トリプトファン - 株式会社コーストワイズ・ベンチャーズ・グループ

Scientific Reports volume 13、記事番号: 9403 (2023) この記事を引用

2 オルトメトリック

メトリクスの詳細

RS ウイルス (RSV) は、乳児や高齢者における重篤な、さらには致死的な急性下気道感染症の主な原因です。強力な RSV 中和は、ウイルス融合 (F) タンパク質の融合前形態に選択的に結合する抗体によって達成されています。我々は、F タンパク質を標的とするアプタマーを使用して同様の強力な中和を達成できるのではないかと仮説を立てました。アプタマーは、半減期が短く、標的とアプタマーの相互作用の範囲が限られているため、治療や診断における翻訳の可能性にはまだ達していません。しかし、これらの欠点は、ヌクレオチドを保持するアミノ酸様の側鎖を適用することで改善できます。この研究では、トリプトファン様側鎖を保持するオリゴヌクレオチドライブラリーを使用したアプタマー選択により、融合前 RSV F タンパク質の安定化バージョンが標的とされました。このプロセスにより、高い親和性で F タンパク質に結合し、融合前と融合後の立体構造を区別するアプタマーが生成されました。同定されたアプタマーは、肺上皮細胞のウイルス感染を阻害した。さらに、修飾ヌクレオチドの導入により、アプタマーの半減期が延長されました。私たちの結果は、アプタマーをウイルスの表面に標的化することで、継続的に進化する病原体に追いつくことができる効果的な薬剤候補を生み出す可能性があることを示唆しています。

呼吸器疾患は、幼児の罹患率と死亡率の主な原因です。呼吸器合胞体ウイルス（RSV）は、最も一般的な季節性呼吸器ウイルスで、通常、乳児に軽度の風邪のような症状を引き起こします1。しかし、重篤な気道疾患、特に細気管支炎、肺の小気道の炎症、肺炎を引き起こす可能性もあります2。 RSV 感染は、幼児以外にも、免疫不全の宿主や高齢者に重篤な疾患を引き起こす可能性があり、喘息の発症と関連しています 3。 RSウイルス感染症は、世界中の幼児の入院の主な原因であり、低所得国および中所得国では2番目に多い小児死亡の原因となっています4。

RSV は非常に伝染性の高い病原体であり、直接の身体的接触、飛沫、エアロゾル感染を介して、幼児の集団、家族内、入院患者間で広がります 5,6。新型コロナウイルス感染症（COVID-19）のパンデミックによる最近の制限措置は、呼吸器ウイルスの季節性感染パターンの混乱に貢献しています。これが免疫学的に未治療の人々の増加につながり、世界中でより重篤な RSV の流行を引き起こした可能性があります7。現在、RSV 感染を予防するために利用できる認可されたワクチンはありませんが、多くのワクチン候補が開発中です。唯一承認されている予防法は、F タンパク質に対するモノクローナル抗体です。

RSV は多形性エンベロープ RNA ウイルスです。 RSV ゲノムにコードされる 11 個のタンパク質のうち、3 個 (F、G、SH) が膜に固定されており、ウイルスの侵入に関与しています。 2 つの主要な表面露出糖タンパク質 G および F は、それぞれウイルスの付着と融合に重要です。低分子疎水性 (SH) タンパク質は、感染細胞を調節するイオンチャネル形成 (ビロポリン) に関与していることが示唆されています。ただし、正確な機能は完全には理解されていません8。 Fタンパク質は宿主細胞の感染に必須であり、タンパク質G9に比べて遺伝的多様性が低い。これらの特徴により、F タンパク質は治療介入の合理的な標的となります。タンパク質 F の立体構造は、膜の融合中に顕著な変化を受けます。つまり、タンパク質の融合前形態が融合後 F に変換されます。このプロセスは自発的に起こることもあり、融合前立体構造の準安定性を示します 10。プロテイン F に対して多数のヒト抗体が産生され、融合前 F 特異的抗原部位 Ø 結合変異体は強力なウイルス中和能力を有することが証明されています 11。ワクチン開発を支援するために、融合前タンパク質 F の安定化バージョンが構造ベースの設計によって作成されました 12。 RSV F のこの変異体は、極端な pH、浸透圧、温度にさらされた場合でも、抗原部位 Ø の利用可能性を維持しました。

200 を超えるウイルスが人間に感染する可能性があり、その多くはさまざまな病気の病原体として知られています 13。一部のウイルスは突然変異率が高いため、絶えず出現する新しいウイルス株の細胞侵入や複製を効果的にブロックできる新薬の開発が強く求められています。 RSV ワクチン開発の主なターゲットである F タンパク質は、比較的高い遺伝的安定性を特徴とし、予防耐性ウイルス株の出現をもたらすアミノ酸置換も報告されています 14。現在利用可能な抗ウイルス薬は、ウイルスの表面タンパク質または複製機構に特異的に結合する小分子が大半を占めています15。高分子治療薬に関しては、サイトメガロウイルス感染症の治療に使用され、最初に承認されたアンチセンス療法となるオリゴヌクレオチドベースの抗ウイルス薬が 1 種類しかありません 16。

アプタマーは、抗体と同様の親和性と特異性で標的分子に結合できる一本鎖オリゴヌクレオチドです。しかし、アプタマーの選択と合成は生物に依存しないため、生産の時間とコストの点で抗体よりも利点があります 17。ウイルス学者はまた、アプタマー科学の黎明期に、アプタマーの比較的迅速かつ簡単な選択プロセス、いわゆる SELEX の利点を認識しました。実際、最初に公開されたアプタマーは、選択の標的分子として T4 バクテリオファージ DNA ポリメラーゼを使用することによって生成されました 18。それ以来、ヒト病原体を標的とするアプタマーの幅広い配列が記載されている 19,20。公開されているウイルス特異的アプタマーの大部分は診断用途向けに作られ、バイオセンサーの開発に応用されていますが、抗ウイルスの可能性を秘めたアプタマーの例も数多くあります 21。最初の抗ウイルスアプタマーは、ヒト免疫不全ウイルス 1 型 (HIV-1) の複製を阻害するために、その逆転写酵素に対して作られました 22。逆転写酵素特異的 RNA オリゴヌクレオチドに続いて、ヒト病原体ウイルスのパネルに対するアプタマーの選択が行われました。これらの SELEX プロセスの標的分子は、組換えウイルスの表面タンパク質や複製タンパク質から、不活化ウイルスやウイルス様ナノ粒子、さらにはウイルス糖タンパク質を発現する哺乳類細胞まで多岐にわたりました 23、24、25、26。

