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二酸化炭素をグルコースに直接変換するシアノバクテリアの光合成の可能性を解き放つ
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二酸化炭素をグルコースに直接変換するシアノバクテリアの光合成の可能性を解き放つ

Sep 21, 2023

Nature Communications volume 14、記事番号: 3425 (2023) この記事を引用

2 オルトメトリック

メトリクスの詳細

グルコースは最も豊富な単糖であり、生命のあらゆる領域で細胞に不可欠なエネルギー源として機能し、バイオリファイナリー産業の重要な原料として機能します。 植物-バイオマス-糖経路は現在のグルコース供給の大部分を占めているが、光合成による二酸化炭素のグルコースへの直接変換については十分に研究されていない。 今回我々は、Synechococcus elongatus PCC 7942の光合成グルコース生成の可能性が、天然のグルコキナーゼ活性を阻害することによって解き放たれることを示す。 2 つのグルコキナーゼ遺伝子をノックアウトすると、細胞内にグルコースが蓄積し、ゲノム内の自然突然変異の形成が促進され、最終的にはグルコースの分泌が引き起こされます。 異種触媒または輸送遺伝子がないと、グルコキナーゼ欠損および自然発生的ゲノム変異により、グルコース分泌が 1.5 g/L に達しますが、代謝工学および培養工学によりさらに 5 g/L まで増加します。 これらの発見は、シアノバクテリアの代謝可塑性を強調し、光合成によるグルコースの直接生成をサポートするためのシアノバクテリアの応用を実証している。

グルコースは、自然界で最も豊富に存在する単糖分子です。 グルコースの分解は、生命のあらゆる領域で細胞内にエネルギーと炭素材料を提供し、エンブデン・マイヤーホフ・パルナス（EMP）経路、酸化的ペントースリン酸（OPP）経路、エントナー経路などの多様な解糖経路によって細胞機構に動力を供給します。 –ドドロフ (ED) 経路 1、2。 グルコースとその誘導体は、モノマーとして、さまざまな高分子や細胞成分の合成にも関与しています 3,4。 さらに、グルコースはバイオリファイナリー産業における重要な原料としても機能し、燃料、化学薬品、医薬品のグリーンバイオマニュファクチャリングのための複数の微生物細胞工場の育成をサポートします5、6、7。 自然界では、グルコースは主に植物や藻類の光合成によって合成され、植物や藻類のバイオマス中に多糖類のモノマー（セルロースやデンプンなど）として存在します。 植物-バイオマス-砂糖ルートは、現在の大量のグルコース供給を支配しており、その経済的実現可能性は、植物の栽培サイクル、バイオマス収集半径、前処理コストなどの複数のパラメーターによって影響されます8、9、10、11。

世界的な気候危機と食糧不足の悪化を背景に、より効率的で継続的な産業用グルコース生産ルートを開発することは価値がある12,13。 近年、二酸化炭素からグルコース、グルコース前駆体、およびグルコースポリマーへの直接変換が、化学生化学的、電気化学生物学的、およびインビトロカスケード酵素経路によって達成されている14、15、16。 対照的に、継続的なグルコース生成と光合成との直接的な関連付けには成功していません。 光独立栄養生物、例えば高等植物や藻類では、グルコースは炭素とエネルギーの貯蔵庫として合成され、重要な調節的役割を果たします。 グルコース代謝は光化学系と複雑な相互作用を持ち、色素の合成と代謝を妨害し、光合成活性を阻害する可能性さえあります17、18、19。 したがって、光合成細胞代謝において遊離グルコースが合成されたり、過剰に蓄積されたりすることはほとんどありません。 酸素供給原核微細藻類のグループであるシアノバクテリアでは、遺伝子操作を通じて天然または非天然糖の直接合成と分泌を促進するいくつかの進歩が見られました20、21、22。 しかし、光合成によるグルコースの生成はまだ十分に研究されていません。 組換え株は、他の糖の生産を伴う限られた量のグルコースしか生産できないことから、光独立栄養生物におけるグルコース代謝のより詳細な機構はまだ解明されていないことが示唆されている 23,24。

この研究では、シアノバクテリアの光合成を介して二酸化炭素をグルコースに直接かつ安定して変換することを目指しています。 モデルシアノバクテリア Synechococcus elongatus PCC 7942 (以下、略して PCC 7942) において、我々は、グルコース合成の代謝潜在力を制限するボトルネックとして天然のグルコキナーゼ活性を特定しました。 2 つのグルコキナーゼ遺伝子の標的ノックアウトは炭水化物代謝を妨害し、一般に浸透圧ストレスに対する特殊な反応と考えられているスクロース代謝ネットワークを介したグルコースへの代謝フラックスを活性化します。 グルコース合成の強化により、PCC 7942 の染色体上の特定の自然発生的ゲノム変異の濃縮が促進され、効率的なグルコース分泌が促進されます。 系統的な遺伝子操作と組み合わせた複数のオミクスアプローチを実施することで、グルコースの合成と分泌に至る経路と変異を解明し、組換え株のグルコース合成性能を最適化します。 その後の代謝工学と培養の最適化により、遺伝子操作された株によって分泌されるグルコースは長期培養中に 5 g/L を超え、固定炭素源の最大 70% を占めます。

標的代謝物の効率的な微生物生産を達成するには、通常 3 つのステップがあります。生成物の合成経路を構築すること 25,26、そのような生成物を消費する反応を排除すること 27,28、生成物の分泌機構を促進すること 20,23 です。 これまでの研究では、PCC 7942 が異種グルコーストランスポーターを使用してバイオマス生産のために細胞外グルコースを取り込むことができることが示されており、細胞内グルコース消費に対する自然な能力が実証されています 29。 グルコースをリン酸化してEMPまたはOPP経路を開始する2つのグルコキナーゼ遺伝子（Synpcc7942_0221、glk1、Synpcc7942_2111、glk2）がPCC 7942ゲノムに注釈付けされているため、細胞内グルコース再同化をブロックするノックアウトターゲットとして選択されました。

この操作は、野生型 PCC 7942 (WT) と大腸菌由来のグルコーストランスポーター GalP を保有する組換え株 (SZ14、補足図 1 および 2) を使用して並行して実行されました。 以前に、GalP は PCC 794229 におけるグルコース吸収を促進するのに効果的であることが証明されており、ここでは PCC 7942 のグルコース消費能力に対するグルコキナーゼ欠損の影響を評価するために GalP を使用します。シアノバクテリアの倍数性特性により、抗生物質による継代は所望のホモ接合体を単離するには選択が必要であった。 不活化されたグルコキナーゼ遺伝子（glk1 または glk2）を持つ組換え株は容易に入手できましたが、WT で glk1 と glk2 を同時に不活化したホモ接合体を単離するのは困難でした。 いくつかの独立した試みのうち、6 週間の連続継代後に、調整された遺伝子型 (glk1 と glk2 が完全にブロックされた) を持つホモ接合体株 (SZ3) が得られたのは 1 つのプロセスだけでしたが、他のすべてのプロセスは失敗しました (つまり、glk1 または glk2 の野生型コピーがglk2 を削除できませんでした)。 この結果は、グルコキナーゼには必須の生理学的機能がある可能性があり、細胞が欠損に慣れるために潜在的な二次ゲノム変異が必要である可能性があることを示しました。 GalP トランスポーターを保有する SZ14 株では、glk1 と glk2 を同時にブロックしたホモ接合体変異体 (SZ17) がより容易に単離されました。これは、GalP 活性がグルコキナーゼ欠損によって引き起こされる障害を緩衝する可能性があることを示しています。

酵素アッセイにより、両方の遺伝子 (glk1 と glk2) が PCC 7942 のグルコキナーゼ活性に寄与しており、それらの同時ノックアウトにより SZ3 のグルコキナーゼ活性が約 70% 低下することが明らかになりました。 GalPトランスポーターを有するSZ14株の場合と同様に、（SZ17の）2つの遺伝子をSZ3よりも低いレベルまでノックアウトすることにより、グルコキナーゼ活性はさらに大幅に低下しました（図1a）。 残存するグルコキナーゼ活性は、他の非特異的キナーゼ (フルクトキナーゼやホスホフルクトキナーゼなど) に起因する可能性があります。 SZ17よりもSZ3に高いグルコキナーゼ活性が残存していることは、野生型のバックグラウンドがある程度のグルコキナーゼ活性を維持するのに不可欠であると思われることを示しており、そのため、不確実な機構による活性の喪失に適応するために、組換え株は長期の栽培化を受けた。

a WT、SZ1 (Δglk1)、SZ2 (Δglk2)、SZ3 (Δglk1-Δglk2)、SZ14 (ΔNS3::galP)、SZ15 (ΔNS3::galP-Δglk1)、SZ16 (ΔNS3::galP-Δglk2) の相対グルコキナーゼ活性）、および独立栄養条件下で増殖したSZ17（ΔNS3::galP-Δglk1-Δglk2）。 b グルコースを添加した、または添加しないBG11培地におけるSZ14、SZ15、SZ16、およびSZ17の増殖。 c 30 mM グルコースを補充した混合栄養条件下で増殖させた SZ14、SZ15、SZ16、および SZ17 のグルコキナーゼ活性。 統計分析は、対応のない両側スチューデント t 検定を使用して実行されました (*p < 0.05、***p < 0.001)。 (c) の p 値は (左から右に) 0.013、0.0003 です。 データは平均値 ± SD (n = 3 生物学的複製) として表示されます。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

