セリンADP - 株式会社コーストワイズ・ベンチャーズ・グループ

Nature Communications volume 14、記事番号: 3200 (2023) この記事を引用

658 アクセス

9 オルトメトリック

メトリクスの詳細

哺乳類の DNA 損傷応答において、ADP リボシル化シグナル伝達は、DNA 損傷部位をマークし、修復因子を動員して調節するために非常に重要です。具体的には、PARP1:HPF1複合体は損傷したDNAを認識し、セリン結合ADPリボシル化マーク(モノ-Ser-ADPr)の形成を触媒し、このマークはPARP1単独によってADP-リボースポリマー(ポリ-Ser-ADPr)に伸長されます。 Poly-Ser-ADPr は PARG によって逆転されますが、末端の mono-Ser-ADPr は ARH3 によって除去されます。その重要性と進化上の明らかな保存にもかかわらず、非哺乳類動物界における ADP リボシル化シグナル伝達についてはほとんど知られていません。ショウジョウバエ種を含む一部の昆虫ゲノムには HPF1 が存在するが ARH3 が存在しないため、これらの種におけるセリン ADP リボシル化の存在と逆転について疑問が生じています。今回我々は、定量的プロテオミクスにより、Ser-ADPrがキイロショウジョウバエのDNA損傷応答におけるADPリボシル化の主要な形態であり、dParp1:dHpf1複合体に依存していることを示す。さらに、我々の構造的および生化学的研究により、ショウジョウバエ Parg による mono-Ser-ADPr 除去のメカニズムが明らかになりました。まとめると、我々のデータは、動物界におけるDDRの決定的な特徴としてPARP:HPF1媒介Ser-ADPrを明らかにしている。この界内の顕著な保存は、ショウジョウバエなどのADP-リボシル代謝酵素のコアセットのみを保有する生物が、Ser-ADPrシグナル伝達の生理学的役割を研究するための貴重なモデル生物であることを示唆している。

ADP リボシル化 (ADPr) は、NAD+ から標的タンパク質への ADP リボース部分の転移を伴うタンパク質の翻訳後修飾です。これは、とりわけ DNA 修復、転写制御、免疫、微生物代謝など、さまざまな細胞プロセスの制御に関与しています 1、2、3、4。 ADP-リボース単位は、特に酸性 (Glu/Asp)、塩基性 (Arg/Lys)、ヒドロキシル (Ser/Tyr)、およびチオール (Cys) 官能基を持つさまざまなアミノ酸側鎖に結合できます2,5。 PARP1、PARP2、タンキラーゼ 1/2 (PARP5a/b とも呼ばれる) などの一部のライターは、モノ(ADP-リボシル化) (MARylation) として知られる初期修飾を拡張し、ポリ(ADP として知られる直鎖状または分岐状の ADP-リボースポリマーを作成できます) -リボシル化) (PAR化)6、7、8。

PARP1/2 の結合は、DNA 切断時に PARP1/2 依存性タンパク質 ADPr を誘導します。これにより、クロマチンの分解と修復因子の補充に必要なさまざまな DNA 損傷応答 (DDR) 機構を活性化および制御する ADPr シグナルが発生します 4 、９．以前の研究では、PARP1 および PARP2 が in vitro でグルタミン酸/アスパラギン酸修飾を触媒することが示されています 10。一方、質量分析分析により、ヒト細胞における DNA 損傷中に ADPr によって修飾される主な残基はセリン ADPr であることが明らかになりました 11、12、13、14。この不一致は、基質結合および触媒残基に寄与することによって PARP1/2 の活性部位を完成させる補助タンパク質であるヒストン PAR 化因子 1 (HPF1) 11,15 の発見により解決されました 16,17,18。さらに、PARP1/2:HPF1 複合体は、あまり理解されていないチロシン残基の修飾にも関与しています 19,20。

ADPr は非常に動的であり、それに伴う高いエネルギー消費のため、厳密に制御しておく必要があります。したがって、適切な細胞応答が達成されると、ADPr シグナル伝達は停止し、利用された ADP リボース単位は、ADP リボースを ATP や NAD+21 などの他のヌクレオチドに変換する特殊な消去装置によってリサイクルされます。 PAR 鎖の大部分の分解に関与する主な酵素はポリ (ADP-リボース) グリコヒドロラーゼ (PARG) で、ADP-リボースポリマー内のアセタール結合を加水分解しますが、タンパク質-リボース結合を元に戻すことはできません 22、23、24。ヒト細胞では、この特異的な反応である Ser-ADPr の除去は、(ADP-リボシル)ヒドロラーゼ 3 (ARH3) によって行われます 23,25。

特に、PARP1/2:HPF1複合体によるADPr確立とPARGおよびARH3による段階的修飾除去との相互作用は、DNA修復およびクロマチン構造制御の制御に不可欠である8、15、26、27、28。最近、これらの成分が臨床的に関連する PARP 阻害剤に対する反応の重要な決定因子であることも示されました 27、29、30。哺乳類における Ser-ADPr シグナル伝達の重要性にもかかわらず、哺乳類系統外の動物界との関連性は依然としてとらえどころがありません。 PARP と ADPr はキイロショウジョウバエで以前に研究されています 31 が、このモデル生物において主に ADPr で修飾されている残基の性質はまだ確立されていません。ショウジョウバエ Parp (dParp) および Parg (dParg) は、特に DDR32、転写制御 33,34、クロマチンリモデリング 35,36,37,38,39 などのいくつかの生物学的機能に関与していることも示されています。さらに、dParp はショウジョウバエの必須遺伝子であり、欠失は幼虫から蛹期への移行中に致死的であることが判明しました 34,40。 dParg の機能喪失型変異の発現も、25 °C で致死的な幼虫の表現型を誘導します。しかし、ニューロンにおける PAR の蓄積に関連する進行性の神経変性表現型を示したにもかかわらず、変異ハエの 25% は 29 °C で成虫段階に進行することができました 41。さらに、dParp または dParg 遺伝子の発現レベルを操作すると、パーキンソン病 42,43、アルツハイマー病 44、筋萎縮性側索硬化症 45 などの神経変性疾患のハエモデルの表現型が変化しました。しかし、dParpがdHpf1と協力するかどうか、そしてもし協力する場合、結果として生じる修飾が主にセリン残基に局在するかどうかは不明である。

今回我々は、dParp:dHpf1によって触媒されるショウジョウバエにおける豊富で保存されたSer-ADPrシグナル伝達系の存在を報告し、その機能はヒトにおけるDDR誘導性のADPrシグナル伝達にほぼ匹敵する。さらに、ショウジョウバエには ARH3 が欠如しているが、ヒト PARG と ARH3 の両方に機能的同等性を与える dParg の驚くべき進化的適応があることを示します。ショウジョウバエの Ser-ADPr は保存されており、DNA 修復に関連する PARP と反対の加水分解酵素が 1 つだけ存在するため、ショウジョウバエはこの重要な修飾をさらに研究するための魅力的なモデルとなっています。

現在まで、Ser-ADPr は脊椎動物でのみ研究されています。私たちの系統解析により、HPF1は、サンゴや海綿動物のような原始的な枝だけでなく、D. melanogasterやCaenorhabditis elegansなどの頻繁な遺伝子喪失で知られる生物を含む、実質的にすべての後生動物で保存されていることが明らかになりました（図1および補足データ1）。さらに、HPF1 は多くの原生動物に見られます。同様に、ARH3 は後生動物に広く分布していますが、アメーバゾアと肺胞動物内では散発的にしか見つかりません (補足データ 1)。動物界の初期進化における Ser-ADPr の確立と除去に重要なこれら 2 つの遺伝子の出現は、これがこの ADP リボシル化シグナル伝達変異の起源であることを強く示唆しています。驚くべきことに、我々の分析により、線虫類、鱗翅目、およびすべてのショウジョウバエ種を含むほとんどの双翅目を含むいくつかの真核生物系統で ARH3 が欠損していることが明らかになりました。しかし、これらの ARH3 欠損種は依然として主要な PAR 分解因子 PARG と HPF1 を保持しています。これらの発見は、ショウジョウバエのSer-ADPrサイクルが他の後生動物とは異なる可能性があることを示唆しており、したがってより詳細な調査が必要である。

系統樹は、多重配列アラインメントによってタンパク質全体の状況から単離されたアミノ酸配列を使用して構築されました。進化の歴史は、MEGA11 で実装されているアミノ酸置換の LG モデルに基づく最尤法を使用して推定されました。ブートストラップコンセンサスツリーが示されており、分析された分類群の進化の歴史を表すために 1000 回の複製から推測されました。 BLAST 検索で ARH3 を特定できなかった種は赤色で強調表示されます。関連する分岐群は色付きの枝で強調表示されます (昆虫綱、青、哺乳綱、緑、線虫綱、オレンジ色、原生動物綱、茶色)。配列データは補足データ 1 に記載されています。