核酸塩基の化学的多様性が限られているため、タンパク質と天然のオリゴヌクレオチド間の相互作用の可能性は制限されています 27。したがって、SELEX の効率を向上させ、一般的な環境および生理学的条件におけるアプタマーの耐久性を高めるために、一連の不自然な修飾がアプタマーに組み込まれています。修飾されたアプタマーを選択するために、非標準ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドライブラリーは、合成中に修飾ヌクレオチドを直接導入するか、「クリック可能な」ヌクレオチドの追加とクリックケミストリーによる合成後の官能化によって作成されています 27,28。ヌクレオチドの影響を受ける修飾成分に応じて、糖、ホスホジエステル骨格、および核酸塩基修飾アプタマーの 3 つの広範なカテゴリーを区別できます 29。応用されている多数の非天然オリゴヌクレオチドの中で、いわゆる SOMAmer (オフレートが遅い修飾アプタマー、デオキシウリジン 30 の 5 位の塩基修飾オリゴヌクレオチド) が最も有望な候補であることが証明されています。 SOMAmer の修飾ヌクレオチドは、核酸塩基の水素結合部位から離れた位置に疎水性または芳香族官能基を保持します。これらの修飾ヌクレオチドの導入により、SELEX の成功率が大幅に増加しました。さらに、SOMAmer のほとんどは、改善されたサブナノモルの KD 値を示します 30。

以前に、我々は不活化ウイルス粒子を使用してアプタマーを選択し、得られたアプタマーがRSVのプロテインGに特異的に結合し、臨床関連サンプルでのウイルス検出に適用できることを実証しました31。この研究では、異なる選択理論的根拠を適用することにより、治療の可能性のあるアプタマーを生成することに着手しました。ウイルス全体を提供する標的分子は、選択ステップ中に融合前タンパク質 F の安定化バージョンに置き換えられ、TAdUTP を保持するトリプトファン様側鎖が SELEX のオリゴヌクレオチドライブラリーに導入されました。選択プロセスにより、ナノモルの解離速度で標的タンパク質に結合できるアプタマーが得られました。さらに、これらのアプタマーは、プロテイン F の融合前変異体と融合後変異体を区別することができました。さらに、最良のアプタマーは、パリビズマブと同様の有効性で RSV 感染を阻害することが判明しました。

RSV 感染が融合前 F 特異的抗原部位 Ø 結合抗体によって予防できることを考慮して、同様の効果が融合前 F タンパク質選択的アプタマーによって達成できるのではないかと仮説を立てました。 RSVに対する治療可能性のあるアプタマーを作製するために、本発明者らは、融合前および融合後タンパク質Fの安定化バージョンを、それぞれSELEXの標的およびカウンター標的として利用した。選択の有効性を高めるために、以前に詳述したように、開始オリゴヌクレオチドライブラリーを有する 5-インドリル-AA-dUTP (TAdUTP) を作成しました 32。 7 つの SELEX サイクルの濃縮オリゴヌクレオチドプールを、エマルジョン PCR および dTTP を TAdUTP に置き換えることによって増幅しました。選択圧力は、バッファーに競合分子（L-トリプトファン、ムチン、BSA、サケ精子DNAなど）を添加し、連続するSELEXサイクルでの標的分子濃度とインキュベーション時間を減少させることによって確保されました。さらに、融合前立体構造選択性のアプタマーを有利にするために、ビーズに固定化された融合後 F タンパク質をオリゴヌクレオチドプールにチャレンジすることによって逆選択ステップが導入されました (図 1)。最終選択工程の完了後、96個のアプタマー候補の塩基配列が決定された。得られた配列のコンピューター解析により、10 個のアプタマーが複数のコピーで存在することが明らかになり、潜在的な RSV 選択的修飾アプタマーが豊富に存在することが示唆されました。 MEME モチーフ検索ではコンセンサス配列は特定されませんでしたが、選択されたすべてのアプタマー候補において、シチジンおよびアデニンと比較して修飾ヌクレオチドおよびグアノシンが過剰に存在しました (図 S1)。この発見は、アプタマーとプロテインFの複合体形成において修飾ヌクレオチドが必要であることを示唆している。

RSV Fタンパク質の選択的アプタマーの生成と特性評価の概略図。 BioRender.com で作成されました。

理論的には、標的分子に結合するオリゴヌクレオチドは、SELEX の連続サイクルで濃縮されます。実際には、PCR バイアスは増幅されたオリゴヌクレオチドに対して選択圧力ももたらします。したがって、単離されたアプタマー候補は、必ずしも標的分子に対して高い親和性を有するわけではありません17。 MEME分析では、最も縁起の良いアプタマー候補を示唆する可能性のある、選択されたオリゴヌクレオチドの共通モチーフは特定されませんでした。したがって、我々は、増幅発光近接均一アッセイ (ALPHA) によって、配列決定されたすべてのオリゴヌクレオチドをスクリーニングすることに着手しました。