混合栄養培養の結果、PCC 7942 では設計どおりに細胞内グルコース消費が防止されたことが確認されました。 グルコース（30 mM）の補給により、SZ14株（GalPトランスポーターを保有）のバイオマス生産は3倍改善されましたが、グルコキナーゼ欠損株では増殖の改善は検出されず、これはグルコース利用能力の損失を示しました（図1b） ）。 さらに、グルコースの補給により、欠損株のグルコキナーゼ活性が回復しました（図1c）。これは、非特異的グルコキナーゼ活性の刺激を含む、外因性グルコースに対するPCC 7942代謝の適応応答を示しています。

酵素アッセイの結果は、PCC 7942 細胞が代謝恒常性を維持するにはグルコキナーゼ活性が不可欠である可能性があり、その依存性はグルコーストランスポーター GalP を導入することで部分的に軽減できる可能性があることを示しました。 天然のグルコキナーゼ依存性に対するGalPの影響を考慮して、PCC 7942のグルコキナーゼ欠損は特定の代謝産物の異常な蓄積を引き起こし、潜在的な毒性またはフィードバックストレスを軽減するためにGalPによって輸出される可能性があるという仮説を立てました。 この仮説を検証するために、グルコキナーゼ欠損株の分泌代謝産物プロファイルを調査したところ（補足図3a）、かなりの量のグルコースが培地中に蓄積していることがわかりました。 採用した培養条件 (BG11 培地、100 μmol 光子/m2/s、炭素供給のための空気バブリング) の下で、SZ3 (WT-Δglk1-Δglk2) および SZ17 (それぞれ WT-Δglk1-Δglk2-ΔNS3::galP) 株です (図 2)。 さらに、グルコースの蓄積は細胞バイオマス生成と同じペースで起こり、これは細胞外グルコースが溶解細胞の内容物からではなく生細胞によって合成および分泌されたことを示しています。 炭素供給と照明がさらに強化されると (空気中 3% CO2 v/v、200 μmol 光子/m2/s)、SZ3 と SZ17 のグルコース生成はそれぞれ 1.64 g/L と 1.16 g/L に増加しました。 そして、2 つの菌株のバイオマス蓄積率も改善されました。 この過程で、グルコキナーゼ欠損株の細胞内グルコース濃度も増加しました（補足図3b）。 SZ3 では、6 日目に約 5.6 mg/L/OD730 のグルコース（コントロールの 70 倍以上）が細胞内に蓄積され、SZ17 では細胞内グルコース濃度が 2.8 mg/L/OD730 に達しました。 。

グルコキナーゼ欠損株 SZ3 および SZ17 の細胞密度 (a) および細胞外グルコース濃度 (b) を測定し、比較しました。 SZ3 と SZ17 は、照明強度と炭素供給量が異なる 2 つの条件下で栽培されました。 空の記号と点線は、30 °C、100 μmol 光子/m2/s、空気通気の培養条件からのプロファイルを表します。 実線の記号と実線は、30 °C、200 μmol 光子/m2/s、3% CO2 曝気の培養条件からのプロファイルを表します。 データは平均値 ± SD (n = 3 生物学的複製) として表示されます。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

グルコース合成に対するBG11培地中の有機炭素源の潜在的な寄与を排除するために、クエン酸塩およびクエン酸第二鉄アミン成分を培地から除去しましたが、組換え株の細胞増殖はわずかに減少しましたが、グルコース生産に悪影響は見出されませんでした(補足図4a〜c）。 また、有機炭素源からの寄与を評価するために同位体標識培養も実施しました。 補足図4d–iに示すように、組換えシネココッカス細胞を13C標識NaHCO3で培養した場合、合成されたグルコースは13Cで迅速に標識でき、クエン酸塩およびクエン酸第二鉄アミンの添加または除去は標識率にわずかな影響を与えました。 。 したがって、組換え株によって分泌されるグルコースは主に無機二酸化炭素の変換によるものであると我々は提案できます。 以前の報告と比較して、この研究ではシアノバクテリアによる光合成によるグルコース生産が改善されました。 シネココッカスにおける触媒酵素の導入または過剰発現なしに、10 倍を超える高いグルコース生産性 (0.27 g/L/OD730 対 0.027 g/L/OD730) が達成されました。 さらに、組換え PCC 7942 のグルコース合成は、いかなる環境ストレス誘導 (例えば、塩ストレスや暗所処理) にも関係なく、急速な増殖期中に継続しました 23,24。 さらに、SZ3 株は異種トランスポーターとは独立してグルコースの大部分 (>95%、約 0.27 g/L/OD730 対 5.6 mg/L/OD730) を分泌し、未知のグルコース輸送機構がグルコキナーゼ欠損によって活性化されたことが示唆されました。

グルコースは一般に PCC 7942 の主要な細胞内代謝産物として認識されていないため、グルコース消費能力をブロックすることで炭素フラックスの大部分がグルコース合成にシフトするとは予想していませんでした。 理論的には、グルコースは、グルコース-1-ホスファターゼ (EC 3.1.3.10) またはグルコース-6-ホスファターゼ (EC 3.1.3.9) によって触媒されるグルコース-1-リン酸またはグルコース-6-リン酸の脱リン酸化によって生成できます。 これらの遺伝子は PCC 7942 では同定されていませんが、他のホスファターゼ (アルカリホスファターゼ、Synpcc7942_1392; 無機ジホスファターゼ、Synpcc7942_1383; フルクトース-1,6-ビスホスファターゼ II/セドヘプツロース-1,7-ビスホスファターゼ、Synpcc7942_0505; フルクトース-1 ,6-ビスホスファターゼ、Synpcc7942_2335; myo-イノシトール-モノホスファターゼ、Synpcc7942_2582）は、非特異的基質としてグルコース-1-リン酸またはグルコース-6-リン酸を使用する反応を触媒する可能性があります。 蓄積されたグルコースの量を考慮すると、より考えられる経路は、UDP-グルコースとフルクトース-6-リン酸がスクロース-6-リン酸シンターゼ（sps、Synpcc7942_0808）によって触媒されてスクロースに変換され、生成されるスクロース加水分解経路であった。スクロースはグルコースとフルクトースに加水分解できます (invA、Synpcc7942_0397) (図 3a)。 この仮説を確認するために、2つの遺伝子（SZ130、SZ3-ΔinvA、SZ131、SZ3-Δsps、補足図5および6）をノックアウトしたところ、グルコース分泌が約90％減少する一方で、増殖速度は影響を受けないことがわかりました。 0.2 g/Lまで（図3b、c）。 同じ現象がSZ17株でも観察されました（図3d）。

PCC 7942におけるグルコース生成の概略代謝ネットワーク。SZ3、SZ130 (SZ3-ΔinvA)、およびSZ131 (SZ3-Δsps)の細胞増殖(b)およびグルコース生成(c)。 d SZ17およびSZ159（SZ17-Δsps）のグルコース生成。 培養は 30 °C、200 μmol 光子/m2/s、3% CO2 でバブリングして行いました。 データは平均値 ± SD (n = 3 生物学的複製) として表示されます。 CBB サイクル カルビン-ベンソン-バッシャム回路、Fru-1,6-bisP フルクトース-1,6-二リン酸、Fru-6-P フルクトース-6-リン酸、UDP-Glc UDP-グルコース、Suc-6-P スクロース-6 -リン酸、Glc-6-P グルコース-6-リン酸、Glc-1-P グルコース-1-リン酸、Sps スクロース-リン酸シンターゼ、Spp スクロース-リン酸ホスファターゼ、Fk フルクトキナーゼ、Pgi グルコース-6-リン酸イソメラーゼ、Pgm ホスホグルコムターゼ、Fbp フルクトース-1,6-ビスホスフェート I、Glpx フルクトース-1,6-ビスホスファターゼ II/セドヘプツロース-1,7-ビスホスファターゼ、Galu UTP-グルコース-1-リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