この仮説を調査するために、DNA損傷後のショウジョウバエのADPr動態の解明に進む前に、最初にすべての成分（dParp、dHpf1、およびdParg）がS2R +細胞の核に局在していることを確認しました（補足図1A）。 S2R+細胞を過酸化水素（H2O2）とメタンスルホン酸メチル（MMS）によるDNA損傷に曝露し、その後、異なる抗ADPr抗体と試薬を使用してDNA損傷の前後のADPrパターンを比較しました（図2A）。我々は、ADPr が H2O2 曝露後に迅速に（< 10 分）誘導され、ストレス後に急速に減衰することを観察しました（< 120 分、図 2A）。対照的に、アルキル化剤 MMS は、同じアッセイ条件下で U2OS 細胞に匹敵するそれほど顕著ではない ADPr 応答を示しました (図 2A)。ポリADPrの全体的なパターンは、ヒストンおよびPARP1に対応する顕著なバンドを有するヒトU2OS細胞のパターンを反映しています。シグナルの異なる起源を完全に排除することはできませんが、S2R+ ADPr シグナルとヒト U2OS 細胞の見かけの類似性は、ヒストンと hPARP1 が DNA 損傷誘発性 ADPr の 2 つの主要な標的として報告されています 11,12,15。は、このADPrシグナルがヒストンおよびdParpに関連していることを強く示唆しています。さらに、これらのデータは、ショウジョウバエとヒト細胞が DNA 損傷に応答して同等の ADPr 動態を示すことを明らかにしました 14、15、25。 dParp および dHpf1 が DNA 病変部位に積極的に動員されるかどうかを確認するために、S2R+ 細胞に GFP-dParp または GFP-dHpf1 をトランスフェクトし、生細胞イメージングと組み合わせたレーザー顕微照射を行いました (図 2B)。我々は、hPARP128,46で報告されているものと同等の、レーザー誘発損傷から数秒以内に損傷部位へのdParpの強力な動員を観察した。同様に、dParp ほどではないにせよ、損傷部位への dHpf1 の急速な動員も観察されました。これは、PARP1 が HPF1 のリクルートを上回るヒトのリクルートプロファイルを模倣しています 28。

ショウジョウバエ S2R+ 細胞とヒト U2OS 細胞を 2 mM H2O2 または 5 mM MMS で処理し、指定の時点で分析しました。細胞を溶解し、SDS-PAGEでタンパク質を分離し、イムノブロットでポリADPrレベルを分析しました。アクチンおよびポンソー S 染色をローディングコントロールとして使用しました。画像の横にある「PARP」および「ヒストン」ラベルは、これらのタンパク質が見つかるおおよそのサイズを示しています。この実験は独立して 3 回繰り返され、同様の結果が得られました。 B ショウジョウバエ S2R+ 細胞における 405 nm レーザー照射により誘発された DNA 損傷部位への EGFP-dParp および EGFP-dHpf1 動員の代表的な画像 (上) および動態 (下)。スケールバー、2 μm。 B のデータは、EGFP-dParp の場合は n = 24 セル、EGFP-dHpf1 の場合は n = 22 セルの 3 つの独立した複製 (条件ごとにレプリカあたり 6 ～ 10 セル) の代表であり、正規化された平均値 ± SEM を表します。照射部位は黄色の矢印で示されています。 C S2R+ 細胞を DMSO または 2 μM PARGi (PDD00017273) で 16 時間前処理し、その後 PARGi の非存在下または存在下で指定の時間 2 mM H2O2 処理しました。 Poly-ADPr (左パネル) および pan-ADPr (右パネル) レベルをイムノブロットによって分析しました。画像の横にある「PARP」および「ヒストン」ラベルは、これらのタンパク質が見つかるおおよそのサイズを示しています。この実験は独立して 3 回繰り返され、同様の結果が得られました。

dParg の標準的な PAR ヒドロラーゼ活性が示されています 32、41、47、48。 dParg が DNA 損傷中に細胞の PAR 化レベルを調節することを確認するために、我々は S2R+ 細胞を PARG 阻害剤 PDD00017273 (PARGi)49 で処理しました。ネガティブコントロールとしてジメチルスルホキシド（DMSO）で処理したコントロール細胞と比較した場合、PARGi処理S2R+細胞は、非刺激状態でより高いレベルのPAR化タンパク質を示しました（図2C）。また、PARGi 処理 S2R+ 細胞では DNA 損傷後に PAR 化が誘導されることも確認しました (図 2C)。対照的に、非刺激条件下では、DMSO 処理と PARGi 処理 S2R+ 細胞の間の汎 ADPr (MAR 化と PARy 化の両方の組み合わせ) の差異は無視できる程度しか検出されませんでした (図 2C)。しかし、DMSO処理S2R+細胞と比較して、PARGi処理S2R+細胞ではDNA損傷時にADPrが劇的に刺激されることが観察されました（図2C）。これらのデータは、ヒトPARG（hPARG）に対して開発されたPARGiがdParg活性を効率的に阻害し、それによってショウジョウバエにおけるADPrの分解をブロックし、ADPr部位の濃縮を可能にしたことを示唆している。

次に、質量分析によりショウジョウバエ S2R+ 細胞で ADP リボシル化されている特定のタンパク質を同定することを目的としました。この目的を達成するために、我々は確立された Af1521 濃縮アプローチ 50,51,52 を採用し、DNA 損傷の有無にかかわらず DMSO および PARGi で処理した S2R+ 細胞からのタンパク質抽出物を分析しました (図 3A)。全体として、ショウジョウバエ S2R+ 細胞の 296 個の ADPr 標的タンパク質に対応する 514 個の ADPr 部位（局在確率 > 0.9）を自信を持って特定しました（図 3B、C、および補足データ 2）。安心できることに、データは、ADPr ペプチドスペクトル一致 (PSM) の 75% 以上が局在化確率 > 90% を有し、良好な局在化確率を示しました (補足図 2A)。全体として、実験の反復間で高度な再現性が観察され、H2O2 処理サンプルに最も多くの変動が存在しました（図 3C、D、および補足図 2B）。

実験の概要。 S2R+ 細胞培養物を DMSO または 2 μM PARGi (PDD00017273) で、対照条件または DNA 損傷条件 (H2O2) で 4 回処理しました。ライセートは溶液中で消化され、社内で製造された GST タグ付き Af1521 を使用して ADPr 修飾ペプチドが濃縮されました。 ADPr サンプルは、EThcD ベースの断片化を使用して Thermo Orbitrap Fusion Lumos で分析されました。図の一部は、Servier が提供する Servier Medical Art を使用して生成されており、Creative Commons Attribution 3.0 非移植ライセンスに基づいてライセンスされています。 B 同定および局在化された ADPr 修飾部位およびタンパク質の総数を示すヒストグラム。 C ベン図は、4 つの異なるアプローチにわたって同定された固有の ADP リボシル化ペプチドの分布を示しています。 D 4 つの条件から特定された ADPr 部位の平均ピアソン相関。 n = 6 ±SD の平均値を示します。 E 特定および局在化された ADPr サイトの数の概要。 n = 4 の細胞培養を繰り返し、データは平均値 ± SEM として表示されます。 (F) (D) と同様、ADPr 強度を示します。各細胞培養条件は 4 つずつ準備され、データは平均値 ± SEM として表示されます。Ｇスケールベン図は、両方ともＨ２Ｏ２処理時のＤＭＳＯ条件下およびＰＡＲＧｉ条件下で同定されたＡＤＰｒ部位間の重複を示す。 H STRING ネットワークは、PARGi 処理条件下で特に見られる ADPr 部位とタンパク質間の機能的相互作用を視覚化します。最低限必要な相互作用スコアは高信頼度 (0.7) に設定され、切断されたタンパク質はネットワークから除外されました。タンパク質には、図の凡例で強調表示されている色で注釈が付けられました。

H2O2で処理したPARGiサンプル（合計483）で最も多くのADPr部位を特定し、次にH2O2で処理したDMSOサンプル（合計362、補足図2C）を特定しました。全体として、DNA損傷はADPリボシロムに最大の違いをもたらし（補足図2D）、平均して、DNA損傷にさらされたDMSO処理細胞と損傷のない細胞を比較すると、ADPr部位数の最大の増加に気づきました。 DMSO 処理細胞。H2O2 処理により約 6 倍多くの部位が検出されました (図 3E)。 PARGi 処理細胞でも同じ傾向が観察され、H2O2 処理では約 5 倍多くの部位が検出されました。 DNA損傷によるADPr部位の数の増加は、ADPr修飾ペプチドの強度においてさらに顕著でした（図3F）。ここでは、H2O2 処理した DMSO サンプルと PARGi サンプルで、それぞれ平均約 29 倍と約 30 倍の ADPr 強度が観察されました。 DNA 損傷誘発サンプルの場合、PARGi を添加すると、DMSO 条件と比較して約 2 倍の強度が得られました。 DNA損傷誘導時、DMSO処理細胞とPARGi処理細胞間の重複は高かった(66%)が、部位の約29%がPARGi処理サンプルに特異的であった(図3G)。後者の画分は、PARGi 処理によって安定化された生理学的に存在量が少ない、または急速な代謝回転部位を表す可能性が最も高くなります。 DNA損傷条件下でPARGi処理したサンプルに特異的な部位には、RNAプロセシング、染色体構成、およびリボソームに関与するタンパク質が豊富に含まれていました（図3H）。ただし、統計的に有意な変化は、PARGi処理で上方制御された5つの部位と、DMSO処理サンプルで上方制御された1つの部位に限定されていました（補足図2E）。

ヒト細胞で観察されたように11、12、14、50、この研究で検出された事実上すべての同定されたADPrアクセプター部位は、これらの実験条件下でセリン残基に局在しており（図4Aおよび補足データ2）、Ser-ADPrがセリン残基の主要な形態であることを示しています。ヒトで観察されたショウジョウバエDDRのADPr。 Af1521 濃縮アプローチに関する以前の調査では、特定のタンパク質 -ADP-リボース結合に偏りが見られなかったことを考慮すると、ショウジョウバエで他のアミノ酸残基の修飾が発生した場合、その存在量は検出限界を下回っている可能性があると考えられます。我々は、ほとんどのADPリボシル化セリン残基（69.4％）が、ヒトに見られるようにリジン-セリン（KS）モチーフに存在することを発見した13,51。これは、Ser-ADPrのターゲティングコンセンサスが進化的に保存されていることを示唆しています（図4Bおよび補足データ2））。同様に、Ser-ADPr の標的は主に、ゲノムの安定性とクロマチン構造の維持に関連する核タンパク質です (図 4C)。