この目的を達成するために、プライマーブロック非対称 PCR (PBA-PCR33) によってビオチン標識アプタマー候補を合成し、それらを融合前型の F タンパク質とパリビズマブ、および融合前と融合後の両方の型の F タンパク質に結合する抗体と混合しました。ビオチン化アプタマーと抗体は、それぞれストレプトアビジンでコーティングされたドナーとプロテイン A でコーティングされたアクセプター AlphaScreen ビーズに固定化されました。 70 個のアプタマーのうち、ほぼすべてが標的分子への結合を示し、14 個のアプタマーは、F タンパク質と抗体を除いたコントロールの両方と比較して、融合前形態の F タンパク質に結合すると 10 ～ 50 倍高い蛍光シグナルを生成しました (図 S2)。測定された蛍光強度の上昇は、アプタマー選択の成功を示しました。注目すべきことに、いくつかのアプタマー候補はほぼ同一のヌクレオチド組成を持っていましたが（補足データファイルを参照）、それらは F タンパク質に対して異なる親和性を示しました。これらのデータとオリゴヌクレオチドの共通モチーフの欠如は、F タンパク質とアプタマーの相互作用には固有の核酸配列が避けられないことを示唆しています。

次に、優れた 14 個のアプタマーのプロテイン F 立体構造識別能力を研究しました。我々は、上記の実験設定を適用して、アプタマーを融合前または融合後Fタンパク質のいずれかと異なる濃度で混合しました。分析されたすべてのアプタマーは、約 1 つのアプタマーを生成しました。融合前形態と混合した場合（図 2）、プロテイン F の融合後形態とインキュベートした場合よりも 2 倍高い相対蛍光シグナル。

AlphaScreenによるRSVの融合前Fタンパク質と融合後Fタンパク質を区別する修飾アプタマーの能力の判定。ビオチン標識アプタマーを、F タンパク質およびパリビズマブの融合前または融合後のいずれかと混合しました。相対的な AlphaScreen シグナルは、サンプルの蛍光とアプタマーを含まないバックグラウンド蛍光の比を形成することによって計算されました。値の増加は、アプタマーがさまざまな F タンパク質の形態に選択的に結合していることを示します。エラーバーは、3 つの技術的反復の標準偏差を表します。

アプタマー-タンパク質複合体形成の結合速度論を分析するために、溶液中の生体分子間の相互作用の分析に一般的に利用される方法であるマイクロスケール熱泳動（MST）を適用しました。 MST 実験では、小さい方の蛍光標識分子の濃度を一定に保ち、大きい方の標識されていない相互作用パートナーの段階希釈物を混合物に添加しました。

得られたデータは、異なるアプタマー - プロテイン F 複合体の KD 値のばらつきを示しました。アプタマーの一部は低いμM 解離定数 (B1、C2、F5、G6、および H8) で標的に結合しましたが、それらの大部分はサブ μM 値を示し、最も著名な候補は、次のようなアプタマー-融合前タンパク質 F 複合体を形成しました。 100 nM の解離定数はほとんどありません (A2、D4、H9)。注目すべきことに、研究されたすべてのアプタマーは、標的タンパク質の融合後形態よりも融合前形態に対してはるかに強い親和性を示し、SELEXの対抗選択ステップの効率を示唆しています（表S1）。

AlphaScreen 測定と MST 測定の結果が完全に調和していないこと、つまりアプタマーを生成する最高の AlphaScreen シグナルが常に最低の KD 値を有していないことは矛盾しているように思えるかもしれません。ただし、この現象は完全に予想外だったわけではなく、2 つの相互作用を特徴付ける方法の固有の違いによって説明できる可能性があります。 AlphaScreen は相互作用パートナーの固定化を必要としますが、MST は自由溶液中の 2 つのパートナー間の相互作用を決定します。

最も有望なアプタマー候補 (A2、B1、D4、G6、H8、H9) の特異性を実証するために、我々は、さまざまなヒト病原体ウイルスタンパク質、すなわちヒトメタニューモウイルス融合タンパク質 (MPV、バリアント) との推定上の相互作用の測定に着手しました。 v3B)34、ヒトパラインフルエンザウイルス 3 型融合タンパク質 (PIV3、Q162C-L168C、I213C-G230C、A463V、I474Y 変異体)35、SARS-CoV-2 スパイクタンパク質 (S-2P 変異体)36、インフルエンザ H1 血球凝集素タンパク質 (S106) MST を使用する DS26r)37。収集されたデータ (図 S3、表 S2) は、アプタマーの選択性を示しました。注目すべきことに、SARS-CoV-2スパイクタンパク質と我々の標的タンパク質はアミノ酸配列相同性が低いにもかかわらず、A2アプタマーはナノモル解離定数でスパイクタンパク質にも結合した。このアプタマーが SARS-CoV-2 の感染力を弱めることができるかどうかをテストするのは興味深いでしょう。

アプタマーの適用は、遍在するヌクレアーゼによって頻繁に妨げられます。したがって、我々は肺上皮細胞株を用いてアプタマーを保持する修飾ヌクレオチドの耐久性を評価しました。 A549細胞をD4アプタマー、またはTAdUTPがdUTPに置き換えられたその変異体とともにインキュベートし、オリゴヌクレオチドの濃度をリアルタイムPCRによって測定しました（図3）。オリゴヌクレオチドの相対量を計算すると、修飾された D4 アプタマーの安定性が向上していることが明らかに示されました。修飾されたアプタマーの約 3 分の 1 は 24 時間のインキュベーション後でも存在していましたが、オリゴヌクレオチドを欠く TAdUTP の場合には元の濃度のわずか数パーセントしか検出できませんでした。 2 つのオリゴヌクレオチドの計算された半減期も、観察された安定性の違いを裏付けました。すなわち、元の修飾アプタマー濃度の半分に達するまでに 12.7 時間を要した。これは、修飾されていないヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドで見られたものよりもおよそ 8 倍長い時間でした。これらのデータは、TAdUTP を含むアプタマーが肺上皮細胞培養の一般的な条件に長時間耐えることができることを示唆しています。

修飾アプタマーと非修飾アプタマーの安定性は、A549 細胞をアプタマー注入増殖培地とインキュベートすることによって実証されました。オリゴヌクレオチド濃度は、示された時点でリアルタイム PCR によって測定されました。アプタマーの分解は著しく異なり、修飾されたアプタマーは約 100 分の 1 の分解能を持っているようです。非修飾変異体と比較して半減期が 8 倍長い。エラーバーは、3 回の個別の実験の標準偏差を表します (N = 3)。