結果は、スクロース合成経路がグルコキナーゼ欠損株におけるグルコース蓄積を支配していることを示したが、スクロース合成は通常、高塩分ストレスに抵抗するための誘導可能な生理学的保護機構として認識されているため、これは直感に反するものであった 31 。 グルコキナーゼ欠損株において、高塩分ストレス誘導とは独立してスクロース合成経路を介して有意な代謝フラックスが維持されるかどうかを調べるために、異種スクローストランスポータースクロースプロトンパーミアーゼ（CscB）を保有するSZ130由来株、すなわちSZ153を構築した（補足）。図7a、b）、invA欠損は潜在的なスクロース加水分解をブロックし、イソプロピル-ベータ-D-チオガラクトピラノシド（IPTG）誘導性のcscB発現は蓄積されたスクロースの分泌を促進する可能性があります（図4a）。 図4bに示すように、標準条件下では、2つの株によって産生される細胞外グルコースの間に有意な差はありませんでしたが、IPTG誘導性のcscB発現によりスクロースはSZ153でのみ連続的に分泌されました（8日間で350 mg / Lまで）。 CscBを発現させることにより、SZ153のスクロースの細胞内濃度も10 mg/L/OD730から約2 mg/L/OD730に減少しましたが、細胞内グルコース濃度は影響を受けませんでした（補足図7c、d）。 したがって、PCC 7942細胞では、高塩分ストレスに関係なくスクロース合成フラックスが維持されることが確認できた。

a PCC 7942におけるスクロース分泌を促進するための工学的戦略。 b IPTG誘導の有無にかかわらず、SZ130 (Δglk1-Δglk2-ΔinvA)およびSZ153 (Δglk1-Δglk2-ΔinvA-ΔNS3::cscB)におけるスクロース/グルコース分泌。 c IPTG誘導の有無にかかわらず、FL92 (ΔNS3::cscB)、SZ21 (ΔinvA-ΔNS3::cscB)、およびSZ153 (Δglk1-Δglk2-ΔinvA-ΔNS3::cscB)の細胞外グルコースおよびスクロース蓄積。 細胞をBG11中で8日間増殖させた。 データは平均値±SDとして表示されます。 すべてのサンプル サイズ n (生物学的複製) は 6 です。 Glk√ および Glk×: それぞれ無傷および欠損グルコキナーゼ。 IPTG√: 0.1 mM IPTGの存在下で増殖した株。 IPTG×:BG11培地にIPTGを添加しなかった。 CscB×: 株中に CscB はありません。 CscB√: CscBを発現する株。 インベルターゼ√およびインベルターゼ×: それぞれ無傷および欠損インベルターゼ。 CBB サイクル カルビン-ベンソン-バッシャム回路、Fru-1,6-bisP フルクトース-1,6-二リン酸、Fru-6-P フルクトース-6-リン酸、UDP-Glc UDP-グルコース、Suc-6-P スクロース-6 -リン酸、Glc-6-P グルコース-6-リン酸、Glc-1-P グルコース-1-リン酸、Sps スクロース リン酸シンターゼ、Spp スクロース リン酸ホスファターゼ、Fk フルクトキナーゼ、CscB スクロース パーミアーゼ、Pgi グルコース-6-リン酸イソメラーゼ、Pgm ホスホグルコムターゼ、Fbp フルクトース-1,6-ビスホスフェート I、Glpx フルクトース-1,6-ビスホスファターゼ II/セドヘプツロース-1,7-ビスホスファターゼ、Galu UTP-グルコース-1-リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

さらなる実験により、PCC 7942 における活発なスクロース合成はグルコキナーゼ欠損とは関係がないことが明らかになりました。 非過塩水条件下でのCscBを介したスクロース分泌は、野生型バックグラウンドでも観察された。 以前に構築された FL92 株 (WT-ΔNS3::Plac-cscB)32 では、IPTG 誘導 cscB 発現により細胞外スクロース分泌が改善されました。 invAのノックアウト（SZ21と名付けられ、補足図8）は、IPTGが添加されなかった場合（cscBが「漏出」状態で発現された）、スクロース分泌を16 mg / Lから80 mg / Lに改善しました。 0.1 mM IPTGを添加すると、3つの株すべてによるスクロース分泌はさらに190 mg/Lを超えるまで増加し、機能的グルコキナーゼを有するSZ21株およびFL92株ではグルコース分泌の減少が観察されました（図4c）。 上記の結果に基づいて、PCC 7942 には活発なスクロース代謝サイクルが存在し、グルコキナーゼの欠損によりグルコースの再利用が阻害され、その後の蓄積と分泌がさらに促進されたと考えられました。 スクロース代謝欠損株においても、一定量のグルコースが依然として合成されており、PCC 7942にはグルコース合成に寄与する追加の経路（例えば、潜在的な非特異的脱リン酸化活性）が存在することが示された。

グルコキナーゼ欠損によりグルコースが細胞内に蓄積するが、異種トランスポーターに依存せずその後の分泌を促進する機構は未解明のままであった。 グルコキナーゼ欠損株 SZ17 では、生成されたグルコースが異種グルコース輸送体 GalP を介して細胞外に排出され、細胞内グルコースの過剰蓄積が回避されます。 比較すると、SZ3株に関しては、グルコース分泌を促進するためにゲノム変異が必要であり、これはホモ接合体の単離に必要な長期継代の説明にもなる可能性がある。 この目的のために、全ゲノム配列決定を行って、SZ3 のグルコース分泌を促進する機能的変異を特定しました。 PCC 7942 (FACHB-805) の公開されたゲノム情報に基づいて、SZ3 および SZ17 のゲノムで変異の種類が特徴付けられました (補足表 1)。そのほとんどは、私たちの研究室での PCC 7942 株の保存および継代中に生成されました。これらは、ゲノム配列決定アッセイによって以前に特定されていました。 SZ3とSZ17の比較により、SZ3ゲノムのsynpcc7942_1161遺伝子上で92番目のバリンがイソロイシンに変換された特定のSNP（G274A）が同定されました（図5a）。 SZ3株（SZ141、補足図9）のsynpcc7942_1161（G274A）のノックアウトにより、グルコース分泌が78％減少して0.33 g / Lとなり、この遺伝子の本質的な役割が実証されました（図5b）。

SZ3およびSZ17の増幅されたsynpcc7942_1161遺伝子領域のサンガーDNA配列。 b SZ3株のグルコース分泌に対するsynpcc7942_1161遺伝子欠損の影響。 c PCC 7942のゲノムにsynpcc7942_1161-G274A変異を導入することによるSZ182株の構築戦略。 同じ挿入抗生物質耐性マーカーを有する SZ181 を対照株として使用しました。 数字は、SZ181 と比較して SZ182 におけるそれぞれの転写物の存在量の増加を示しています。 d SZ17株のグルコース生成に対するsynpcc7942_1161(SZ192)の過剰発現効果。 e SZ17のgalP遺伝子をsynpcc7942_1161（G274A変異の有無にかかわらず）で置き換える構築戦略。 f SZ17の染色体上のGalPを置換するために使用した場合の、グルコース分泌促進に対するsynpcc7942_1161とsynpcc7942_1161-G274Aの効果の比較。 データは平均値±SDとして表示されます。 (b、d、f) のすべてのサンプル サイズ n (生物学的複製) は 3 です。(c) のすべてのサンプル サイズ n (生物学的複製) は 6 です。ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

Synpcc7942_1161には、5つの膜貫通ドメインを持つ二価金属輸送体をコードするという注釈が付けられました（補足図10）。 したがって、我々は、G274A 変異が Synpcc7942_1161 内膜エクスポーターに対するグルコースの親和性を向上させ、それによって SZ3 株におけるより効率的なグルコース分泌を促進するのではないかという仮説を立てました。 しかし、その後のトランスクリプトームアッセイでは、synpcc7942_1161-G274A 変異のより複雑な影響が示唆されました。 そして、SZ3 株で存在量が大幅に増加した転写物の中で、synpcc7942_1161 転写物が最も顕著に上方制御され、最大 77 倍の増加に達しました。 さらに、synpcc7942_1161 と同じオペロンに位置する他の 4 つの遺伝子も有意に上方制御されました (synpcc7942_1160 は 37 倍、synpcc7942_1162 は 59 倍、synpcc7942_1163 は 37 倍、synpcc7942_RS13740 は 34 倍)。上方制御された上位 5 つの転写物を検出するSZ3では。 転写の上昇がsynpcc7942_1161-G274A変異によって引き起こされたかどうかを調べるために、この変異をPCC 7942 WTゲノムに導入し（図5cおよび補足図11）、トランスクリプトームの変化を調べました。 その結果、synpcc7942_1161-G274A変異により、3つの遺伝子をコードする潜在的なトランスポータータンパク質の転写物の量が大幅に増加したことが明らかになり（図5cおよび補足データ1）、オペロンの発現増強がこの変異によって引き起こされた可能性が高いことが示唆されました。