ADPr 修飾アミノ酸残基の分布を視覚化した円グラフ。 B IceLogo 分析は、同定されたセリン ADPr 部位 (水色の星) の周囲の配列コンテキストを示し、線より上のアミノ酸残基が濃縮されています。 ADPr 標的タンパク質のすべてのセリン残基の配列ウィンドウを参照として使用しました。 C 遺伝子オントロジー分析は、全ゲノムと比較してすべての Ser-ADPr 標的タンパク質の濃縮を視覚化します。 CC セルラーコンパートメント; BP 生物学的プロセス; MF 分子機能。 D ADPr 部位の全体的な強度、ヒストンからの ADPr 強度、およびヒストン H1A Ser199 からの ADPr 強度を示すヒストグラム。 E ショウジョウバエで同定された ADPr 部位とヒトで同定された ADPr 部位を比較した表。 F dParp 自動修飾分析。MS/MS 強度に基づいた相対的な修飾量を示します。 n = 4 の細胞培養を繰り返し、データは平均値 ± SD として表示されます。 G 選択された昆虫および哺乳類の PARP 自動修飾ドメイン配列の多重配列アラインメント。 dParp および hPARP1 で同定された Ser-ADPr 部位は、アラインメントの上にそれぞれ二重短剣 (‡) およびコッパ (ϟ) 記号で示されています。インデックス付けは、dParp 残基の位置を示します。拡張昆虫アラインメントを補足図2に、配列を補足表1に示します。

ヒト細胞株では、ヒストンがADPr50,53の主要な標的であることが示されており、これはショウジョウバエでも同様であることが確認されました（図4D）。具体的には、ショウジョウバエのヒストンH1が最もADPリボシル化されたタンパク質の1つであり、複数の部位に修飾があり、Ser199が最も豊富に修飾された残基として同定されたことが判明した（図4D、補足図3Aおよび補足データ2）。ヒストン H1 の ADPr 部位はヒトヒストン H1 で見られる部位と同一ではありませんが、他のタンパク質にあるショウジョウバエの他の多くの Ser-ADPr 部位はヒトのホモログの部位と同一です。たとえば、ここではショウジョウバエのヒストン H3 上の Ser10 および Ser28 上の ADPr を観察しましたが、これらは以前の観察に従ってヒトのヒストン H3 上でも修飾されています 11、12、14、19、50。 S10 ADPr は生理的条件下でショウジョウバエで観察されましたが、Ser28 上の ADPr は DNA 損傷時にのみ観察されました。ショウジョウバエ DNAlig1 は Ser4 で ADP リボシル化されており、これはヒト Lig111,12 でも見られます。別の例は、ヒトSer1342に対応するSer1424がADPリボシル化されたショウジョウバエBLMであった(図4E)12。

これらのトランス標的に加えて、dParp は 4 つのセリン残基 (Ser362、Ser491、Ser494、および Ser496) で自動 ADP リボシル化され、これらの修飾部位の強度は、PARGi および H2O2 処理に関する総 ADPr の世界的な傾向に従っています (補足図 3B ～ E および補足データ 2)。しかし、ADPr強度の相対的な割合は条件によって異なり、対照条件下ではSer494が最も多く修飾され、DNA損傷時にはSer491が最も多く修飾された(図4F)。観察された dParp の自動修飾は、主要なアクセプター部位 Ser499、Ser507、および Ser51911、30、50 を含む、以前に記載されたヒト PARP1 (hPARP1; aa 373-527) の自動修飾ドメインに対応する領域に位置していました。 4つのdParp自動修飾部位のうち、Ser491とSer496は完全に存在し、Ser494は部分的に（75％、選択された36種の昆虫種のうち27種）、Ser362は昆虫では保存されていません（補足図4および補足データ1）。さらに、哺乳動物と昆虫のPARP1自動修飾部位の配列コンテキストは、それぞれの系統分類内で保存されていますが、系統分類を超えて保存されているわけではありません。他のPARP1ドメイン/領域と比較した主要な自動修飾部位の位置が高度に保存されていることは驚くべきことである(図4G)。これは、DNA損傷部位からのPARP1の動員と放出の制御におけるPARP1自動修飾の潜在的な役割が、正確なアミノ酸の文脈ではなく、構造内の相対的な位置に依存していることを示唆しています。これは、配列コンテキストの認識を妨げる可能性がある伸長および分岐した ADP リボース鎖で構成される PARP1 自動修飾の性質によってさらに裏付けられます。

同定された Ser-ADPr タンパク質標的のほとんどはヒトとショウジョウバエで共通でしたが、我々はショウジョウバエに特異的な 25 個の Ser-ADPr 標的（機能不明の 11 個のタンパク質を含む）も同定しました。遺伝子オントロジー分析では、異色染色体領域や多糸染色体などの染色体に関連する細胞成分が強力に濃縮されていることを示しています (図 4C)。たとえば、マルチ AT フック染色体タンパク質である D1 の Ser21 上の ADPr は、全タンパク質中で 2 番目に高い強度を示しましたが、HP1 インタラクターとして同定されたショウジョウバエ HP5 は 6 つの Ser-ADPr 修飾部位 (Ser98、Ser101、Ser211、 Ser249、Ser347、Ser399）。

興味深いことに、PARGi処理によりSer-ADPr部位の存在量が2倍になり、dPargがショウジョウバエにおけるモノ-Ser-ADPrの除去に関与している可能性があることが示された（図4E）。これを確認するために、我々はまず、dPargがレーザー誘発性DNA損傷部位にリクルートすることを確立しました（補足図1B）。次に、H2O2への曝露の前後で、dParg遺伝子またはLacZ遺伝子（対照として使用）の二本鎖RNA（dsRNA）媒介ノックダウンを受けたS2R+細胞のADPrパターンを調査しました（図5）。 dParg遺伝子のコードDNA配列の異なる部分に対応する2つの異なるdsRNA（図5A）を使用して、その効果がdParg枯渇に特異的であることを確認した（図5B）。次に、全細胞抽出物のイムノブロットにより、H2O2 処理の前後での PARP 媒介 ADPr の生成物を分析しました。興味深いことに、DNA損傷の前後で両方のdPargノックダウン細胞株でモノADPrタンパク質のレベルが増加しましたが（図5C〜E）、ポリマーレベルはH2O2曝露後にのみ増加しました（図5E、F）。これは、dParg が in vivo で末端結合を切断できることを示唆しており、我々の ADP リボシロミクスデータと併せて、可逆的な DNA 損傷誘発性 ADPr の標的としてセリン残基を示しています。

dParg 遺伝子のゲノム領域の概略構造。白色のボックスと灰色のボックスは、それぞれ dParg 遺伝子の非翻訳領域とコード領域を示します。黒い上線は、PARG dsRNA によって標的とされる領域を示します。 B RT-qPCR によって決定され、内部対照として RpL39 遺伝子を使用して正規化された、S2R+ 細胞における dParg 遺伝子の相対遺伝子発現分析。エラーバーは、3 つの独立したレプリカからの平均 SD を示します。アスタリスクは、t 検定によって決定された、対照と比較した統計的有意性を示します (****p < 0.0001、両側 P 値、PARG-1 対 LacZ、p = 6.9 × 10−8、PARG-2 対 LacZ) 、p = 6.3 × 10−8）。ショウジョウバエ S2R+ 細胞を 2 mM H2O2 で処理し、指定の時点で分析しました。 C-F 全細胞溶解物からのタンパク質を SDS-PAGE で分離し、モノ-ADPr- (MAR 抗体 AbD33204)、C モノ-ADPr- (MAR 検出試薬 MABE1076、D pan-ADPr- (PAR とMAR 検出試薬、MABE1016。(E) およびポリ-ADPr-(抗体 4336-BPC-100。F 結合試薬。ポンソー S 染色およびアクチンをローディングコントロールとして使用しました。これらの実験は独立して 3 回繰り返され、同様の結果が得られました。

次に、ショウジョウバエのタンパク質を使用して in vitro で Ser-ADPr を再構成することにしました。まず、組換え hPARP1:hHPF1 について以前に示したように、組換え dParp1:dHpf1 複合体が in vitro でヒストン H3 テールを効率的に ADP リボシル化できることを実証しました (図 6A)11、15、18。修飾の性質を確認するために、修飾ペプチドを精製し、それぞれ Glu/Asp 結合および Ser 結合 ADPr に特異的な 2 つのヒト (ADP-リボシル) ヒドロラーゼ hTARG1 および hARH3 とインキュベートしました 21,25,54。ここで、hARH3はヒストンH3ペプチドからADPrを効率的に除去したが、hTARG1は除去しなかったことを示すことができ、修飾が実際にSer-ADPrであることを強く示唆した（図6B）。

H3 ヒストンペプチド (aa 1-21) の Mono-Ser-ADPr は、ADP-リボース供与体として 32P-NAD+ を使用して、組換え hPARP1:hHPF1 複合体、または組換え dPARP1:dHPF1 複合体とインキュベートすることによって得られました。 PARP反応はオラパリブの添加により停止した。この実験は独立して 3 回繰り返され、同様の結果が得られました。 B (A) からの ADP リボシル化ヒストン H3 ペプチドを反応液から精製し、組換え hARH3 で処理して Ser-ADPr の存在を確認しました。この実験は独立して 3 回繰り返され、同様の結果が得られました。