選択されたアプタマーの in vitro 特性評価に続いて、我々はそれらのウイルス感染阻害能力の研究に着手しました。組換え緑色蛍光タンパク質（GFP）発現 RSV（rgRSV）は、RSV の全長ゲノムよりも先に GFP 遺伝子を保有しているため、ウイルスに曝露された細胞の蛍光を測定することで感染を簡単に追跡できます 38。まず、最適な実験条件を決定するために、A549 細胞の単層を緑色蛍光タンパク質 (rgRSV) を発現する組換え RSV に感染させ、蛍光強度を 72 時間測定しました。得られたデータは、信号が 48 時間でピークに達したことを示しました。したがって、このインキュベーション時間は次の実験に適用されました (図 S4)。これらの処理条件では、修飾されていないアプタマーとは対照的に、修飾されたアプタマーは比較的無傷のままでした（図３）。

次に、ウイルス阻害研究用に 6 つのアプタマーを選択しました。そのうちの 2 つ、D4 と H9 は、AlphaScreen 測定と MST 測定の両方で最高のパフォーマンスを示しました。 AlphaScreen と MST の調査によれば、A2 と G6 はそれぞれ傑出していました。 B1 と H8 は、以前に分析された 14 個のアプタマーからランダムに選択されました (図 S6)。 RgRSV をパリビズマブまたはアプタマーのいずれかとプレインキュベートし、A549 細胞に添加しました。 rgRSV を除去し、細胞を洗浄した後、ウイルス感染細胞が生成した蛍光シグナルを 48 時間測定しました。パリビズマブおよび修飾アプタマーをプレインキュベートしたサンプルは両方とも、パリビズマブおよびアプタマーを含まない対照サンプルと比較して、蛍光シグナルの大幅な減少を示した。重要なことに、アプタマーを保持する非関連または非修飾ヌクレオチド（表S3）プレインキュベートしたrgRSV混合物は、抗体またはアプタマーを含まないコントロールと同様の蛍光強度を生成しました（図4A）。アプタマーの抗ウイルス効果をより適切に評価するために、得られた増殖曲線から曲線下面積（AUC）を計算したところ、パリビズマブまたはアプタマーでプレインキュベートしたrgRSVのいずれかで細胞を処理すると、感染が少なくとも50％減少することが示唆されました（図1）。 4B）。ウイルス感染の減少に関するさらなる証拠を提供するために、我々は非常に異なる方法論的アプローチ、すなわち、rt-qPCRによるウイルスRNA量の測定を適用した。アプタマーの存在下では、ウイルス RNA 濃度の減少は GFP レベルの減少ほど顕著ではありませんでしたが、rt-qPCR によって提供されたデータは AUC 計算と一致しており、したがって RSV 感染に対するアプタマーの阻害効果が裏付けられました (図 4C)。

修飾されたアプタマーは、RSV 感染に対して抗ウイルス効果を示します。 rgRSVに感染したA549細胞培養物の全蛍光(TF)を測定した(MOIは1)。パリビズマブまたはアプタマー (A2、B1、D4、G6、H8、H9、非修飾および非関連アプタマー) は、感染前に rgRSV とプレインキュベートされました。 (A) rgRSV を修飾アプタマーまたはパリビズマブで前処理した場合、モック処理した RSV による感染と比較して、より低い TF が測定されます。修飾されていないアプタマーまたは関連性のないアプタマーは、ウイルスの中和に対してわずかな効果しかありませんでした。 (B) 曲線下面積 (AUC) を計算しました。3 回の反復の平均値と標準偏差が示されています。 (C) 感染した A549 細胞におけるウイルス RNA の Rt-qPCR (感染後 48 時間で実行) は、修飾アプタマーの抗ウイルス効果を検証します (D、G)。最も有望なアプタマー候補である D4 および H9 は、最も高いウイルス中和能力を示します。 (E、H) モック処理した rgRSV コントロールと比較した阻害率 (AUC から計算)。 RgRSV 感染は、パリビズマブと D4 または H9 によって、非常によく似た濃度依存的な方法で減少します。エラーバーは 3 回の個別の実験 (N = 3) の標準偏差を示し、破線は 50% 阻害を示します。 (F、I) 感染した A549 細胞で検出されるウイルスゲノムの量の減少も、修飾アプタマーの抗ウイルス効果を意味します。 P 値は、「RSV のみ」グループを他のグループと比較することにより、対応のない t 検定を使用して計算されました (*P < 0.05、**P < 0.005、***P < 0.001、****P < 0.0001、ns) = 重要ではありません)。

当社の SELEX プロトコールにより、nM 濃度で RSV 感染を効果的に制限できる修飾アプタマーが得られることを実証した後、当社は優れたアプタマーのさらなる研究に着手しました。用量反応アッセイは、ALPHA と MST (D4 および H9) の両方で同等に良好に機能する一連の濃度のアプタマーを使用して実行されました。修飾アプタマーとともにプレインキュベートされたサンプルにおけるrgRSVの増殖曲線の用量依存的な減少は、D4およびH9の両方がrgRSV感染に対して効率的に保護することを示した。両方のアプタマーの半最大阻害濃度 (IC50) 値は、パリビズマブの値と同等でした。それらは低ナノモル範囲にありました(図4D、E、FおよびG、H、I)。他の 4 つのアプタマーと、D4 および H9 の非修飾バージョンの用量反応も研究されました (図 S7)。興味深いことに、AlphaScreen で最も高いシグナルを生成しましたが、MST 測定によれば親和性が低かった G6 アプタマーも、パリビズマブと同様のウイルス中和特性を示しました。

最後に、RSV 感染の最も顕著な細胞病理学的影響を考慮して、A549 細胞の合胞体形成を調べました。 rgRSV をパリビズマブまたは D4 アプタマーおよび H9 アプタマーとプレインキュベートしたウェルではシンシチウム形成が同様に減少したため、光学顕微鏡および蛍光顕微鏡観察でも上記の所見が確認されました (図 S8)。まとめると、選択されたアプタマーの RSV 阻害効果は、明らかに異なるアプローチで実証されています。

