるものなのか正の選択によるものなのかを明らかにすることができませんでした。グループとしてのコア配列は多様ですが、一部のコア配列は属を超えて保存されています（図4a）。たとえば、α-アマニチンです。強力な精製選択が、α-アマニチンをコードする配列に明らかに作用します (図 2)。アクセサリーゲノム構成要素は、比較的まれな、または不規則に分布した選択圧によって維持されている可能性がありますが、コアゲノム構成要素は、デスキャップの範囲全体で見られる広範な選択圧を反映している可能性があります。ヘビの毒をコードする遺伝子の対立遺伝子頻度は一部の集団では適応的であり、グループ間の選択のバランスをとることで毒の多様化を促進すると考えられている[80]。我々は、MSDIN での選択は、特定の遺伝子産物間の相互作用 (すなわち、冗長性、相乗効果、密度依存性) と局所的な生態学的条件 (例: 菌食動物集団) への適応から生じると推測しています。しかし、MSDIN コアゲノムには悪名高い MSDIN 毒素のほとんどが含まれていますが、ほとんどのコアおよびアクセサリー MSDIN の生物活性は不明のままです。 MSDIN のサブセットには生態学的機能がない場合があります [81]。自然界における MSDIN の機能が定義されるまでは、MSDIN の進化を総合的に理解することは不可能です。

ハラタケ目菌類における MSDIN の進化の歴史 (図 3 および 4) も、クモ毒に含まれるシクロアマニド様化合物群であるノッティンの進化と驚くべき類似点を示しています。ノッティンの共通祖先は、クモ種間で複数の独立した多様化事象を経たと考えられている[82]。同様に、異なる属の MSDIN 配列の明確なクラスタリング (ただし、L. venenata と G. marginata の α-アマニチン配列は例外であることに注意) は、MSDIN の多様化が Lepiota と Amanita で独立して起こったことを示唆しています (図 3)。遺伝子重複とその後のポジティブセレクションがノッティンの多様化のために示唆されている[83]。密接に関連した MSDIN 遺伝子はゲノム内で物理的に互いに近接しており (図 3)、テングタケ属でも新しい遺伝子の生成を促進するメカニズムとして重複とその後の分岐が示唆されています [84]。ノッティンの共通祖先は、強力な生物活性を与えるジスルフィド結合を持っていたと仮説が立てられている[82]。同様に、α-アマニチンの効力は、システインとトリプトファンの間のトリプトチオニン結合に起因すると考えられています。 α-アマニチンは、既知のすべての MSDIN 配列の祖先であることが示唆されています [33]。ノッティンと MSDIN の両方において、化学架橋は祖先毒素のすべての子孫に存在するわけではありません。私たちの結果は、菌類と動物の驚くべき類似点を強調し、収斂進化したが構造的に類似した化合物の進化史における共通の軌跡を示しています。

Walton (2018) は、ハラタケ属の種全体に MSDIN 遺伝子が不連続に分布していることを示唆しています。 (図 4) は、遺伝子の水平転移 (HGT) の結果であり、広範な遺伝子喪失という対立仮説と遺伝子の強力な生物活性を調和させるのは困難です。テングタケ属の中で、MSDIN 遺伝子は致死性のテングタケ属の単系統クレード内でのみ記載されている [85]。 A. ポリピラミス（致死性のテングタケ属クレード外の種）のゲノム内にPOPB遺伝子とMSDIN遺伝子の両方が存在するという我々の発見は、MSDINがテングタケ属に移入された時期を大幅に遅らせ、遺伝子喪失（または不完全）のさらなる推論を必要とする。系統分類）、または A. ポリピラミスと別の生物の間に追加の HGT が存在することを示唆しています。 A. ポリピラミスの MSDIN は、MSDIN 配列のテングタケ属クレード内に巣を作り (図 3)、この配列が致死性のテングタケ属遺伝子ファミリーの拡大が始まった後のある時点で進化した可能性があることを示唆しています。 A. ポリピラミス MSDIN と他のテングタケ属 MSDIN のクラスター化は、この属の進化の歴史と系統発生的に矛盾しており (図 3 および 4)、テングタケ属内の HGT イベントを示していますが、その位置と系統発生の基礎となる短い配列は、これらの MSDIN 間の真の関係が垂直伝達と一致する可能性を残しています。 POPBタンパク質のより長い配列から推測される系統関係は、致死性のテングタケ分岐群の種分化前にA.ポリピラミスへの転移が起こった可能性があるため、属内の垂直および水平伝達の両方と一致します（図S2）。 C. fumosa で見つかった MSDIN 遺伝子と POPB 遺伝子の系統関係は、私たちの種の系統樹と系統発生的に一致しており、これらの遺伝子の起源がこれまで考えられていたよりも古い可能性があることを示唆しています (図 S2)。 MSDIN 遺伝子と POP 遺伝子の進化の歴史に関して私たちの結果が提起する疑問を解明するには、さらに多くのデータが必要です。