前述したように、ショウジョウバエ種には ARH3 オーソログが欠如しているため、(ADP-リボシル)-セリル結合の切断は別の酵素によって実行する必要があります。 S2R+細胞でPARGiを使用した実験におけるADPリボシル化シグナルの持続性は、dPargがDNA損傷依存性のADPrシグナル代謝回転に関与していることを示唆しています（図2B、C、3、および4）。 dParg の他に、ショウジョウバエは 3 つの hTARG1 ホモログ (CG33054/dTarg1、CG33056/dTarg2 および CG34261/dTarg355) を発現します。これらのホモログが Ser-ADPr 除去に寄与する可能性は排除できません。これらの酵素の基質特異性を評価するために、特徴付けられたヒトヒドロラーゼhPARG、hARH3、およびhTARG1を対照として使用し、異なるモデル基質を使用して（ADP-リボシル）ヒドロラーゼアッセイを実行しました（図7および補足図5）。具体的には、本発明者らは、hHPF1の存在下および非存在下で、それぞれセリン15,18結合ポリADPrおよびグルタミン酸5,56結合ポリADPrを生成するhPARP1 WTの以前に確立された能力を利用した30。同様に、特異的なモノ (ADP-リボシル) トランスフェラーゼである hPARP1 E988Q 変異体を使用してモノ ADPr 変異体を生成しました 57。 hPARGとdPargは両方ともADP-リボースポリマーを容易に除去しましたが、hARH3による代謝回転はそれほど顕著ではありませんでしたが（図6Aおよび補足図5A）、末端グルタミン酸-ADPr結合を効率的に除去することはできませんでした（補足図5A、B）。。さらに、dPargおよびhARH3はペプチドおよび自動修飾hPARPからmono-Ser-ADPrを除去する能力を示しましたが、これはhPARGおよびショウジョウバエTARGオーソログでは見られませんでした（図7）。

A hHPF1およびポリ-Ser-ADP-リボシル化ヒストンH3/H4四量体の存在下での、ヒトおよびショウジョウバエ（ADP-リボシル）ヒドロラーゼによる自動修飾hPARP1上のポリ-Ser-ADPrの除去。反応は、ヒストンH3ペプチドの代わりにヒストンH3/H4四量体を使用したことを除き、図5Aと同様に実施した。下のパネルは、タンパク質の CBB 染色 SDS-PAGE を示します。この実験は独立して 3 回繰り返され、同様の結果が得られました。 B hHPF1 (0.5 μM) およびモノ-Ser-ADP リボシル化 H3 ペプチド (aa 1-21、0.5 μg) の存在下での、ヒトおよびショウジョウバエ (ADP-リボシル) による自動修飾 hPARP1 (0.5 μM) 上のポリ ADPr の除去)加水分解酵素。反応は図5Aに記載されているように実行されました。下のパネルは、タンパク質の CBB 染色 SDS-PAGE を示しています。この実験は独立して 3 回繰り返され、同様の結果が得られました。 C ヒトおよびショウジョウバエの (ADP-リボシル) ヒドロラーゼによるモノ-Ser-ADP-リボシル化ヒストン H3 ペプチド (aa 1-21) 上のモノ-Ser-ADPr の除去。反応は図1Aに記載のように実行され、ペプチドは図1Bに記載のように精製されました。下のパネルは、タンパク質の CBB 染色 SDS-PAGE を示します。この実験は独立して 3 回繰り返され、同様の結果が得られました。 D AMP-Gloアッセイ(Promega)を使用した、S7上の合成ヒストンH2Bペプチドモノ-Ser-ADPrに対する示された加水分解酵素の加水分解酵素活性の測定。サンプルはバックグラウンド補正され、hARH3 に対して正規化されます。データは、3 つの独立した実験の 3 回の測定値±SEM を表します。

セリン-PAR化ヒストンH3.1/H4四量体を基質として使用した場合13、ポリ-Ser-およびモノ-Ser-ADP-リボシル化hPARP1の両方が観察されたため、試験したすべての(ADP-リボシル)ヒドロラーゼの活性を個別に評価することができました。ポリ-Ser-およびモノ-Ser-ADPr (図7A)。このアッセイは、dParg がポリ-Ser-およびモノ-Ser-ADP リボシル化 hPARP1 およびヒストンの両方から ADPr を効率的に逆転させることを明確に示しています。逆に、hPARG は hPARP1 とヒストンから PAR のみを除去しましたが、hARH3 は hPARP1 から mono-Ser-ADPr を効率的に除去しましたが、PAR にはあまり作用せず、修飾されたヒストンに対しては活性を示さなかった。 hARH3 と dParg の mono-Ser-ADPr を除去する能力を比較するために、合成ヒストン H2B ペプチドを利用したヒドロラーゼ反応を実行し、その後、放出された ADP-リボースをヒト NudT5 によって AMP に変換し、市販の AMP-リボースを使用して発光検出を行いました。 Glo アッセイ (Promega; 図 7D)58、59、60。 Mono-Ser-ADPr は hARH3 と dParg の両方によって加水分解されますが、hARH3 の方がより効率的に作用します。まとめると、我々のデータは、ショウジョウバエにおける完全なSer-ADPr逆転は、2つの酵素（hPARGとhARH3）を必要とするヒトシステムとは対照的に、単一の酵素（dParg）のみに依存していることを示している。さらに、hARH3 と dParg のモノ-Ser-ADPr 加水分解活性の違いは、単一タンパク質 (PARG) 内で両方の触媒機能 (モノ-Ser-ADPr と PAR 加水分解) を維持するには効率コストがかかる可能性があることを示唆しています。

ＰＡＲ鎖とモノ－Ｓｅｒ－ＡＤＰｒの両方を除去するｄＰａｒｇの予期せぬ能力を調査するために、我々はそのドメインアーキテクチャをｈＰＡＲＧと比較した（図８Ａ）。両方の酵素は、hPARGではPAR分解の原因となる、保存されたアクセサリーおよび触媒マクロドメインモチーフを共有していますが、dPargはhPARGのN末端領域を欠き、追加のC末端ドメインを所有しています（図8A）。したがって、このドメインがセリン-リボース結合の加水分解に関与している可能性があるかどうかを調査しました。この仮説を検証するために、本発明者らは、C末端dPargドメインの3つの切断を生成し、これらの変異体がhPARP1自動PAR化(図8B)およびヒストンH3モノ-Ser-ADPr(図8C)を除去する能力を評価した。 3 つの切断により、dParg Δ554-723 は PAR および mono-Ser-ADPr に対する活性を失ったが、これはおそらく酵素の構造的完全性に対する C 末端ドメインの寄与によるものであるのに対し、dParg Δ558-723 および dParg Δ574-723 は活性を保持していることが示された。 PAR と mono-Ser-ADPr の両方を除去する機能。これらの結果は、dParg の C 末端伸長がその特異的な Ser-ADPr 活性に関与していないことを示し、保存された活性部位が PAR と Ser-ADPr 除去活性の両方に関与しているに違いないことを示唆しています。

PARG ドメインアーキテクチャの概略図。触媒ドメインは 2 つのサブドメインで構成されます。アクセサリドメイン (AD、黄色) とマクロドメイン (マクロ、赤色)。ドメインの境界は下に示され、触媒の EE モチーフ (黒線) が図の上に示されます。略語 C. elegans PARG1、cPARG1。 D. melanogaster Parg、dParg; ホモ・サピエンスPARG、hPARG。テトラヒメナサーモフィラ Parg、tParg。 B ポリ Glu 自動修飾 hPARP1 に対する dParg 触媒変異体および C 末端切断の活性。 Poly-Glu自動修飾hPARP1を図6Cに記載したように取得し、続いてdParg WTまたは示された変異体を補充した。この実験は独立して 3 回繰り返され、同様の結果が得られました。 C 精製モノ-Ser-ADP-リボシル化ヒストン H3 ペプチド (aa 1-21) に対する dParg 触媒変異体および C 末端切断の活性。 Mono-Ser-ADP リボシル化ヒストン H3 ペプチド (aa 1-21) を「方法」に記載されているように取得し、その後 dParg WT または指定の変異体を補充しました。この実験は独立して 3 回繰り返され、同様の結果が得られました。

PARGの事前の特性評価により、PAR鎖の除去に重要な2つの完全に保存された残基（ヒトではGlu755およびGlu756）を含む触媒ループが同定されました（図8A、Bおよび補足図6）24。我々は、対応する dParg 残基 (Glu340 および Glu341) をアスパラギン酸とアラニンの両方に変異させて、これらの変異体が mono-Ser-ADPr を除去する能力を保持しているかどうかを評価しました。まず、本発明者らは、自動修飾されたｈＰＡＲＰ１に対してＷＴおよび変異型ｄＰａｒｇの両方を評価した（図８Ｂ）。予想通り、これらの変異により、PAR に対する dParg 活性が消失しました。同様に、モノ-Ser-ADP-リボシル化ヒストンH3に対するdParg活性は検出できませんでした（図8C）。これらのデータは、これらの変異が dParg 活性を無効にすることを明確に示しており、同じ活性部位が PAR と mono-Ser-ADPr の両方の除去に関与しているという考えを裏付けており、dParg がどのようにして mono-Ser-ADPr を除去するかという疑問が残されています。

dParg触媒ドメインがSer-ADPr除去活性を進化させたという発見は、他の生物由来のPARGホモログがそのような活性を有し得るかどうかを調べることを我々に促した。我々は、繊毛虫テトラヒメナサーモフィラ (tParg) の PARG ホモログの活性をテストしました。 HPF1の非存在下では、試験したすべてのPARGのWT変異体は、自動修飾されたhPARP1からグルタミン酸結合PARを除去することができるが、モノ-Glu-ADPr hPARP1に対応する単一のバンドを残す(図9A)。この活性は、触媒性 tParg E256Q 変異体では無効になっていました。興味深いことに、tPargは、修飾H3ペプチドからのmono-Ser-ADPrの除去に関してdPargと同様に挙動し、この活性は触媒的に死んだtParg E256Q変異体では失われていた(図9B)。これらのアッセイにより、PARG酵素によるmono-Ser-ADPrの除去はショウジョウバエに特有のものではなく、少なくとも1つの他のARH3欠損門に共有される機構であることが確認された（図1A）。