アプタマーの治療可能性を考慮して、修飾されたアプタマーの推定細胞毒性の試験に着手しました。 A549細胞を、10nM濃度の様々な修飾、非修飾アプタマーおよびパリビズマブとともに48時間インキュベートし、それらの生存率をレザズリンベースのアプローチによって評価した。蛍光測定により、パリビズマブもアプタマーも細胞生存率に対して検出可能な影響を及ぼさないことが示された（図５Ａ）。 50% 細胞毒性濃度 (CC50) を決定するために、A549 細胞を、最も有望なアプタマー候補の 1 つ (D4) と関連しないアプタマーの希釈範囲で処理しました。得られたデータによると、適用した最高濃度の 50 nM 濃度でも、有意な生存率の変化は検出されませんでした (図 5B)。これらの結果は、細胞毒性が修飾アプタマーの治療応用を妨げるものではないと予想されることを示している。

(A) アプタマーおよびパリビズマブで処理した A549 細胞の生存率。細胞を10 nMのアプタマーまたはパリビズマブとともに48時間インキュベートし、その後、それらの生存率を評価しました。パリビズマブもアプタマーも、48 時間後の細胞生存率に重大な悪影響はありませんでした。 (B) A549 細胞の生存率に対する、最も有望な修飾アプタマー候補の 1 つと無関係なアプタマーの用量依存的効果。細胞を50、25、および10 nMの修飾アプタマーまたは非関連アプタマーとともに48時間インキュベートし、その後、それらの生存率を評価しました。修飾されたアプタマーも非関連アプタマーも、48 時間後の細胞生存率に悪影響を及ぼしませんでした。エラーバーは、3 回の個別の実験の標準偏差を示します (N = 3)。

一連のウイルス選択的アプタマーが生成されているが、修飾されたヌクレオチドを保持しているのはそのうちの少数のみであり、潜在的な薬剤候補としてテストされたのはそのうちの 2 つだけです。どちらも RNA アプタマーであり、ヌクレアーゼ耐性を高めるために 2'-ヒドロキシル、-フルオロ、-メチル修飾が適用されています。これらのアプタマーのさらに共通の特徴は、どちらも C 型肝炎ウイルスと日本脳炎ウイルスの特定の内部 (未曝露) 酵素、つまりそれぞれ NS5B レプリカーゼとメチルトランスフェラーゼを標的とすることです 19,39。表面に露出しておらず、細胞内でのみ発現されるタンパク質を標的とする結果として、ウイルス複製をブロックするためにアプタマーが細胞内に取り込まれることが必要となる。実際、これらのアプタマーは、リポフェクタミンベースのトランスフェクションまたはコレステロール結合によって細胞内に導入されました。

私たちは、ウイルス表面タンパク質結合アプタマーの治療への応用がより直接的であり、より効果的である可能性があると考えています。したがって、融合前 F タンパク質の安定化変異体が SELEX の標的として利用されました。生理学的条件下でのアプタマーの選択の成功率と耐久性を高めるために、トリプトファン様側鎖を持つ塩基修飾 DNA オリゴヌクレオチドライブラリーを SELEX 手順の各ステップで使用しました。さらに、最も効果的な RSV 中和抗体は融合前 F 特異的抗原部位に結合することが知られていることから、融合後形態のプロテイン F を、選択の結合段階内の競合物質として、または逆選択ステップの固定化ターゲットとして使用しました。修飾ヌクレオチドと厳格なカウンター選択の適用により、融合後形態の F タンパク質よりも融合前形態に有利なアプタマーが得られ、ウイルス感染阻害能力が強化されることが期待されます。興味深いことに、修飾ヌクレオチドは研究したすべてのアプタマーに豊富に含まれており、アプタマー-タンパク質複合体形成において疎水性を与えるインドリル基の重要性を示唆しています。おそらく、修飾されたヌクレオチドにより、アプタマーと融合前 F 特異的抗原部位 Ø の疎水性アミノ酸ストレッチとの間の相互作用が可能になったと考えられます。

サンガー配列決定およびＳＥＬＥＸで得られたオリゴヌクレオチドのインシリコ分析により、シングルトンのパネルおよび３コピー存在する核酸配列が同定されたが、オリゴヌクレオチドの共通モチーフは同定できなかった。コンピューター解析では、最も有望なアプタマー候補の同定に役立つ明白なデータが得られなかったため、同定されたすべてのオリゴヌクレオチドをインビトロ法で検査した。一般的に利用されている 2 つの均一アッセイ、ALPHA と MST が、それぞれオリゴヌクレオチドのスクリーニングと親和性測定に適用されました。 2 つのアプローチでは、部分的に矛盾した結果が得られました。つまり、ALPHA 測定の最も優れたパフォーマンスは、最も低い KD を有するアプタマーと同一ではありませんでした。ただし、この現象は前例のないものではありません。さまざまな方法が、まったく同じ分子相互作用に対して異なる結果をもたらす可能性があることが記載されています40。これらの結果は、主要なアプタマー候補の同定にさまざまな方法を適用することの重要性を強調しています。

選択されたオリゴヌクレオチドの in vitro スクリーニングと特性評価はアプタマー生成の重要なステップですが、これらのアプローチによって提供されるデータは慎重に取り扱う必要があります。 6 つのアプタマーのウイルス阻害能力の分析により、アプタマーのウイルス感染阻止能力が AlphaScreen または MST データに必ずしも比例しないことが実証されました。ウイルス感染によって生成された蛍光によると、研究されたすべてのアプタマーは同等の効率でウイルス感染を防止します。これらのデータは、ウイルスゲノム定量化 RT-qPCR 測定によっても裏付けられました。ただし、サンプル間の違いはそれほど明らかではありませんでした。