SZ17株における野生型遺伝子の過剰発現（SZ192、図5dおよび補足図12）によりグルコース産生がSZ3のレベルまで増加したため、Synpcc7942_1161の存在量がグルコース分泌表現型を決定すると思われる。 さらに、SZ17の染色体上のGalPを野生型synpcc7942_1161および変異型synpcc7942_1161-G274Aに置き換え、それぞれJS155およびJS156を得ました（図5e）。 図5fに示すように、JS155およびJS156は同等の量のグルコースを培養ブロスに分泌し、両方ともSZ17より多かった。 また、2 つの株の細胞内グルコース濃度もわずかに改善されました。 したがって、synpcc7942_1161-G274A変異は、それぞれのトランスポーターの比活性を最適化するのではなく、主にsynpcc7942_1161の転写物量を増加させることによって（SZ3における）グルコース分泌を促進したと提案することもできる。 さらに、Placプロモーターの制御下でのJS155およびJS156におけるsynpcc7942_1161 mRNAの安定性をさらに評価および比較しましたが、G274A変異の有無にかかわらず、synpcc7942_1161 mRNAの2つのバージョンの間に差は見つかりませんでした（補足図13）。 したがって、synpcc7942_1161 転写物の存在量の増加は、転写物の安定性の最適化ではなく、転写活性の増加によるものであると推測できます。 また、synpcc7942_1161-G274A変異を有するPCC 7942 WT株はグルコースを吸収できないため、変異したsynpcc7942_1161が細胞内グルコースの一方向輸送機能に寄与している可能性があると仮定しました（補足図14）。 上記の結果に基づいて、グルコキナーゼ欠損株 SZ3 の生成モデルを仮定しました。 図6に示すように、グルコキナーゼ欠損によりグルコース-6-リン酸 ↔ グルコースサイクルがブロックされ、synpcc7942_1161-G274Aの自然変異が増加しました。 synpcc7942_1161-G274A は、Synpcc7942_1161 内膜エクスポーターの存在量または活性を増加させることでグルコース分泌を促進し、より効率的にグルコース分泌を開始する可能性があります。 最後に、グルコース分泌の上昇により潜在的なフィードバック ストレスが緩和され、SZ3 の最終的なホモ接合体の単離が可能になりました。

CBB サイクル カルビン-ベンソン-バッシャム回路、Fru-1,6-bisP フルクトース-1,6-二リン酸、Fru-6-P フルクトース-6-リン酸、UDP-Glc UDP-グルコース、Suc-6-P スクロース-6 -リン酸、Glc-6-P グルコース-6-リン酸、Glc-1-P グルコース-1-リン酸、Sps スクロース-リン酸シンターゼ、Spp スクロース-リン酸ホスファターゼ、Fk フルクトキナーゼ、1161: synpcc7942_1161 遺伝子、Pgi グルコース-6-リン酸イソメラーゼ、Pgm ホスホグルコムターゼ、Fbp フルクトース-1,6-ビスホスフェート I、Glpx フルクトース-1,6-ビスホスファターゼ II/セドヘプツロース-1,7-ビスホスファターゼ、Galu UTP-グルコース-1-リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ。

包括的なRNA配列分析により、SZ3ではトランスクリプトームが改造され、WTと比較して581個の遺伝子の発現が大幅に制御されていることが明らかになりました（227個が上方制御され、354個が下方制御、補足データ2）。 濃縮分析により、光合成と酸化的リン酸化に関与する経路がSZ3で大幅に制御されていることが明らかになり（p値<0.01）（補足図15）、それは弱まった光合成活性（酸素発生速度;補足図16）と一致していました。 SZ3とWTの比較。 一方、SZ3の窒素代謝およびアミノ酸代謝に関与する多くの遺伝子も転写レベルの変化を示し、これはグルコキナーゼ欠損株、特に窒素代謝と密接に関連する遺伝子の活性な「炭素流出」状態と関連していた。 グルコキナーゼ欠損代謝の影響をさらに解明するために、SZ3 と野生型の間で非標的メタボロミクス アッセイを実施しました。 LC-MS/MS アッセイを通じて、116 の区別された代謝産物が同定されました (補足データ 3、4)。 トランスクリプトームの変化と一致して、SZ3 内のいくつかのアミノ酸濃度が変化しました。 たとえば、オルニチン-アンモニア回路 33 に関与するアルギニン、グルタミン酸、グルタミンの濃度はすべて 50% 以上減少しました (図 7)。 グルコキナーゼ欠損株 SZ3 のもう 1 つの代表的なメタボロミクス特徴は、糖化合物の存在量の増加とリン酸化代謝産物の含有量の減少でした (補足表 2 および 3)。 この現象は、グルコキナーゼが PCC 7942 代謝においてより広範な基質を有する非特異的ホスホリラーゼとして機能する可能性があることを示しており、これはグルコキナーゼ欠損ホモ接合体の単離の困難性も説明できる可能性がある。 この仮説を確認するために、PCC 7942 の Glk1 と Glk2 を精製し、グルコース以外の糖のリン酸化に対する 2 つの酵素の活性を評価しました。 補足図17に示すように、2つのグルコキナーゼは両方とも、グルコース以外のいくつかの糖に対してリン酸化活性を示しました。 8 つの糖に対する Glk2 の非特異的活性はすべて (グルコースの比活性の) 20% を超え、フルクトース、マンノース、ガラクトースでは最大 50% に達します。 インビトロアッセイの結果は、グルコキナーゼが PCC 7942 の糖のリン酸化とリサイクルに重要な役割を果たしている可能性があるという仮説のさらなる証拠を提供しました。さらに、濃度が低下したいくつかのリン酸化代謝物 (リブロース-5-リン酸、ジヒドロキシアセトンリン酸、フルクトース-6-リン酸、エリスロース-4-リン酸）はCBBサイクルに関与しており（図7）、その存在量の減少は、グルコースの合成と分泌によって引き起こされる炭素流の欠乏の結果である可能性もあります。

標準培養条件（BG11培地、100μmol光子/m2/s、炭素供給のための空気バブリング）で8日間増殖させたWT（白色のカラム）とSZ3（灰色のカラム）の細胞内代謝産物の相対量。 WT と比較して有意に増加または減少した SZ3 の代謝物は、それぞれ赤と青でラベル付けされます。 データは平均値±SDとして表示されます。 すべてのサンプル サイズ n (生物学的複製) は 6 です。 CBB サイクル カルビン – ベンソン – バッシャム回路、TCA サイクル トリカルボン酸回路、ED 経路 エントナー – ドゥドロフ経路、FBP フルクトース-1,6-二リン酸、Fbp フルクトース-1,6-二リン酸I、Glpx フルクトース-1,6-ビスホスファターゼ II/セドヘプツロース-1,7-ビスホスファターゼ、Galu UTP-グルコース-1-リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ、F6P フルクトース-6-リン酸、UDP-Glc UDP-グルコース、Suc-6-P スクロース-6-リン酸、G6P グルコース-6-リン酸、G1P グルコース-1-リン酸、Sps スクロース-リン酸シンターゼ、Spp スクロース-リン酸ホスファターゼ、Fk フルクトキナーゼ、Glk グルコキナーゼ、E4P エリスロース-4-リン酸、SBP セドヘプツロース-1,7 -二リン酸、S7P セドヘプツロース-7-リン酸、GAP グリセルアルデヒド-3-リン酸、R5P リボース 5-リン酸、Xu5P キシルロース-5-リン酸、Ru5P リブロース-5-P、Ru15P リブロース-1,5-二リン酸、DHAP ジヒドロキシアセトンリン酸、 ADP-GLCアデノシン二リン酸グルコース、PGMホスルグルコムターゼ、PGIグルコース-6-リン酸異性体、3PGA 3-リン酸グリセリ酸、6pg 6-ホスホグルコン酸、kdpg 2-ケト-3-デオキシ-6-ホスホグルコン酸、菌皮、pyr 1,5-ラクトン、UDP-Gal UDP-ガラクトース、Gal ガラクトース、Gal-1P ガラクトース 1-リン酸、PEP ホスホエノールピルビン酸、AcCoA アセチル CoA、CIT クエン酸、ICIT イソクエン酸、2OG 2-オキソグルタル酸、SUC-CoA スクシニル CoA、SUCコハク酸塩、フマル酸FUM、オキサロ酢酸OAA、リンゴ酸MAL。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