ポリＧｌｕ自動修飾ｈＰＡＲＰ１に対するＴ．サーモフィラ由来のＰＡＲＧホモログの活性。 Poly-Glu 自動修飾 hPARP1 は、図 6C に記載されているように得られました。この実験は独立して 3 回繰り返され、同様の結果が得られました。 B 精製されたモノ-Ser-ADP-リボシル化ヒストン H3 ペプチド (aa 1-21) に対する tParg の活性。 Mono-Ser-ADP-リボシル化ヒストン H3 ペプチド (aa 1-21) を、方法に記載されているように取得しました。この実験は独立して 3 回繰り返され、同様の結果が得られました。

Ser-ADPr を除去する dParg の能力についての洞察を得るために、触媒的に活性な dParg Δ574-723 トランケーションの 2 つの構造を解明しました。アポ構造は 2.47 Å の分解能で解明されました (PBD 8ADK、図 10A および補足データ 2)。）およびPARGiとの共結晶構造を解像度2.51Åまで（PDB 8ADJ、補足図7および補足データ2）。両方の構造は非常に類似しており、残基 26 ～ 525 および 533 ～ 547 は電子密度ではっきりと確認でき、369 個の整列した Cα 上の RMSD は 0.139 Å です。 dParg 構造は、予測される基質結合裂け目と触媒残基を保持する中央のマクロドメインの折り畳みで構成されています 61,62。マクロドメインは、高度に構造化され保存されたアクセサリードメインによって拡張されており、その結果、ドメイン全体は、主にαヘリックスの2つのサブドメインが隣接する、ねじれた混合10本鎖βシートで構成されています（図8A）。 dParg の全体構造は他の PARG と類似しており、ヒト (PDB 4B1G) では 381 整列 Cα で 0.586 Å、マウス (mPARG; PDB 4FC2) では 366 整列 Cα で 0.651 Å、tParg では 255 整列 Cα で 1.816 Å の RMSD を持ちます。 (PDB 4EPP、図 10B)。同様に、dParg:PARGi 複合体は、同様の阻害剤を含む hPARG 複合体とよく似ています (PDD00017262 [PBD 5LHB] では 374 の整列 Cα 上で 0.514 Å の RMSD、PDD00017299 [PDB 6HML] 複合体では 369 の整列 Cα 上で 0.491 Å の RMSD)。 PARGi結合は、基質結合溝内のアデノシン配位領域と重複します。この結合は、Tyr380 / Phe485と2,4-キナゾリンジオン部分の間の千鳥状πスタッキング相互作用（補足図7）、およびIle311、Phe485の主鎖（補足図7）およびGlu312、Gln339、およびPhe485の側鎖（補足図7）。 hPARG:ADPr 複合体 (PDB 4NA0) では、dParg Phe485 と同構造の Phe902 がアデニン環とスタックし、これには阻害剤スタッキング相互作用に対して約 90° の側鎖回転が必要であることに注目するのは興味深いことです。これは、阻害剤の結合が結合スペースをめぐって競合するだけでなく、重要な基質接触も変化させることを示しています。

apo dParg のリボン表面表現。整列した hPARG:ADP-リボース二量体複合体構造の ADP-リボース二量体 (黄色) は、活性部位を強調するために示されています。触媒作用にとって重要な構造的特徴が強調表示されています：アクセサリードメインループ 1 と 2、AD ループ 1 と 2。触媒ループ、ループ 1; 二リン酸結合ループ、ループ 2。チロシンクラスプ、Tyrループ。 B 示された種（ショウジョウバエ、赤、ヒト、黄色、マウス、オレンジ、T.好熱菌、白）の PARG ドメインの構造アライメントをリボンで示したもの。触媒残基 (dParg の Glu340/Glu341) は黒で強調表示されます。 C ショウジョウバエ、ヒト、および好熱性菌の PARG のループ 1-AD-ループ 1 相互作用のリボン-カンゾウの表示。極性相互作用は黒い点線で強調表示され、相互作用に関与する水分子は赤い球として強調表示されます。

ｄＰａｒｇと哺乳類のｈＰＡＲＧおよびｍＰＡＲＧ、ならびに原生動物のｔＰａｒｇ構造との比較は、ほぼ同一の活性部位構造を示す（図９Ｂ）。触媒ループ（ループ1）の位置は比較された構造内で等構造ですが、二リン酸結合ループ（ループ2）は基質結合時に立体構造再配置を受けることが知られています（図10B、補足図7および8、および補足表） 1)63,64。ループ2は開いた位置で結晶化しているように見え、apo mPARG構造によく似ています（補足図8）。 mPARG:ADPr 複合体構造 (PDB 4NA0) では、ループが基質結合溝にわずかに移動し、Gly866 および Ala867 の主鎖窒素原子が ADP リボースのリン酸酸素原子と相互作用できるようになります。基質結合にはさらに、Phe868（dPargのPhe458）およびHis821（dPARGのHis413）の再配置が伴い、これらは結合裂から移動し、遠位リボースの調整に寄与します（補足図7）。これらの発見は、ADP-リボース部分の配位や触媒残基の配置に大きな構造上の違いがないことを示唆しており、末端Ser-ADPr結合を除去できるPARGと除去できないPARG間の微妙な違いを示唆している。

最後に、ループ 1 に隣接する構造的特徴を調査しました。アクセサリードメイン内に位置する 2 つのループは、両方ともループ 1 の位置決めとアクセサリー - マクロドメインの相互作用をサポートすることが特定されました (AD ループ 1 および 2 と呼ばれます。図 10A、B、および補足図)。 .6）。ループ１：ＡＤ－ループ１相互作用は、ｈＰＡＲＧにおける拡張された水ネットワークによって安定化される（図１０Ｃ）。しかしながら、これらの相互作用はdPargでは顕著に減少するが、ADループ1はtPargでは存在しない(図10C)。ループ 1 と AD ループ 1 の間の配位ネットワークの主な違いは、スレオニン残基 (hPARG では Thr748) が存在するのに対し、dParg と tParg は両方とも等構造位置にロイシン残基 (それぞれ Leu333 と Leu248) を含んでいることです。は、スレオニンが哺乳類内で保存されており、ロイシンが双翅目、線虫類、原生動物に見られることを示したので（補足図6）、これは実際に基質特異性の1つの要因であることを示唆しています。ならびに基板から離れた方向（図１０Ａ）は、触媒機構に直接関与していないことを示唆している。

セリン結合 ADP リボシル化は、ヒトおよび他の哺乳動物種の DDR における重要なシグナル伝達機構です。ここで我々は、このシグナル伝達変異体が動物界全体に広がり、この界のDDR規制の決定的な特徴である可能性があるという証拠を提供した。最先端の質量分析法を使用して、500 を超える信頼性の高い ADPr 部位を特定するショウジョウバエ ADP リボシロムの最初の草案を提供します。以前に、ADPr はアスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、およびアルギニン残基を修飾することが報告されています 52,65,66。アクセプター部位としてのセリン残基の比較的最近の発見 13 により、細胞培養における DNA 損傷下で最も多く修飾されるアミノ酸残基としてセリンが同定されました 12,14。考えられるすべてのアミノ酸残基 50、67、68 上の ADPr を同定できる Af1521 濃縮戦略と、修飾部位の適切な位置特定のための ETD 断片化 12 を組み合わせることで、これらの実験条件下でショウジョウバエで最も豊富に修飾された残基としてセリンを同定しました。。それでも、実験条件や配列決定の深さによって、他の既知のアミノ酸アクセプター残基が欠如する可能性があります。 D. melanogaster における Ser-ADPr サイクルの解析により、ヒトのシグナル伝達経路との顕著な保存性がさらに明らかになりました。分子レベルでは、哺乳類のADPrコンセンサスモチーフ「KS」が保存されているだけでなく、以前に同定されたヒトのADPr標的との広範な重複が観察されました。これは、PARP1 やヒストンなどの主要な ADP リボースアクセプターに特に当てはまります。どちらの種でも、ゲノムの安定性、クロマチン構造の制御、および転写に関連する経路がこの修飾の主な標的となっています。したがって、我々のデータは、ショウジョウバエがSer-ADPrシグナル伝達の生理学的機能についての洞察を提供するモデル生物として機能できることを示唆している。これには、この修飾と神経変性や癌などの関連疾患との関連を理解する可能性が含まれます30、41、69、70、71。この点において、dParg 欠損はヒト ARH3 遺伝子を使用して補完できることが以前に示されています 71。また、DNA切断時のhPARP1トラップとヒトのPARP阻害剤反応にとって重要であることが示されているhPARP1自動修飾領域はショウジョウバエ種で機能的に保存されているため（図4Gおよび補足図4）、このモデルは次のような場合に役立つ可能性があります。臨床的に関連するPARP阻害剤の生理学的効果の理解30。