アプタマー処理サンプルと未処理サンプルにおけるウイルス RNA レベルのこのどういうわけか予想外のわずかな差は、示された実験の長いインキュベーション時間によって説明できる可能性があります。子孫ウイルスの放出は感染後 10 ～ 12 時間で始まり、24 時間でピークに達し、30 ～ 48 時間までに細胞が劣化するまで持続します41。提示された実験では、ウイルスは 1.5 時間のインキュベーション後に洗い流されました。したがって、最初に感染したウイルスの子孫は、アプタマーが存在しない場合でも細胞に侵入する可能性があります。したがって、48 時間のサンプルから生成された RT-qPCR データは、最大 4 つの複製サイクルから得られるウイルス数を示します。一方、GFP でトランスフェクトされた細胞は、長期間のインキュベーション時間の予想される結果であるアポトーシスと壊死の際に蛍光強度が減少することが示されています 42。細胞培養物にアプタマーを補充した場合に二次感染を抑制できるかどうかを確認することは有益です。

実施された用量反応アッセイは、当社のアプタマーの低ナノモル半最大阻害濃度値がパリビズマブの値に匹敵することを実証しました。これらのデータは、治療への応用を妨げる可能性のあるアプタマーの特性を研究することを私たちに促しました。ホスホロチオエートおよび 2' フルオロ修飾ヌクレオチドで構成されたオリゴヌクレオチドは、p53 経路を誘発することによって細胞死を引き起こす可能性があることが記載されています 43,44。我々の分析では、IC50 オリゴヌクレオチド濃度の 10 倍で 48 時間インキュベートした後でも、アプタマーの細胞毒性は示されませんでした。アポトーシス経路の活性化については研究しませんでしたが、これらの結果は、TAdUTP 修飾オリゴヌクレオチドが細胞に悪影響を及ぼさないことを示しています。

アプタマーの臨床応用のさらなるボトルネックは、そのヌクレアーゼ感受性である。ピリミジンヌクレオチドの 5 位に疎水性修飾を組み込むと、ヒト血漿中での分解に対する耐性が大幅に増加することが以前に報告されています 45。私たちの結果はこれらの調査結果と一致しています。 dUTP の 5 位にインドリル基を導入すると、肺上皮細胞培養におけるオリゴヌクレオチドの半減期が約 8 倍長くなりました。注目すべきことに、私たちが研究したオリゴヌクレオチドはエキソヌクレアーゼに対して保護されていませんでした。したがって、逆向きヌクレオチドの付加などの単純な 3' キャッピングは、TAdUTP 修飾アプタマーの安定性をさらに高めることが期待されます。

我々は、提示された結果は、修飾アプタマーを標的とするウイルス表面タンパク質が効率的で費用対効果の高い薬剤候補を生み出す可能性があり、継続的に進化する病原性ウイルスに追いつくことができることを証明していると信じている。

修飾ヌクレオチド、5-[(3-インドリル)プロピオンアミド-N-アリル]-2'-デオキシウリジン-5'-三リン酸 (TAdUTP) および CleanAmp dATP、dCTP、および dGTP は TriLink から購入しました。トリプタアミノ修飾ライブラリーを生成するために、1 × KOD XL 反応バッファー、0.2 mM dNTP 混合物 (それぞれ 2.5 mM 濃度の dATP、dCTP、dCTP、TAdUTP を含む)、2.5 KOD XLのU、プライマーおよびテンプレートの最終濃度はそれぞれ40μMおよび200nM。 PCR混合物を製造業者のプロトコール(Micellula DNA Emulsion & Purification Kit (Roboklon))に従って乳化した。製造業者のプロトコールに従って、OligoClean & Concentrator Kit (ZymoResearch) を使用して、エマルジョンからの PCR 産物を回収しました。適用されたプライマーとオリゴヌクレオチドは IBA によって合成されました。詳細な配列は表 S1 にあります。増幅条件は、95℃で3分間の変性、95℃で30秒間、60℃で5秒間、72℃で30秒間の7サイクル、および72℃で3分間の最終伸長でした。 PCR産物を10%ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析し、1μLのGeneRuler Low Range DNA Ladderを分子量マーカーとして使用しました。

三量体 RSV F の融合前 (DS-Cav1) および融合後の形態は両方とも一過性トランスフェクションによって生成され、以前に記載されているように従来のクロマトグラフィーによって精製されました 10。どちらの場合も、最終的なサイズ排除クロマトグラフィーステップを利用して、F タンパク質の三量体の均一性を確保しました。

RSV F タンパク質選択的アプタマーの生成に適用される SELEX 条件は、MAPS ガイドラインに従って補足データファイルに記載されています 46。つまり、安定化された融合前Fタンパク質(「DS-Cav1」)および融合後Fタンパク質が、それぞれSELEXの標的および陰性標的として使用された。 MACSflex™ MicroBead starting Kit (Miltenyi Biotec) のビーズ 5.7 mg を 257 μl の再構成バッファーで再構成しました。このビーズは、25μlのMESバッファー中の15μgの融合前または融合後Fタンパク質を使用して、4℃でO/Nインキュベーションにより修飾されました。固定化の成功は、SDS-PAGE およびクーマシーブルー染色を使用して判定されました。

生成されたトリプトファン様側鎖保持アプタマーライブラリを使用して、アプタマー選択を実行し、RSV F タンパク質選択的アプタマーを生成しました。 RSV F 特異的修飾アプタマーの SELEX は、選択圧力を増加させながら 7 回の反復サイクルによって得られました。修飾されたオリゴヌクレオチドライブラリーを 95 °C で 5 分間加熱し、すぐに氷上で冷却しました。まず、約。 1 nmole のオリゴヌクレオチドライブラリを、選択バッファー (10 mg/L BSA、0.02% Tween 20、1 mg/L サケ精子 DNA、10 mg/L ムチンを含む PBS) 中で非修飾ミルテニービーズとともに、穏やかな溶媒を使用して 60 分間インキュベートしました。振盪してビーズおよびムチン結合オリゴヌクレオチドを排除する。 Fタンパク質修飾ビーズを前のステップの上清とともに30分間インキュベートし、その後2×1000μl PBSで洗浄し、続いてアルカリ溶出を使用してDNAプールを単離し、プロテインF結合オリゴヌクレオチドを中和した。ミセルラ DNA エマルジョン & 精製キット (Roboklon) を使用して、油中水型エマルジョン PCR を実行して結合配列を増幅しました。 PCR 混合物には、KOD XL 1 × 反応バッファー、0.025 U/μl の KOD XL ポリメラーゼ (東洋紡)、0.4 ～ 0.4 μM の L8 ライブラリーのタグなしフォワードおよびビオチン化リバースプライマー、および TAdUTP と混合した各 0.1 mM CleanAmp dATP、dGTP、dCTP が含まれていました。 50μlで。製造業者のプロトコールに従って、OligoClean & Concentrator Kit (ZymoResearch) を使用して、エマルジョンからの PCR 産物を回収しました。増幅条件は、94℃で3分間、94℃で30秒間、60℃で5秒間、74℃で30秒間、および最後のサイクル後に74℃で5分間を25サイクルであった。増幅の成功は、10% ポリアクリルアミドゲル電気泳動および GelGreen DNA 色素 (Biotium) による染色によってモニターされました。