グルコース合成を直接サポートするスクロース代謝経路に関しては、重要な中間代謝産物の量が異なって制御されており、不均衡な触媒経路が示されています（図7）。 野生型対照と比較して、細胞内スクロース濃度は 74.3% 減少しましたが、フルクトース濃度は 8 倍増加しました。 これらの結果は、グルコース分泌の強力な推進力と、天然のフルクトキナーゼの変換能力を超えたフルクトース出力の増強を示しています。 最も上流の代謝産物の濃度は一般に減少しました（グルコース-1-リン酸で88.3%、グルコース-6-リン酸で88.4%、フルクトース-1,6-二リン酸で69.9%、フルクトース-6-リン酸で97.7%）。 UDP-グルコース（2.93倍増加）を除く。 グルコース-1-リン酸からUDP-グルコースへの変換に関与する機能的酵素は、PCC 794234では同定されていません。したがって、UDP-グルコースの過剰蓄積を引き起こすメカニズムは、今後の研究でさらに調査される必要があります。

グルコース光合成生産をさらに改善するために、スクロース代謝経路のいくつかの必須酵素を個別に過剰発現させました。 図8に示すように、二機能性スクロース-6-リン酸シンターゼ/スクロース-6-ホスファターゼ（フルクトース-6-リン酸とUDP-グルコースからスクロース-6-リン酸とスクロースの合成を触媒）、インベルターゼ（スクロースのフルクトースとグルコースへの分解）、ホスホグルコースイソメラーゼ（フルクトース-6-リン酸とグルコース-6-リン酸の間の変換を触媒）、ホスホグルコースムターゼ（グルコース-1-リン酸とグルコース-6-リン酸の間の変換を触媒）フルクトース-1,6-ビスホスファターゼ（フルクトース-1,6-二リン酸からフルクトース-6-リン酸への変換を触媒する）はすべて、SZ3株で個別に過剰発現されました。 ほとんどの組換え株はグルコース生産を強化し、16 ～ 18 日間の培養プロセス中に細胞外グルコース濃度を約 1.6 g/L から 2 g/L に改善しました。 唯一の例外はフルクトキナーゼの過剰発現で、グルコース分泌が減少しました。 考えられる説明は、フルクトキナーゼ酵素の増加が非特異的基質としてグルコースを触媒し、以前にブロックされたグルコース/ホスホグルコースサイクルを回復し（補足図18）、グルコース合成ブランチの減少につながったということです。

15 ～ 18 日間の培養後に計算された変異株の細胞外グルコース産生と細胞密度。 SZ145 および SZ150 の結果は、それぞれ培養 16 日目および 15 日目の細胞外グルコース産生です。 統計分析は、対応のない両側スチューデント t 検定を使用して実行されました (**p < 0.01、****p < 0.0001)。 p 値は (左から右に) 0.0029、0.0026、0.0011、0.0049、<0.0001、0.0017、<0.0001 です。 データは平均値±SDとして表示されます。 すべてのサンプル サイズ n (生物学的複製) は 3 です。ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

上で述べたように、炭素供給と照明強度の最適化により、SZ3 株と SZ17 株のグルコース生産およびバイオマス蓄積率が向上しました。 SZ123株を使用して、培養の最適化によってグルコース生産を改善しました。その結果、濃縮（2×）BG11培地を使用したバイオマスとグルコース生産の改善（2から2.9 g / L、図9a、補足図19）が示されました35。 長期間のグルコース合成のために、本発明者らは、12日ごとにグルコース合成細胞を再懸濁する(細胞を回収し、新鮮な培地で細胞を懸濁することを意味する)ことによる流加戦略を採用した。 この戦略は、SZ123細胞のグルコース合成活性を効果的に延長し（図9b）、3バッチ後に5 g/Lのグルコースの蓄積をもたらし、これは組換えシネココッカス細胞によって固定された炭素フラックスの70％以上を占めました（補足図20)。 グルコース蓄積速度は、細胞密度の低下に伴って徐々に減少した。 したがって、長期間の培養において安定した増殖と代謝を維持するための組換え細胞工場の細胞の堅牢性が、グルコース生産の制御の主な要因となります。 したがって、菌株および培養工学に対する将来の体系的なソリューションは、これらの側面をさらに改善する必要があります。

a SZ123株のグルコース生産に対する培地補給の効果。 統計分析は、対応のない両側スチューデント t 検定を使用して実行されました (***p < 0.001、****p < 0.0001)。 p 値は (左から右に) 0.0001、<0.0001 です。 b (2×) BG11培地に基づくSZ123株の再懸濁連続培養。 データは平均値±SDとして表示されます。 (a) のすべてのサンプル サイズ n (生物学的複製) は 4 です。(b) のすべてのサンプル サイズ n (生物学的複製) は 3 です。ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

この研究では、二酸化炭素を直接グルコースに変換するシアノバクテリアの光合成の可能性を解き放ちました。 光合成は地球上で最も広範な生化学プロセスであり、光独立栄養生物は太陽エネルギーと二酸化炭素を一次有機炭素に変換して生物圏の維持をサポートします36。 現在、糖分を豊富に含む植物/藻類バイオマスの精製は、砂糖を大量に生産するための主要なルートとして機能し、バイオリファイナリー産業だけでなく食品および医薬品分野のニーズも満たしています8,9。 シアノバクテリア光合成生産の「ワンポット、ワンステップ」モードは、「植物-バイオマス-砂糖」ルートよりも継続的で安定かつ効率的な砂糖代替品として機能する可能性があります37。 ほとんどのシアノバクテリア種は、非生物的環境ストレスに抵抗するために糖タイプの適合性溶質を自然に合成および蓄積することができます38。 シアノバクテリアによるこれらの適合性のある糖化合物（スクロースやトレハロースなど）の蓄積と分泌は、遺伝子操作によって最適化することができ 20,21、人工コンソーシアムの開発などのバイオテクノロジー応用シナリオが探索および拡張されています 39,40。 しかし、シアノバクテリアでは、最も代表的かつ重要な単糖分子であるグルコースが効率よく合成され蓄積されません。 最近、(ホスホケトラーゼをコードする) xpk 遺伝子が欠失した PCC 7942 変異体でグルコース分泌 (スクロース分泌を伴う) が観察されました。 ただし、このグルコース合成は塩ストレス条件の暗闇でのみ誘発され、力価はかなり制限され、高密度細胞では約 3 mM に達します (初期の OD730 は 20、最終的な平均生産性は 0.027 g/L)。 /OD730)24. 以前に報告された別の研究では、PCC 7942 ではスクロースヒドロラーゼとヘキソーストランスポーターの過剰発現により、塩誘導性グルコース合成（フルクトース分泌を伴う）の力価がわずか 30 μM（生産性 0.027 g/L/OD750）に達しました 23。 対照的に、この研究では、Synechococcus 細胞のグルコキナーゼ活性を単に除去することにより、急速な光合成独立栄養増殖期中のグルコースの連続合成が 0.27 g/L/OD730 を超える生産性で達成されました。異種触媒酵素またはトランスポーターを使用し、環境ストレス誘発から独立しています。

単離されたシアノバクテリア種の大部分は独立栄養代謝を行い、炭素源として外因性グルコースを吸収して利用することができませんが、一部のシアノバクテリア株はグルコースを利用することができます 41,42。 グルコースを使用して従属栄養または混合栄養代謝を実行できるシアノバクテリア株に関しては、グルコキナーゼはグルコースをリン酸化し、さまざまな解糖プロセスを開始する際に重要な役割を果たします 43,44。 ただし、グルコキナーゼ遺伝子は、配列決定されたシアノバクテリアのゲノムの大部分に遍在しています (補足データ 5)。 たとえば、Synechococcus elongatus PCC 7942 は、外因性グルコースを吸収して利用する能力が欠如していることが示されていますが、そのゲノム上に 2 つのグルコキナーゼ遺伝子があり、グルコキナーゼにはグルコース利用よりも多くの生理学的機能があることが示唆されています。 系統的な遺伝子改変により、PCC 7942 の活性かつ安定したグルコース - ホスホグルコース回路がスクロース代謝経路で維持されることを確認しました。 以前は、スクロースの合成と蓄積は、高浸透圧ストレスに抵抗するための塩ストレス応答機構として一般に認識されていました 31,45。 対照的に、我々はこの研究で、PCC 7942 におけるスクロースの合成 - 分解サイクルは塩ストレスの誘導とは無関係に活性を維持しており、グルコキナーゼ活性が体内の中間体であるグルコースの過剰蓄積を回避する「水門」として機能することを実証しました。スクロース代謝ネットワークに影響を及ぼし、光合成代謝に潜在的な影響を及ぼします。 スクロース代謝に加えて、他のいくつかの非特異的反応も、PCC 7942におけるグルコースの合成および蓄積に寄与している可能性がある。したがって、細胞内のグルコース合成はPCC 7942において継続的に維持されている可能性があるが、グルコキナーゼはグルコースを再利用するのに重要であると考えられる。リン酸化プロセスによって中央代謝ネットワークが強化され、このメカニズムにより、グルコースの分泌と蓄積によって引き起こされる潜在的なエネルギー損失と代謝障害を救うことができる可能性があります。 さらに、細胞増殖と光合成は阻害されなかったものの（補足図16）、グルコキナーゼ欠損株は150 mM NaClに対する感受性の向上を示し（補足図21）、安定したグルコース-ホスホグルコースサイクルが迅速な応答に寄与していることを示しています。 PCC 7942 の塩分ストレスに対する影響。 PCC 7942 におけるスクロース蓄積の誘導にはイオン効果が重要であることがこれまでに証明されており、イオン濃度の上昇によりスクロース合成酵素 Sps が直接活性化され、同時にスクロース分解酵素 Inv31 が阻害されます。 スクロース代謝サイクルの維持により、酵素上のイオン濃度の直接的な活性制御が可能になり、グルコキナーゼ活性により、加水分解されたスクロースからの糖（フルクトースとグルコース）の迅速な再利用が保証される可能性があります（Invの活性はむしろ低下します）。イオン濃度の上昇により完全に除去されます）。