我々の系統解析では、HPF1 を保有する種の中で、ARH3 が原生動物、線虫類、鱗翅目、双翅目には存在しないことが明らかになりました。対照的に、ARH3 は、板動物門、海綿動物門、または刺胞動物門の基底動物を含む、ほとんどの動物界で同定できます。 ARH3 の存在と不在のこのパターンは、(i) 動物界の初期進化における ARH3 の獲得、および (ii) 少なくとも 2 つの独立した喪失イベント、つまり最初は線虫目と節足動物の間の分裂で、そして 2 回目は独立した喪失イベントを含むという進化史を強く示唆しています。内翅目上目内での多様化中。興味深いことに、PARP2はヒトでもSer-ADPrを生成することができますが、ショウジョウバエには存在しません。したがって、ショウジョウバエは、生理学的機能が保存されているにも関わらず、dHPf1、唯一の DNA 修復 PARP としての dParp (hPARP1 ドメイン構造を持つにもかかわらず)、およびdParg は、ポリ-およびモノ-Ser-(ADP-リボシル)ヒドロラーゼ活性の両方を兼ね備えています。機能的な類似性を考慮すると、信号の確立と除去の操作が容易になるため、これは一部の研究にとって有利である可能性があります。さらに、我々の研究は、ADPr検出試薬や抗体、阻害剤など、ヒトSer-ADPrの研究と臨床応用のために開発されたツールが、ショウジョウバエにおけるADPrシグナル伝達の研究に適用できることを明らかにした。我々の構造データは、dParg の活性部位が哺乳類および原生動物の PARG に関して保存されていることを明らかにし、したがって活性の違いが触媒機構の変化の結果ではないことを示しています。我々のデータを総合すると、Ser-ADPr 結合を切断する能力は、特定の基質のアクセスを（不可能に）可能にする活性部位周囲の微妙な構造の違いに依存していることが示唆されます。この考えは、基板の形状の違いによってさらに裏付けられます。 hPARGと複合体を形成したADP-リボース二量体(PDB 5A7R)の構造データは、n-1単位が活性部位から直線的に伸びていることを示している(図10A)。対照的に、hARH3 と共結晶化したセリン修飾ペプチド (PDB 7AKS) は、ADP リボース結合ポケットに対して垂直に位置します。ただし、さまざまなPARGとそのさまざまな基質との相互作用様式を識別するには、さらなる研究が必要です。我々の系統発生学的および生化学的発見に基づいて、末端タンパク質-リボース結合を切断するPARGの能力はショウジョウバエに限定されない可能性があると推測することは興味深い。これは、(i) HPF1 は保有するが ARH3 を欠くいくつかの進化的分岐の同定 (図 1)、(ii) tParg が Ser-ADPr も除去できるという実験的確認 (図 9)、および (iii) によって裏付けられています。 ) シロイヌナズナ Parg1 が SZF172 からモノ ADPr を除去できることを示す植物の最近の観察。特に、PARG 遺伝子重複は植物と C. elegans の両方で報告されており 73,74 、これは既知の ADPr シグナル伝達システムの多様化を示しており、将来の発見に新たな驚きをもたらす可能性があります。

ショウジョウバエ S2R+ 細胞株は DGRC (https://dgrc.bio.indiana.edu/Home) で購入し、10% 熱不活化ウシ胎児血清 (10500) を補充したショウジョウバエシュナイダー培地 (21720-024、Gibco) で培養しました。 -056、Gibco) および 1% ペニシリン-ストレプトマイシン (100 U/ml、15140-122、Gibco) を 25 °C で添加し、3 ～ 4 日ごとに継代しました。ヒト U2OS 骨肉腫細胞株は ATCC (HTB-96) で購入し、10% FBS (F9665、Sigma) およびペニシリン - ストレプトマイシン (100 U/mL、GIBCO) を添加した DMEM (10566016、Gibco) 中で 37°で増殖させました。 5% CO2 を含む C で培養し、3 ～ 4 日ごとに継代します。すべての DNA 損傷誘導実験では、細胞を 6 cm ディッシュに S2R+ 細胞の場合は 5 × 106 細胞、U2OS 細胞の場合は 2 × 106 細胞の密度で播種しました。翌日、細胞をＰＢＳで一度注意深く洗浄し、ＰＢＳ中の２ｍＭＨ２Ｏ２（Ｈ１００９、Ｓｉｇｍａ）または５ｍＭＭＭＳ（１２９９２５、Ｓｉｇｍａ）＋カルシウムおよびマグネシウム（ＤＰＢＳ、Ｇｉｂｃｏ、１４０４０−１３３）で指定の時間損傷させた。 PARG 阻害剤の治療のために、5 × 106 細胞を 6 cm ディッシュに播種しました。翌日、細胞を2μM PARG阻害剤(PDD00017273、Sigma)で16時間処理し、対照細胞をDMSOで処理した。続いて、上述のようにＨ２Ｏ２処理を行った。

細胞を、1×プロテアーゼ阻害剤（Roche）、1μM PARGを添加した50 mM TrisHCl（pH 8.0）、100 mM NaCl、および1％（v/v）Triton X-100、5 mM MgCl2、1 mM DTT中で溶解しました。阻害剤 (PDD00017273、Sigma)、および 1 μM PARP 阻害剤 (Olaparib、LKT LABS)。溶解物を 0.1% ベンゾナーゼ (Sigma) とともに 4 °C で 30 分間インキュベートしました。可溶性画分を、50 mM DTT を含む NuPAGE LDS サンプルバッファー (Invitrogen) と混合し、タンパク質を 95 °C で 5 分間変性させました。 S2R+ 細胞からの全細胞抽出物を NuPAGE Novex 4 ～ 12% Bis-Tris ゲル (Invitrogen) 上で電気泳動により分離し、Trans-Blot Turbo Transfer System (Bio-Rad) を使用して 30 分間ニトロセルロース膜 (Bio-Rad) に転写しました。ブロットしたメンブレンを、0.1% (v/v) Tween 20 および 5% (w/v) の脱脂粉乳を含む PBS バッファーで室温で 1 時間ブロックし、ウサギ抗ポリ ADPr 抗体 (4336-BPC- 100、Trevigen、1:1,000、RRID: AB_2721257)、ウサギ抗ポリ ADPr 抗試薬 (MABE1031、Millipore、1:500、RRID: AB_2665467)、ウサギ抗汎 ADPr 抗試薬 (MABE1016、Millipore、1:1,000、 RRID: AB_2665466)、ウサギ抗モノ ADPr 抗試薬 (MABE1076、Millipore、1:500、RRID: AB_2665469)、ウサギ抗モノ ADPr 抗体 (AbD33204、BioRad、1:1,000)、ウサギ抗リン酸ヒストン H2AvD (Ser137) ) 抗体 (600-401-914、Rockland、1:3,000、RRID: AB_828383)、マウス抗リン酸ヒストン H2A.X (Ser139) 抗体 (クローン JBW301、05-636、Millipore、1:500、RRID: AB_309864)またはマウス抗アクチンモノクローナル抗体 (JLA20、濃度、Developmental Studies Hybridoma Bank、1:10,000、RRID: AB_528068) を 4 °C で一晩反応させます。 0.1% (v/v) Tween 20 を含む PBS で洗浄した後、ブロットを西洋わさびペルオキシダーゼ標識抗ウサギ IgG (P0399、Dako、1:4,000、RRID: AB_2617141) または抗マウス IgG (P0447、 Dako、1:4,000、RRID: AB_2617137) を 1 時間。 Pierce ECL ウェスタンブロッティング基質 (Thermo Scientific) を使用して検出を実行し、Hyperfilm ECL (Amersham) を使用するルミノグラフィーによって分析しました。実験は、少なくとも 3 回の独立した繰り返しについて実施されました。

ADP リボシル化ペプチドは、以前の参考文献に記載されているように溶解および濃縮されました。簡単に言うと、細胞ペレットをペレット１０倍量の溶解緩衝液（６Ｍ塩酸グアニジン、５０ｍＭトリスＨＣｌ［ｐＨ８．５］）中で溶解し、激しい振盪と激しいボルテックスを交互に行うことによって完全な溶解を達成した。 TCEPおよびCAAを使用した還元およびアルキル化の際、リシルエンドペプチダーゼ（Lys-C、1:100 w/w; Wako Chemicals）を使用してタンパク質を3時間消化し、3倍量の50 mM重炭酸アンモニウムで希釈しました。サンプルは、改変シーケンシンググレードのトリプシン (1:100 w/w; Sigma Aldrich) を使用して一晩さらに消化されました。消化されたサンプルは、メーカーの指示に従って逆相 C18 カートリッジを使用して精製されました。ペプチドの溶出は、0.1% TFA中の30% ACNを用いて行い、ペプチドを-80℃で一晩凍結し、その後96時間凍結乾燥した。

凍結乾燥ペプチドを AP 緩衝液 (50 mM TrisHCl [pH 8.0]、1 mM MgCl2、250 μM DTT、および 50 mM NaCl) に溶解し、各反復実験に約 2 mg のペプチドを使用しました。サンプルをAf1521とともにインキュベートし、4℃で4時間、頭と尾を回転させたままにしました。ビーズを、新たに調製した氷冷AP緩衝液で2回、DTTを含む氷冷PBSで2回、氷冷MQ水で2回洗浄し、緩衝液を変えるたびにチューブを交換した。 ADPr修飾ペプチドは、氷冷した0.15% TFAの添加によりビーズから溶出されました。溶出されたペプチドは、0.45 μm スピンフィルターに通し、その後、予洗浄した 100 kDa カットオフスピンフィルター (Vivacon 500、Satorius) に通し、その後、高 pH で 3 つの画分と追加の F012、50、51、53 に分画しました。。