アルカリ変性による ssDNA の再生のために、PCR 産物を 25 μl のストレプトアビジンでコーティングされた常磁性ビーズ (Dynabeads Streptavidin、M-280、Thermo Scientific) に 15 分間結合させ、3 × 1000 μl の PBS で洗浄しました。非ビオチン化鎖を、50μlの新鮮な20mM NaOHと10分間インキュベートすることにより、固定化された相補鎖から分離した。溶出されたssDNAは、7.5μlの200mM NaH2PO4を添加することにより直ちに中和された。次の選択ラウンドでは、融合後形態の F タンパク質をカウンターターゲット分子として常磁性ビーズに結合して使用するか (ラウンド番号 4、6、および 7)、選択バッファーに過剰の融合後 F を補充しました。 (ラウンド 2、3、5、および 7 では、融合前フォームの 5 ～ 10 倍を超えます)。選択圧力をさらに高めるために、インキュベーション条件と洗浄ステップを変更しました。ラウンド 4、5、6、7 では、インキュベーション時間はそれぞれ 25、20、および 15 分に短縮されました。第 3 ラウンドでは、PBS (pH 7.4) 中の 1 ml の 0.15 mM デキストラン硫酸を用いた追加の洗浄ステップも導入しました。第 4 ラウンドでは、1 ml の 18 μM L-トリプトファンでビーズを洗浄することによって結合配列をチャレンジしました。解決策も。最終選択ラウンドでは、インキュベーション時間は15分であり、ビーズを1mlの0.3mMデキストラン硫酸溶液で2回、1mlの18μM L-トリプトファン溶液で2回、そしてPBS溶液で2回洗浄した。最後の選択ステップの PCR 産物をクローニングベクター (Zero Blunt TOPO PCR クローニングキット、Thermo Fischer Scientific) に挿入し、One Shot™ TOP10 Chemically Competent E. coli 細胞 (Invitrogen) に形質転換しました。コロニーのうち 130 個を、DNA HT 5 K LabChip シングルシッパーチップを備えた DNA 1 K 試薬キットを使用したコロニー PCR (M13 プライマーセットを使用、表 S1) およびキャピラリー電気泳動 (LabChip GX、PerkinElmer) によって分析しました。後者の場合、コロニー PCR 産物を TE バッファーで 40 倍に希釈しました。正しいサイズのコロニー PCR 産物の配列は、サンガー配列決定によって決定されました。

AlphaScreen には、PBA-PCR (プライマーブロック非対称 PCR) によって生成されたビオチン化アプタマーが必要です。 25 μl PCR 混合物には、KOD XL 1 × 反応バッファー、0.025 U/μl の KOD XL ポリメラーゼ、0.5 μM のビオチン化フォワードプライマー、25 nM タグなしリバースプライマー、475 nM 3'-P リバースプライマー、各 0.2 mM CleanAmp dATP、 TAdUTP と混合した dGTP、dCTP、40 倍希釈コロニー PCR テンプレート 0.5 μl。増幅条件は、94℃で3分間、94℃で30秒間、60℃で5秒間、74℃で30秒間、および最後のサイクル後に74℃で5分間を45サイクルであった。 PCR後、リバースプライマーの相補体を5μM濃度で添加し、混合物を95℃で10分間加熱した。

Cy5 標識修飾アプタマーおよび非修飾アプタマーは、MST およびウイルス中和アッセイ用に生成されました。修飾アプタマーの場合、50 μl PCR 混合物には、KOD XL 1 × 反応バッファー、2 U の KOD XL ポリメラーゼ、1 μM の Cy5 標識フォワードプライマーおよびビオチン標識リバースプライマー、各 0.2 mM CleanAmp dATP、dGTP、dCTP 混合物が含まれていました。 TAdUTP、40 倍に希釈したコロニー PCR テンプレート 0.5 μl を使用。非修飾アプタマーの場合、dATP、dGTP、dCTP、およびdUTPを含むdUTPミックス(Bioline)を反応の基質として使用した。増幅条件は、94℃で3分間、94℃で30秒間、60℃で5秒間、74℃で30秒間、および最後のサイクル後に74℃で5分間を30サイクルであった。一本鎖 DNA は、「RSV F タンパク質選択的修飾アプタマーの選択」に記載されているように、アルカリ変性を使用して再生されました。

増幅の成功は、10% ポリアクリルアミドゲル電気泳動および GelGreen DNA 色素による染色によってモニターされました。

相互作用アッセイは、白色の３８４ウェルＯｐｔｉｐｌａｔｅｓ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用し、総容量１８μｌで、プロテインＡアクセプターおよびストレプトアビジンドナービーズ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して実施した。ムチン (10 mg/L)、BSA (1 mg/ml)、およびサケ精子 DNA (1 mg/L) を補充した PBS 中のさまざまな量の融合前および融合後形態の RSV F タンパク質を、最終濃度 10 nM の修飾ビオチン化アプタマーおよびプロテイン F 選択的抗体 (パリビズマブ、AstraZeneca)。室温で２０分間インキュベートした後、アクセプタービーズとドナービーズを２段階で最終濃度２０ｍｇ／Ｌで添加した。まず、プロテイン A アクセプタービーズを添加して室温で 30 分間インキュベートし、続いてストレプトアビジンドナービーズを添加してさらに 30 分間インキュベートしました。蛍光シグナルは、EnSpireマルチラベルプレートリーダー(PerkinElmer)を使用して検出した。