微生物代謝工学における重要な問題は、シャーシ細胞を人工経路やゲノム修飾に適応させることです。 埋め込まれ、再配線された代謝活動は、炭素分布、補因子供給、および本来の細胞代謝の酸化還元バランスを乱す可能性があり、生理学、代謝、さらには遺伝学のレベルで宿主細胞の反応を刺激する傾向があります46。代謝設計と工学によって緩和されるべきです。 トランスポーター工学は、微生物のシャーシ細胞の異種経路への適応性を高めるための普遍的な戦略となっており、これにより産物の分泌が促進され、細胞内過剰蓄積による代謝負荷が軽減され、産物の潜在的な阻害効果が軽減される可能性があります47。 この研究では、別の解決策が提案されました。 効果的なグルコース輸送を達成するために、PCC 7942の染色体上に異種トランスポーターGalPを導入しました。これにより、潜在的な細胞内代謝ストレスまたは生理学的ストレスが軽減され、遺伝子形質転換体（SZ17）の便利かつスムーズな取得が促進されました。 比較すると、異種トランスポーターを導入しない場合、自然突然変異 (Synpcc7942_1161-G274A) が長期培養プロセス中に生成および濃縮され、変異株にさらに優れたグルコース合成および分泌能力を与えました。 人工的な遺伝子改変と代謝ストレス誘発性の自然発生的ゲノム変異を組み合わせることで、代謝の流れをより効果的に再配線できる可能性がある。

要約すると、我々は、シアノバクテリアの光合成によるグルコース生産の自然な可能性を制限する重要な要因を特定しました。 異種触媒または輸送遺伝子がなければ、グルコキナーゼ活性が欠損し、自然発生的にゲノム変異があった遺伝子操作株では、光合成によって固定された二酸化炭素の大部分が、グルコースの分泌生産に再配線された。 これらの発見は、太陽エネルギーと二酸化炭素を利用した、より指向性のある連続的なグルコース生産システムの開発と工業化に光を当てました。

すべての内因性遺伝子は、遺伝子特異的プライマーおよび高忠実度 DNA ポリメラーゼ (TransGen、北京、中国) を使用して野生型 PCC 7942 ゲノムから PCR 増幅されました。 この研究で使用したすべてのプライマーと構築されたプラスミドは補足データ6にリストされています。大腸菌株DH5αをプラスミドの構築に使用し、すべての株をルリアベルターニ培地（液体または寒天ペトリ）中で37℃で増殖させました。皿）対応する抗生物質（Solarbio）を補充しました。 対応する耐性遺伝子を持つ株に対して、アンピシリン、カナマイシン、スペクチノマイシン、ゲンタマイシン、およびクロラムフェニコールをそれぞれ 100、50、50、40、および 50 μg/mL で使用しました。 すべてのバックボーン ベクターは、pUC19 または pBR322 に基づいて、相同領域、プロモーター、および制限酵素消化およびライゲーションまたはシームレス クローニングを使用して抗生物質耐性カセットを挿入することによって定義されました。 すべてのプラスミドの相同組換え領域は、組み込まれた遺伝子座の約 1000 bp 上流配列と 1000 bp 下流配列に位置していました。 EcoRI、XbaI、EcoRV、NaeI、EagI、およびBamHIは、pSS1およびpSS2を構築するために使用された制限クローニングサイトでした。 すべての制限酵素は、Thermo Fisher Science (上海、中国) の高速消化酵素でした。 プラスミドは、シームレスクローニング法およびシームレスアセンブリクローニングキット(Taihe Biology Co., LTD, China)を製造業者の指示に従って使用して構築した。 陽性プラスミドを有する大腸菌コロニーは、遺伝子特異的プライマーおよびTaq DNAポリメラーゼ(TransGen Biotech)を使用するコロニーPCRによって確認した。 Mini-prep キット (OMEGA Bio-Tek) で精製したプラスミドを、PCC 7942 形質転換の前にサンガー配列決定によってチェックしました。

PCC 7942 ゲノムの遺伝子改変は、遺伝子を標的部位に組み込むための二重相同組換えシステムを使用して実行されました。 すべてのプラスミドは自然形質転換によって PCC 7942 に形質転換されました。 抗生物質選択プレート上で増殖させた形質転換体は、PCR および増幅された断片の第 2 世代 DNA 配列決定によって分析されました 32。 この研究で構築された PCC 7942 由来株は補足データ 7 にリストされています。

PCC 7942 由来株を、対応する抗生物質を含む液体 BG11 培地に接種し、回転振盪 (150 rpm) および 50 µmol 光子/m2/s の白色光照射下、30 °C で 4 ～ 6 日間培養しました。 続いて、培養ブロスを、100 μmol 光子/m2/s の連続白色光下で 250 mL フラスコ中の 200 mL の BG11 培地に接種し、空気でバブリングしました。 カナマイシン、スペクチノマイシン、ゲンタマイシン、およびクロラムフェニコールを、それぞれ最終濃度 20、20、2、および 10 μg/mL になるように培地に添加しました。 最後に、フラスコからの培養ブロスを遠心分離し、カラムフォトバイオリアクター（直径３ｃｍ）内で６５ｍＬの新鮮なＢＧ１１培養培地で初期ＯＤ７３０が約２．０になるまで再懸濁した。 特に記載のない限り、光合成グルコース生産のための培養は 30 °C で実行されました。 長期培養実験では、抗生物質を排除し、培養液の pH を維持するために 8 mM TES-NaOH (pH = 8) を添加し、培養終了時に細胞の遺伝子型を PCR でチェックしました。 培養プロセス中、OD730 とグルコース濃度を測定するために 1 日おきに各カラム フォトバイオリアクターから培養液 0.5 mL をサンプリングし、元の体積を維持するために滅菌水を補充しました。 特別な実験の場合、有機炭素含有量 (クエン酸およびクエン酸第二鉄アンモニウム) が BG11 培地から除去されます。

PCC 7942 由来株によって分泌される細胞外グルコース含量を測定するために、培養ブロスをサンプリングし、12,000 × g で 1 分間遠心分離しました。 次に、電気化学検出器と Dionex CarboPac MA1 分析カラム (4×250 mm、Thermo Scientific、米国マサチューセッツ州ウォルサム）。 以前の研究 48 に従って、細胞内グルコースが細胞ペレットから抽出されました。 簡単に説明すると、細胞ペレットを 1 mL の 80% エタノール (体積対体積) に再懸濁し、65 °C で 4 時間インキュベートしました。 12,000 × g で 5 分間遠心分離した後、上清を清潔なチューブに移し、N2 気流下 55 °C で乾燥させました。 続いて、乾燥残渣を超純水に溶解し、溶解溶液を０．２２μｍの濾過膜で濾過して清浄なバイアルに入れた。 濾液中のグルコース含量も、D-グルコースアッセイキット(Megazyme)またはイオンクロマトグラフィーを使用して計算した。

グルコキナーゼ活性は、改良された酵素結合アッセイによって測定されました3。 BG11培地で培養したシネココッカス細胞を遠心分離し、4℃に予冷した1 mLの破壊緩衝液（50 mM Tris-HCl、pH 7.4）に再懸濁しました。 細胞懸濁液に石英砂 (Sigma) を加え、4 °C で 30 分間ボルテックス混合して細胞を破砕しました。 遠心分離後、上清60μLを96ウェルプレートに移し、反応バッファー（100mM Tris-HCl、pH7.8、2.5mM ATP、4mM MgCl2、20mM KCl、0.2mM NADP+）200μLを加えた。 、10 mM グルコース、および 5 U/mL グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ）を添加し、暗所で 5 分ごとに 340 nm での吸光度を測定しました。 時間とともに増加するA510の傾きを計算し、反応混合物中のグルコキナーゼの比酵素活性をランバート・ベールの法則に従って計算した。