すべての MS 実験は、Fusion Lumos Orbitrap 質量分析計 (Thermo) に接続された EASY-nLC 1200 HPLC システム (Thermo) で分析されました。各サンプルは、内径 75 μm の 15 cm 分析カラムで分離され、1.9 μm C18 ビーズ (ReproSil-Pur-AQ、Dr. Maisch) が社内で充填され、カラムオーブンを使用して 40 °C に加熱されました。。ペプチド分離は、0.1% FAからなる緩衝液Aおよび0.1% FA中80% ACNからなる緩衝液Bを利用し、250 nL/分の流速で60分間の勾配を使用して実施した。質量分析計はデータ依存取得モードで動作し、フルスキャンは分解能 120,000、最大注入時間 250 ms で実行されました。前駆体のフラグメント化は、補足的な高衝突解離 (EThcD) を伴う電子移動解離を使用し、追加の活性化エネルギー 20 で達成されました。デシジョンツリーアルゴリズム。選択された前駆体は、45 秒の動的除外を設定することにより、繰り返しのシーケンスから除外されました。 MS/MS スペクトルは、Orbitrap で、最大前駆体注入時間 500 ms、スキャン解像度 60,000 で測定されました。すべての MS 生データは、MaxQuant ソフトウェアスイートバージョン 1.5.3.3076 を使用して分析され、2020 年 11 月 11 日に UniProt からダウンロードされた FASTA ファイル形式でショウジョウバエプロテオームに対して検索されました。以下を除き、デフォルトの MaxQuant 設定が使用されました: システインカルバミドメチル化、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、リジン、アルギニン、セリン、トレオニン、チロシン残基の ADP リボシル化が可変修飾として含まれています。アンドロメダデルタスコアは、修飾ペプチドの最低 20 に設定されました。

データの統計処理は主に無料で入手可能な Perseus ソフトウェア 77 を使用して実行され、主成分分析と火山プロット分析が含まれます。タンパク質遺伝子オントロジーのアノテーションは、DAVID Bioinformatics Resources78 を使用して実行されました。配列コンテキスト分析は、iceLogo ソフトウェア 79 を使用して実行されました。

RNA干渉分析は、参考文献で以前に説明されているように実行されました。 80、81。SnapDragon (https://www.flyrnai.org/cgi-bin/RNAi_find_primers.pl) を使用して、dParg cDNA のヌクレオチド 34 ～ 367 を dsPARG-1 のターゲットとして選択しました。 dsPARG-2 (769-1275) および dsLacZ のターゲットは、参考文献に以前に記載されているように生成されました。 32. PCRによってdsRNAのテンプレートを生成するためのオリゴヌクレオチドは補足データ3に示されています。dsRNAは、MEGAscript T7キット（Thermo Fisher Scientific、AM1334）を製造者の指示に従って使用して調製しました。 RNA を 65 °C で 30 分間変性させた後、4 °C までゆっくりと冷却してアニーリングしました。 1 × 106 細胞あたり 10 μg の dsRNA を添加しました。 dsRNA 処理後 5 日間細胞を回収し、続いて上記の H2O2 または下記の逆転写酵素定量ポリメラーゼ連鎖反応 (RT-qPCR) 分析を使用して DNA 損傷を誘導しました。

S2R+ 細胞からの全 RNA を RNeasy Plus Mini キット (QIAGEN) で精製し、その後 0.5 μg の全 RNA を製造業者の指示に従って QuantiTect Reverse Transcription Kit を用いた cDNA 合成に使用しました。 cDNAは、Rotor-Gene SYBR Green PCR KitおよびRotor-Gene Q (QIAGEN)を使用した定量的リアルタイムPCRによって検出されました。 RT-qPCR 用のプライマーペアは補足データ 3 に示されています。dParg 遺伝子の相対遺伝子発現分析は、ddCt 法を使用して実行されました。

統計分析には Prism 9.1 (GraphPad) を使用しました。****p < 0.0001。統計分析の詳細は、図 4 の凡例に記載されています。

hARH3、hTARG1、hHPF1、hPARP1、および hPARG の発現ベクターは以前に記載されています 5、15、54、63。 dParp、dParg、dTarg1-3およびdHpf1のコード配列は、補足データ3にリストされているオリゴヌクレオチドを使用してS2R+細胞から調製されたcDNAから増幅され、N末端Hisタグを持つpET28a発現プラスミドにクローニングされました。示されたすべての変異は、PCR ベースの部位特異的変異誘発によって導入されました (補足データ 3)。発現は、大腸菌ロゼッタ（DE3）細胞（Novagen）、および30μg/mlのカナマイシンおよび30μg/mlのクロラムフェニコールを補充したテリフィックブロス培地中で実施した。細胞は 37 °C で増殖し、培養液が OD600 ～ 0.6 に達したときに増殖が停止しました。次に、培養物を 1 mM IPTG で誘導し、18 °C で一晩インキュベートしました。細胞を3000 x gで10分間遠心分離し、ペレットを1× cOmplete EDTAフリープロテアーゼ阻害剤カクテル（Roche）を添加した緩衝液A（50 mM TrisHCl（pH 8.0）、150 mM NaCl、1 mM TCEP、10 mMイミダゾール）に再懸濁しました。）および細胞培養物 1 L あたり 250 U のベンゾナーゼヌクレアーゼ (Sigma)。以下の精製ステップはすべて 4 °C で実行されました。ホモジナイザーを使用して溶解を実行し、35,000 x gで60分間遠心分離して細胞破片を分離しました。次いで、上清を、緩衝液Aで予め平衡化したNi-NTA樹脂(Qiagen)とともに30分間インキュベートした。懸濁液を空の重力流カラム（BioRad）に移し、樹脂を10カラム容量の緩衝液Aで洗浄した後、300mMイミダゾールを補充した緩衝液Aで溶出した。溶出したタンパク質を、25 mM TrisHCl (pH 8)、500 mM NaCl、および 1 mM DTT に対して 4 °C で一晩透析しました。次にタンパク質を濃縮し、10 mM TrisHCl (pH 8)、100 mM NaCl、dParg および dTarg1-3 の場合は 0.2 mM TCEP、または 10 mM TrisHCl (pH 8) で平衡化した HiLoad 16/60 Superdex 75 カラムを使用してサイズ排除クロマトグラフィーに供しました。 dTarg1-3 および dHpf1 にはそれぞれ pH 8)、100 mM NaCl、0.1 mM TCEP。溶出されたdPargおよびdTarg1-3は8mg/mlに濃縮され、dHpf1は9mg/mlに濃縮された。タンパク質の品質は、SDS-PAGE によって各ステップで評価されました。他のすべてのタンパク質、hPARG62、hHPF115、hPARP1 野生型および E988Q 変異体 82、hARH1、hARH2、hARH383、およびヒストン H3/H484 は前述のように発現および精製しました。ヒストン H3 ペプチド (aa 1-21) は Sigma (米国ミズーリ州セントルイス) から購入しました。

ADPr は前述のように実行されました 25。簡単に説明すると、組換えタンパク質またはペプチドは、hPARP1 によって ADP リボシル化されて Glu-ADPr が生成されるか、または hPARP1:hHPF1 によって ADP リボシル化されて Ser-ADPr が生成されます。反応は、50 mM TrisHCl (pH 8)、100 mM NaCl、2 mM MgCl2、活性化 DNA、および 32P-NAD+ をスパイクした 50 μM NAD+ 中で実施しました。 hPARP1 反応は室温で 30 分間実行され、1 μM オラパリブの添加によって停止されました。 ADP リボシル化タンパク質を、連続する (ADP リボシル) ヒドロラーゼアッセイの基質として使用しました。基質を、示された（ADP-リボシル）ヒドロラーゼとともに室温で30分間インキュベートし、SDS-PAGEおよびオートラジオグラフィーによって分析した。反応あたりの hPARP1 および hHPF1 濃度は 0.5 μM、(ADP-リボシル)ヒドロラーゼは 1 μM、ヒストンテトラメア H3/H4 は 2 μM、ヒストンペプチドは 0.5 μg でした。

アッセイは以前に記載されているように実施されました58、59、60。簡単に言うと、合成モノ-Ser-ADPr H2B ペプチド 59 の濃度は、ADP-リボシル修飾のモル吸光係数 13,400 M-1 cm-1 で λ260nm の吸光度を使用して推定されました。 8 μM ペプチドを、アッセイ緩衝液（50 mM TrisHCl [pH 8]、200 mM NaCl、10 mM MgCl2、1 mM ジチオスレイトールおよび 0.2 μM ヒト NudT585）中で 1 μM の表示加水分解酵素と 30 ℃で 30 分間インキュベートすることにより脱修飾しました。反応を停止し、製造業者のプロトコールに従ってAMP-Glo™ アッセイ(Promega)を実行することにより分析した。発光をSpectraMax M5プレートリーダー(Molecular Devices)で記録し、データをGraphPad Prism 9.1で分析した。バックグラウンドサブトラクションについては、加水分解酵素の非存在下で反応を実施した。

より高い濃度の基質を使用したことを除いて、ヒストンH3ペプチドを上記のようにSer-ADP-リボシル化した。 Ser-ADP-リボシル化ペプチドは、10 kDaカットオフの濃縮カラム(Millipore)を使用して反応物を濾過することによってさらに精製した。過剰なNAD+は、G25スピンカラム(GE HealthCare、英国)を使用して除去した。