複雑なライフサイクル、倍数性、実験室での担子菌の増殖と操作に伴う技術的困難により、担子菌の SM を同定するツールの開発が遅れ、標的を絞った実験が不可能になっています。真菌界の最近の調査では、担子菌門が、十分に研究されていない薬物様化合物のユニークなセットを保有する門であることが強調されている[86]。当社の MSDIN 探索バイオインフォマティックパイプラインは、これまでアクセスできなかった担子菌特異的 SM クラス内での薬剤探査を可能にし、将来の同様のパイプライン開発のロードマップを提供します。

ここで使用したすべての A. phaloides 標本の配列データは、Wang et al. を通じて入手可能です。 [45]。他のすべての分析のデータはすでに公開されており、補足資料で入手可能な特定のアクセッション番号の詳細とともに本文中で適切に参照されています。

MSDIN 探索バイオインフォマティクスパイプラインに関連するスクリプトも補足資料から入手できます。

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私たちの研究はジョナサン・ウォルトン博士 (1953 ～ 2018 年) の先駆的な業績によって可能になったので、私たちは論文を彼に捧げます。また、NIH 補助金 T32 ES007015 (MTD に授与)、NPK に対する国立衛生研究所 R01 2R01GM112739-05A1 によって資金提供されたウィスコンシン大学マディソン (UW) 分子環境毒性学ポスドク研修プログラム、およびAP へのフルブライト米国奨学金助成金。ゲノム配列決定は、AP に授与されたヒューマンフロンティアサイエンスプログラム助成金 RGP0053 からの資金によって可能になりました。この研究は、ウィスコンシン大学コンピュータ科学部マディソンハイスループットコンピューティングセンター (CHTC) の計算リソースと支援を利用して実施されました。私たちは、クリスティーナ・コッホ氏の思慮深く忍耐強いサポートに特に感謝しています。 Sarah Friedrich の鋭い目とフィギュアのレンダリングに協力してくれたことに感謝します。著者は、ウィスコンシン大学マディソンバイオテクノロジーセンターの DNA 配列決定施設 (研究リソース識別子 – RRID:SCR_017759) を利用して、ゲノム DNA ライブラリーを調製および配列決定しました。この出版物における商品名または商品の言及は、特定の情報を提供することのみを目的としており、米国農務省による推奨または承認を意味するものではありません。 USDA は機会均等の提供者であり雇用主です。

ミルトン・T・キング

現在の住所: USDA-ARS 穀物疾患研究所、米国ミネソタ州セントポール

米国ウィスコンシン州マディソンのウィスコンシン大学細菌学部医療微生物学および免疫学部

ミルトン・T・ドロット、ソンチョル・パーク、ナンシー・P・ケラー

ウィスコンシン大学、ウィスコンシン州マディソン、植物学および細菌学部

イェンウェン・ワン、リン・ハロウ、アン・プリングル

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概念化: MTD、AP。実験: MTD、SCP、YW。データ分析：MTD、SCP。資金は AP、MTD、NPK によって得られました。 MTD は、AP からの修正と SCP、YW、LH、NPK からの意見を取り入れて原稿を書きました。著者全員が原稿の最終版を読んで承認しました。

ミルトン・T・ドロット、ナンシー・P・ケラー、またはアン・プリングルとの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

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転載と許可

モンタナ州ドロット、サウスカロライナ州パーク、ワン、ユイ。他。デスキャップキノコであるテングタケ属のキノコとハラタケ目のパンゲノミクスにより、侵入範囲における毒素遺伝子の動的な進化が明らかになりました。 ISME J (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41396-023-01432-x

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受信日: 2022 年 12 月 10 日

改訂日: 2023 年 5 月 1 日

受理日: 2023 年 5 月 4 日

公開日: 2023 年 5 月 23 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41396-023-01432-x

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