13C 標識実験は、13C 標識重炭酸ナトリウム (Cambridge Isotope Laboratories、99% 13C、CLM-441) を使用して実行し、12C-NaHCO3 を対照として添加しました。 まず、指数関数的増殖期にある細胞を、50 mM NaHCO3 および適切な抗生物質を含む 10 mL BG11 で OD730 が 0.6 になるように調整し、クエン酸およびクエン酸第二鉄アンモニウムの存在下または非存在下で 30 mL の密閉フラスコ (ヘッドスペースなし) で培養しました。連続的な光の状態。 細胞内代謝産物のアッセイでは、細胞を 24 時間ごとに遠心分離によって収集し、2 mL の 80:20 メタノール/水 (体積/体積) で迅速に抽出し、液体窒素で凍結しました。 細胞内代謝産物は、5 回の凍結/解凍サイクルを経て抽出されました。 遠心分離および窒素吹き込み後、100 μL ddH2O をサンプルに加えて再懸濁し、誘導体化反応に使用しました。 サンプルの誘導体化は 2 つのステップで実行されました: (1) 40 μL のメトキシアミン溶液 (25 mg/mL、ピリジン溶媒に溶解) を添加し、その後 60 °C で 30 分間インキュベートします。 (2) 各サンプルに TMS 試薬 (BSTFA/TMCS, 99:1) 40 μL を添加し、37 °C で 120 分間反応させました。 細胞外グルコースのアッセイのために、SZ3 培養ブロスの上清 100 μL をそれぞれ凍結乾燥および誘導体化のために採取しました。 遠心分離後、GC-MS を実行してサンプルを分析しました。 GC-MS アッセイは、Agilent 5977 質量検出器および HP-INNOWax カラム (30 m × 0.32 mm × 0.25 μm) を備えた Agilent 7890 によって実行されました。 超高純度ヘリウムをキャリアガスとして 3 mL/min の一定流量で使用しました。 カラムボックスの温度は、最初は 60 °C で 5 分間保持され、その後 10 °C/分の速度で 260 °C まで上昇し、その後 260 °C で 10 分間保持されました。 グルコースからの特徴的な質量シグナルが m/z 204(M + 0)、205(M + 1)、206(M + 2) で検出され、関連する中間体を分析するために、標識代謝産物と非標識代謝産物の比率に基づいて計算されました。単位時間あたりの細胞内のグルコースの標識比率を検出します。

SZ3 および SZ17 の全ゲノム再配列決定では、ゲノム DNA を単離し、Nanodrop ND-1000 システム (Thermo Scientific、米国) および Qubit 蛍光光度計 (Thermo Scientific、米国) を使用して品質と濃度を分析しました。 続いて、定量化された DNA サンプルを断片化し、平滑化し、3'-A オーバーハングで修飾し、イルミナの標準配列アダプターにライゲーションし、PCR によって増幅しました。 ライブラリーは、Illumina HiSeq 2500 シーケンサーを使用してペアエンドリードとして配列決定されました。 ライブラリーの構築と配列決定は、Allwegene Tech (北京、中国) によって実行されました。 参照配列 (Synechococcus elongatus PCC 7942、FACHB-805) は、リード マッピングのために GenBank から取得しました。 BWA49 を使用して配列を参照し、SAMtools50 を使用して結果を並べ替え、重複リードをマークしました。 続いて、SAMtools と BreakDancer51 により、SNP と参照配列とサンプル配列間の構造変化 (SV) がそれぞれ同定されました。 次に、SNP と SV を含む DNA 断片がゲノム DNA から増幅され、サンガー配列決定によってさらに検証されました。

30 °C、50 μmol 光子/m2/s の白色蛍光灯下で振盪したフラスコ内で培養したシネココッカス細胞。 対数増殖期の細胞を採取し、OD730 が 4 になるまで再懸濁しました。アクチノマイシン D (ActD、5 μg/mL) を添加して新規 mRNA 合成をブロックし、指定の時点 (0、5、25、および 0) で全 RNA を単離しました。細菌 RNA 抽出キット (Vazyme、南京、中国) を使用して ActD を添加した後、45 分)。 次に、qPCR 用 HiScript III RT SuperMix (Vazyme、南京、中国) を使用して、RNA サンプルを cDNA に逆転写しました。 定量的 RT-PCR は、SYBR Green I 蛍光 (ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix-Vazyme、南京、中国) に基づいて、LightCycle 480 配列検出器 (Roche、バーゼル、スイス; LightCycle 480 ソフトウェア 1.5) で実行されました。

標準的な培養条件（30℃、100μmol光子/m2/s、炭素供給のための空気バブリング）下で8日目まで培養したシネココッカス細胞を遠心分離し、リン酸緩衝生理食塩水で3回洗浄しました（補足図22）。 細胞ペレットを液体窒素中で 15 分間凍結し、分析まで -80 °C で保存しました。 その後、200 μL の ddH2O と 800 μL のアセトニトリル-メタノール混合物 (1:1) を 80 mg の細胞ペレットに添加しました。 1 分間ボルテックスした後、タンパク質を沈殿させるためにすべてのサンプルを -20 °C で 1 時間保存しました。 次に、サンプルを 4 °C、12,000 × g で 20 分間遠心分離しました。 上清を収集し、真空濃縮器で蒸発乾固した。 続いて、100 μL の再懸濁液 (ddH2O 中の 0.1% ギ酸) を加え、30 秒間ボルテックスしました。 得られた溶液を0.22μmの膜で濾過した。 メタボロミクス分析の品質を保証するために、各グループで 6 つの複製を混合することによって品質管理 (QC) サンプルを調製しました。

非ターゲットメタボロミクス分析では、Acquity UPLC BEH Amide カラム (2.1 mm × 100 mm、粒子サイズ 1.7 µm) を備えた Agilent 1290 Infinity 超高速液体クロマトグラフィーにサンプルを注入し、AB Triple TOF 5600/6600 で検出しました。エレクトロスプレーイオン化（ESI）源を備えた質量分析計（AB SCIEX、カナダ）。 カラムの温度は 25 °C に維持されました。 勾配移動相は、流速 0.30 mL/min で、移動相 A には 25 mM 酢酸アンモニウムと 25 mM アンモニアを含む水の混合物、移動相 B にはアセトニトリルを使用しました。 移動相 B の割合は、0 ～ 0.5 分、95% B として最適化されました。 0.5 ～ 7 分、95% ～ 65% B; 7.0 ～ 8.0 分、65% ～ 40% B。 8.0 ～ 9.0 分、40% B。 9.0 ～ 9.1 分、40% ～ 95% B; 9.1 ～ 12 分、95% B.

質量分析 (MS) 分析には、50 ～ 1200 m/z (質量電荷比) のスキャン範囲が採用されました。 イオンスプレー電圧は、正イオン化モード (ESI + ) では +5 kV、負イオン化モード (ESI-) では -5 kV に設定されました。 衝突エネルギーは、ESI+ と ESI- でそれぞれ +15 eV と -15 eV に設定されました。 デクラスタリング電位は +60 V (ESI+) および -60 V (ESI-) に設定され、ソース温度は 650 °C でした。 生の LC-MS データは ProteoWizard ソフトウェアによって変換され、ピークの同定、照合、および統合のために XCMS に導入されました。 利用可能な本物の標準で確立された社内データベースを使用した MS/MS スペクトルによる代謝産物の化合物同定。 同定された代謝物は、代謝経路解析のために京都遺伝子・ゲノム百科事典データベースと照合してさらに検索されました。 続いて、データは主成分分析、部分最小二乗判別分析 (PLS-DA)、および直交部分最小二乗判別分析 (OPLS-DA) のパレート スケーリングによって前処理されました。 一次元統計分析には、スチューデントの t 検定と多重変動分析が含まれます。