後生動物および原生動物種からの HPF1 配列のアライメント (補足データ 1) は、JalView v. 2.1186 を使用して生成され、HPF ドメインは、ドメイン境界を決定するための結晶学的データを使用する Mafft L-INS-i アライメント 87 に基づいて、それらの逐次的なコンテキストから抽出されました。抽出された配列は、Mafft L-INS-i アルゴリズムを使用して再アラインメントされました。 HPF ドメインの進化の歴史は、最尤法と、最大尤度法を適用してヒューリスティック検索用に自動的に取得された初期ツリーを使用して Le_Gascuel_2008 モデル 88 を使用して推定されました。分析は、部分削除オプションを使用して 95% のサイトカバレッジを使用して実行されました。信頼水準は、ブートストラップ法の 1000 サイクルを使用して推定されました。 MEGA1189では進化解析が行われた。

PARP および PARG シーケンスのアラインメント (補足表 1 および 3) は、実装された Mafft L-INS-i アルゴリズムを使用して JalView v. 2.11 を使用して生成されました。

結晶化試験は、150 nl で平衡化した MRC 2 ウェル結晶化マイクロプレート (Swissci) に 150 nl のタンパク質溶液を滴下し、Mosquito Crystal ロボット (TTP Labtech) を使用して蒸気拡散法を使用し、市販のスクリーンを使用して 4 °C で実施しました。貯水池。 dParg の結晶は、19% (w/v) PEG3350、210 mM 硫酸ナトリウム、0.1 M Bis-Tris プロパン (pH 7.2) 中で成長させました。阻害剤ＰＤＤ０００１７２７３と複合体を形成したｄＰａｒｇの結晶は、結晶化前にＰＤＤ０００１７２７３をタンパク質溶液に０．５ｍＭの濃度で添加したことを除いて、同じ条件で成長した。すべての結晶は、液体窒素に浸漬してガラス化する前に、母液中の 15% (v/v) グリセロール中で凍結保護されました。データ収集は、ダイヤモンド光源 (英国ハーウェルのラザフォードアップルトン研究所) のビームライン I04 および I24 で実行されました。

X 線データは Xia290 を使用して処理されました。 PHASER91 は、分子置換モデルとして hPARG (PDB: 6HMK) を用いた分子置換試験に使用されました。密度の変更は PARROT92 で実行され、初期モデルは自動モデル構築プログラム BUCCANEER93 を使用して構築されました。すべての構造のモデル構築は COOT94 で実行され、実空間リファインメントは REFMAC595 で実行され、自動生成された局所的非結晶学的対称拘束と TLS リファインメントが組み合わせられました。 dParg および dParg:PDD00017273 複合体の統計を補足表 2 に示します。

ショウジョウバエ S2R+ 細胞を 8 ウェル ibiTreat チャンバースライド (ibidi) にプレーティングし、製造者の指示に従って FugeneHD を使用してイメージングの 48 時間前にトランスフェクトしました。 405 nmでのレーザー照射前の細胞感作のために、チャンバースライドから増殖培地を吸引し、0.3 μg/mL Hoechst 33342を含む新鮮な培地と交換しました。イメージングの直前に、Hoechstを含む培地を新鮮な増殖培地と交換しました。生細胞顕微鏡検査は、横河電機 SoRa 超解像スピニングディスクヘッド、微小照射実験用の UPlanAop 60x/1.5 NA 油浸対物レンズ、UPlanXApo 100x/1.35 NA を備えたオリンパス IX-83 倒立顕微鏡で実施されました。タンパク質局在化実験と Prime BSI sCMOS カメラ用。 Hoechst と EGFP の蛍光はそれぞれ 405 nm と 488 nm の固体レーザーで励起され、蛍光検出は発蛍光団の発光スペクトルに適合したバンドパスフィルターで行われました。顕微鏡の落射蛍光バックボードに接続されたシングルポイントスキャニングヘッド（Olympus cellFRAP）を使用して、核を通る7μmの線に沿って405nmのレーザー顕微照射を250ms実行しました。再現性を確保するために、各実験の開始時に 405 nm でのレーザー出力を測定し、サンプルレベルで 110 μW に設定しました。時間経過実験では、画像を 2 秒ごとに収集しました。生細胞イメージング実験では、細胞を加熱チャンバーで 25 °C に維持しました。損傷部位におけるタンパク質の蓄積 (Ad) は次のように計算されました。

次いで、微小照射領域内の強度を、損傷誘発前の強度に対して正規化した。

タンパク質局在画像の場合、EGFP タグ付きタンパク質でトランスフェクトされたショウジョウバエ S2R+ 細胞を 1 μg/mL Hoechst 33342 を含む培地中で 30 分間インキュベートしました。イメージングの前に、Hoechst を含む培地を新鮮な増殖培地と交換しました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

研究に含まれる原子座標は、次のアクセッションコードでタンパク質データバンク (PDB) に寄託されています: apo dParg、8ADK [https://doi.org/10.2210/pdb8adk/pdb]。 dParg:PARGi コンプレックス、8ADJ [https://doi.org/10.2210/pdb8adj/pdb]。質量分析プロテオミクスデータは、データセット識別子 PXD036512 とともに PRIDE パートナーリポジトリ 96 経由で ProteomeXchange コンソーシアムに寄託されています。ブロットとゲルの完全な画像、およびグラフの生成に使用されるデータは、ソースデータファイルにあります。ソースデータはこのペーパーに付属しています。

この研究で生成されたすべての構成はリクエストに応じて利用可能であり、完了した材料転送契約により主任担当者によって履行されます。

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貴重な技術的アドバイスを提供してくれた Luca Palazzo 氏、原稿に対する批判的なコメントをくれた Andrea Mikoč 氏、ビームライン I04 および I24 (提案番号 mx12346 および mx18069) へのアクセスを提供してくれた Diamond Light Source に感謝します。また、専門家のアドバイスと共焦点顕微鏡へのアクセスを提供してくれた Alan Wainman と Dunn School Bioimages Facility に感謝します。 OSは、日本学術振興会（JSPS）の優秀な研究者の循環を加速する戦略的国際ネットワーク推進事業（S2802）の支援を受けました。 MLN の研究室での研究は、ノボノルディスク財団タンパク質研究センター、ノボノルディスク財団 (NNF14CC0001 および NNF13OC0006477)、デンマーク独立研究評議会 (0135-00096 A、2034-00311 A および 2032-00311 A) によって部分的に支援されました。およびデンマーク癌協会 (R325-A18824)。適用されたプロテオミクス技術は、助成契約EPIC-XS-823839に基づいて欧州連合のHorizon 2020研究革新プログラムから資金提供を受けたプロジェクトの一部であった。 IA の研究室での研究は Wellcome Trust (101794 および 210634) によって支援されました。バイオテクノロジーおよび生物科学研究評議会 (BB/R007195/1); 卵巣がん研究同盟 (813369); および英国癌研究 (C35050/A22284)。

マーシン・J・サスキウィッツ

現在の住所: 分子生物物理学センター、UPR4301 CNRS、rue Charles Sadron、CEDEX 2、F-45071、オルレアン、フランス

アントニオ・アリーザ

現在の住所: School of Biosciences, University of Sheffield, Western Bank, Sheffield, S10 2TN, UK

ヨハネス・グレゴール・マティアス・ラック

現在の住所: MRC Center for Medical Mycology, School of Biosciences, University of Exeter, Geoffrey Pope Building, Exeter, EX4 4QD, UK

これらの著者は同様に貢献しました: Pietro Fontana、Sara C. Buch-Larsen、Osamu Suyari。

サー・ウィリアム・ダン病理学院、オックスフォード大学、South Parks Road、オックスフォード、OX1 3RE、英国

ピエトロ・フォンタナ、須槍修、レベッカ・スミス、マーシン・J・サスキーヴィッツ、キラ・シュッツェンホーファー、アントニオ・アリーザ、ヨハネス・グレゴール・マティアス・ラック＆イヴァン・アヘル

米国マサチューセッツ州ボストン、ハーバード大学医学部生物化学および分子薬理学部門

ピーター・フォンタナ

細胞分子医学プログラム、ボストン小児病院、ボストン、マサチューセッツ州、米国

ピーター・フォンタナ

プロテオミクスプログラム、ノボノルディスク財団タンパク質研究センター、保健医療科学部、コペンハーゲン大学、Blegdamsvej 3B、2200、コペンハーゲン、デンマーク

サラ・C・ブッフ＝ラーセン & マイケル・L・ニールセン

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PF、SCB-L.、OS、MJS、JGMR、MLN、IA がこの研究を発案しました。 PF は生化学研究を設計し、実行しました。 SCB-L。質量分析データを取得して分析しました。 OS は細胞生物学実験と KS 細胞生物学サポート研究を実施しました。 RS は顕微鏡実験を実施しました。 PF、MJS、AA は結晶構造を解明しました。 JGMR が系統解析を実施し、データ解析と解釈をサポートし、PF、SCB-L.、OS、AA、JGMR、MLN、IA が全著者の協力を得て原稿を執筆しました。

アントニオ・アリーザ、ヨハネス・グレゴール・マティアス・ラック、マイケル・L・ニールセン、またはイヴァン・アヘルとの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Nature Communications は、この研究の査読に貢献してくれた Georges Mer と他の匿名の査読者に感謝します。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

Fontana, P.、Buch-Larsen, SC、Suyari, O. 他。ショウジョウバエにおけるセリン ADP リボシル化は、可逆的な ADP リボシル化シグナル伝達の進化についての洞察を提供します。 Nat Commun 14、3200 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41467-023-38793-y

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受信日: 2022 年 9 月 14 日

受理日: 2023 年 5 月 16 日

公開日: 2023 年 6 月 2 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-38793-y

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