標準的な培養条件（30℃、100μmol光子/m2/s、炭素供給のための空気バブリング）下で4日目まで培養したシネココッカス細胞を遠心分離し、DNase/RNaseフリー水で洗浄しました（補足図23）。 細胞ペレットを収集し、液体窒素中で 15 分間急速冷凍しました。 TRIzol 試薬 (Invitrogen) を凍結細胞ペレットからの全 RNA 抽出に使用しました (各グループで 3 つの生物学的複製)。 RNA の品質と濃度は、Nanodrop ND-1000 システム (Thermo Scientific、米国) および Agilent 2100 RAN NANO 6000 アッセイ キット (Agilent Technologies、カリフォルニア州、米国) を使用して分析しました。 ペアエンドライブラリーは、RNA Library Prep Kit (Illumina) を使用して調製しました。 濃縮された mRNA を断片化バッファーを加えて断片化し、mRNA 断片を鋳型としてランダム ヘキサマー プライマーと逆転写酵素を使用して第 1 鎖 cDNA を合成し、続いて DNA ポリメラーゼ I、RNaseH、バッファと dNTP。 次いで、合成された二本鎖cDNA断片をQIAQuick PCRキットを使用して精製した。 精製した二本鎖cDNAをポリアデニル化し、アダプターを連結してペアエンドライブラリーを調製した。 アダプターが連結された cDNA とアダプター プライマーを PCR 増幅に使用しました。 最後に、Illumina プラットフォームを適用して、得られた cDNA ライブラリーの配列を決定し、150 bp のペアエンドリードが得られました。 クリーンリードは生リードからトリミングされ、すべての下流分析はクリーンリードに基づいていました。 Bowtie 2 ソフトウェアを使用して、ペアエンドクリーンリードを Synechococcus elongatus PCC 7942 の参照ゲノムにアライメントしました。各遺伝子に対応するリード数は、FeatureCounts52 を使用して計算されました。 続いて、遺伝子の長さとこの遺伝子にマッピングされたリード数に基づいて、各遺伝子の 100 万キロベースあたりのフラグメント (FPKM) が計算されました。 p-adj <0.05 および |log2foldchange | を持つ遺伝子 > log2(1.5) は差次的発現遺伝子 (DEG) として定義されました。

Glk1 (Synpcc7942_0221)、Glk2 (Synpcc7942_2111)、および Fk (Synpcc7942_0116) 遺伝子を PCC 7942 ゲノムから増幅し、pET28a にクローン化し、それぞれ組換え発現プラスミド pYW16、pJS89、および pJS90 を生成しました。 標的タンパク質を過剰生産するために、組換えプラスミドを大腸菌株 BL21 (DE3) に形質転換しました。 形質転換体を、50μg/mLカナマイシンを含む500mLのLB培地中で37℃で増殖させた。 OD600 が 0.6 ～ 0.8 の場合、細胞は 0.3 mM IPTG により 16 °C で 20 時間誘導されました。 誘導後、細胞を遠心分離により回収し、予め冷却した溶解緩衝液(20 mM Tris-HCl、pH 7.8)中で超音波処理により破壊した。 溶解物を 20,000 × g で 60 分間遠心分離し、得られた上清を 0.22 μm ポリエーテルスルホン膜で濾過し、アフィニティー精製のために Ni Sepharose 6 FF カラム (GE Healthcare、イリノイ州シカゴ) にロードしました。 次に、典型的な結合、洗浄、溶出手順を使用して、標的タンパク質を取得しました。 フラクション中のタンパク質濃度をブラッドフォード法により決定し、目的タンパク質の純度をSDS-PAGEにより検査した。

異なる糖基質に対するグルコキナーゼとフルクトキナーゼのリン酸化活性は、以前に記載されているように変更を加えたピルビン酸キナーゼ/乳酸デヒドロゲナーゼ (PK/LDH) 酵素結合アッセイを使用して測定されました 53。 簡単に説明すると、20 μL の精製タンパク質を 96 ウェル プレートに移し、そこに 210 μL の反応バッファー (100 mM Tris-HCl、pH 7.8、2.5 mM ATP、4 mM MgCl2、20 mM KCl、0.3 mM) を加えました。 NADP+、10 mM 特異的糖、1 mM PEP、1.4 U/mL PK、2.8 U/mL LDH) を添加し、暗所で 1 時間の間、340 nm での吸光度を 15 秒ごとに測定しました。 時間とともに減少するA510の傾きを計算し、各糖に対するグルコキナーゼ/フルクトキナーゼの比酵素活性をグルコース/フルクトースに対する活性と比較して相対比を求めます。

シアノバクテリアのゲノム グルコキナーゼ配列を包括的に調査するために、NCBI データセット ツールを使用して、NCBI アセンブリ データベースから利用可能なすべてのシアノバクテリアのゲノム配列とその注釈をダウンロードしました。 合計 986 個の重複のない参照レベルのシアノバクテリアのゲノムを使用して、ゲノム データベースを構築しました。 Hmmer パッケージ (バージョン 3.1b2) の hmmsearch ツールを使用してゲノム データベースをスクリーニングし、947 個のシアノバクテリア ゲノムから潜在的なグルコキナーゼ シーケンスを検索し、E 値 < 1 ～ 50 でこのグルコキナーゼ HMM (PF02685) との有意な一致を示しました (補足)データ5)。

シネココッカス細胞を採取し、17 mLの新鮮なBG11を用いて初期OD730が約2.0になるまで再懸濁した。 呼吸数は暗所、30℃で200秒間測定され、全​​鎖光合成酸素発生速度はYZQ-201A光合成装置（Yizongqi Technology Co., Ltd）を使用して各光レベル（RGB光源）で160秒間測定されました。 、中国）10 mM NaHCO3 存在下。 総光合成酸素発生速度は、正味の光合成速度に呼吸速度を加えたものとして計算されました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

この論文で報告された全ゲノム配列決定およびトランスクリプトーム配列決定のデータセットは、NCBI BioProject アクセッション PRJNA740138 を通じて入手できます。 非標的メタボロミクス解析のすべての生データは、中国国立遺伝子銀行データベース (CNGBdb)56 の CNGB 配列アーカイブ (CNSA)55 に受託番号 CNP0004406 で寄託されています。 同定された代謝物は、京都遺伝子・ゲノム百科事典データベース [https://www.kegg.jp/kegg/kegg2.html] と照合して検索されました。 MS/MS スペクトルからの化合物の同定は、入手可能な本物の標準物質から生成された社内データベースを使用して行われました。 Synechococcus elongatus PCC 7942 および FACHB-805 の参照ゲノムおよび遺伝子モデル アノテーション ファイルは、GenBank [https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/all/GCA/000/012/525/GCA_000012525] から取得しました。 1_ASM1252v1/]。 ソースデータはこのペーパーに付属しています。

すべてのスクリプトに使用される入力データ ファイル、生成された出力ファイル、およびシアノバクテリアのゲノム グルコキナーゼ シーケンスの分析用スクリプトは、GitHub [https://github.com/yudifeiluo/chanobacteria] で入手できます。57。

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この研究は、中国国家重点研究開発プログラム（XLおよびGLへの補助金番号2021YFA0909700）、青少年イノベーション推進協会CAS（GLへ）、中国国立自然科学財団（GLへの補助金番号32070084、 32270103 から GL、32271484 から XL)、DNL 協力基金、CAS (DNL202014、GL まで)、および山東泰山奨学金 (XL および GL まで)。

Shanshan Zhang、Jiahui Sun の著者も同様に貢献しました。

中国科学院、青島バイオエネルギー・バイオプロセス技術研究所、バイオ燃料重要研究所、No. 189 Songling Road、青島、山東省、266101、中国

Shanshan Zhang、Jiahui Sun、Dandan Feng、Huili Sun、Jinyu Cui、Xuexia Zeng、Yannan Wu、Guodong Luan、Xuefeng Lu

山東エネルギー研究所、No. 189 Songling Road、青島、山東省、266101、中国

Shanshan Zhang、Jiahui Sun、Dandan Feng、Huili Sun、Jinyu Cui、Xuexia Zeng、Yannan Wu、Guodong Luan、Xuefeng Lu

青島新エネルギー山東研究所、青島、山東省、266101、中国

Shanshan Zhang、Jiahui Sun、Dandan Feng、Huili Sun、Jinyu Cui、Xuexia Zeng、Yannan Wu、Guodong Luan、Xuefeng Lu

中国科学院大学生命科学部、100049、北京、中国

Shanshan Zhang、Jiahui Sun、Huili Sun、Guodong Luan、Xuefeng Lu

大連国家クリーンエネルギー研究所、大連、遼寧省、116023、中国

Guodong Luan と Xuefeng Luan

海洋生物学およびバイオテクノロジー研究所、青島海洋科学技術研究所、青島、山東省、266237、中国

ルー・シュフェン

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GL と XL が研究を設計しました。 SZ、JS、DF、XZ、YW、HS、JC、および GL が調査を実施しました。 SZ、JS、GL、XL がデータを分析しました。 SZ、JS、GL、XL が原稿を書きました。

Guodong Luan または Xuefeng Lu への対応。

著者らは競合する利害関係がないことを宣言します。

Nature Communications は、この研究の査読に貢献してくれた Elton Hudson、Jianping Yu、およびその他の匿名の査読者に感謝します。 査読ファイルが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

Zhang、S.、Sun、J.、Feng、D. 他。 二酸化炭素をグルコースに直接変換するシアノバクテリアの光合成の可能性を解き放つ。 Nat Commun 14、3425 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41467-023-39222-w

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受信日: 2023 年 2 月 7 日

受理日: 2023 年 6 月 2 日

公開日: 2023 年 6 月 9 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-39222-w

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