10、15、または20 nMのCy5標識アプタマーを、タンパク質（ヒトメタニューモウイルス融合タンパク質（MPV、変異型v3B）、ヒトパラインフルエンザウイルス3型融合タンパク質（PIV3、Q162C-））の16倍、1：1段階希釈液と混合しました。 L168C、I213C-G230C、A463V、I474Y バリアント）、SARS-CoV-2 スパイクタンパク質（S-2P バリアント）、インフルエンザ H1 血球凝集素タンパク質（S106 DS26r）すべての混合物は PBS 中の 0.05% Tween 20 で調製され、測定はMonolith NT™ Standard キャピラリー (NanoTemper Technologies) で実行、Microscale Thermophoresis 装置 (Monolith NT.115、NanoTemper Technologies) の励起パワーと MST パワーはそれぞれ 50% と 20% に設定され、温度は 25 °C に設定されました。得られたすべてのデータは、MO.Affinity Analysis v2.3 ソフトウェア (NanoTemper Technologies) を使用して分析され、解離定数はミカエリス・メンテン反応速度論を使用して近似曲線から計算されました。

A549細胞を、10％FBS（Gibco）および1％PenStrep（Gibco）で修飾したダルベッコMEM（Gibco）からなる完全培地中で培養した。コンフルエントな細胞を 3 日または 4 日ごとに分割しました。 RgRSV(224)は、他の場所で記載されているように培養されました28。

A549 細胞を 96 ウェル黒色透明底プレートに DMEM (10% FCS、1% PenStrep (Gibco)) 中で 2.5 × 104 細胞/ウェルで播種し、37 °C、5% CO2 で培養しました。播種後 24 時間で、細胞を滅菌 PBS で 2 回洗浄し、感染多重度 (MOI) 1 で rgRSV(224) を感染させました。希釈は、DMEM (1% PenStrep、FCS を省略)、パリビズマブ中で rgRSV から事前に作成されました。アプタマーは最終濃度 1、2.5、5、または 10 nM で添加されます。抗ウイルス剤と RSV のプレインキュベーションは、37 °C、5% CO2 で 1.5 時間実行されました。感染前に、A549細胞を100μlのPBSで2回洗浄し、プレインキュベートしたサンプルを加え、混合物を37℃、5%CO2で1.5時間インキュベートした。感染細胞をＰＢＳで２回洗浄し、次いで１００μｌのＤＭＥＭ（１０％ＦＣＳ、１％ＰｅｎＳｔｒｅｐ）を各ウェルに添加した。すべての治療は 3 回繰り返して実行されました。プレートを蛍光プレートリーダー (Tecan Spark) の湿潤チャンバーに移し、発生した蛍光の測定を 37 °C、5% CO2 で 48 時間実行しました。感染細胞は、蛍光顕微鏡 (Leica DMIL LED 倒立ルーチン蛍光顕微鏡、対物レンズ 20 倍) を使用して画像化することもできました。次に、メーカーのプロトコールに従って、iScriptTM RT-qPCR サンプル調製試薬を使用して細胞を溶解しました。

細胞溶解物中のウイルスゲノムの逆転写は、RT-qPCR 用の iScript™ Reverse Transcription Supermix を使用して実行されました。次に、ハウスキーピング遺伝子として RSV47 の N 遺伝子と ACTB (Applied Biosystems、TaqMan Assay ID: Hs99999903_m1) のプライマーセットを用いて cDNA の qPCR を行い、SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix または SsoAdvanced Universal Probe Supermix と混合して測定しました。 CFXリアルタイムPCRシステムによる。 QPCR サイクル条件は次のとおりです。95 °C で 3 分間、95 °C で 10 秒、60 °C で 20 秒を 50 サイクル。続いて融解曲線分析を行います。データは、CFX Maestro (BioRad) を使用して分析されました。

A549 細胞を 96 ウェル黒色透明底プレートに DMEM (10% FCS、1% PenStrep (Gibco)) 中で 2.5 × 104 細胞/ウェルで播種し、37 °C、5% CO2 で培養しました。播種後 24 時間で、細胞を修飾アプタマーの希釈系列で処理しました。 PBSで処理した細胞を陰性対照として使用した。 48時間後、製造業者の指示に従ってCellTiter Blueキット(Promega)を使用して細胞生存率を評価した。蛍光は、Spark Plate Reader (Tecan) で検出されました。

A549 細胞を 96 ウェル黒色透明底プレートに DMEM (10% FCS、1% PenStrep (Gibco)) 中で 2.5 × 104 細胞/ウェルで播種し、37 °C、5% CO2 で培養しました。播種後 24 時間で、細胞を滅菌 PBS で 2 回洗浄しました。 DMEM (10% FCS、1% PenStrep) を最終濃度 10 nM でアプタマーと混合し、A549 細胞に添加しました。サンプルは、インキュベーションの 0 時間、0.5 時間、1 時間、2 時間、4 時間、8 時間および 24 時間後に細胞の上清から採取され、すぐに液体窒素中で急速冷凍されました。次に、QuantStudio 12K Flex PCR System を用いて qPCR を実施しました。 10μlのPCR混合物は、それぞれ0.4μlの10μM非標識リバースおよびフォワードプライマー、5μlのqPCRBIO SyGreen Mix Lo-ROX (PCR Biosystems)、2μlのサンプル、2.2μlのヌクレアーゼフリー水から構成されていました。リアルタイム qPCR の反応条件は次のとおりです。95 °C で 2 分間の初期変性、その後 95 °C で 5 秒の変性、60 °C で 20 秒のアニーリングを 40 サイクル行いました。融解曲線分析は 60 °C ～ 95 °C で実行されました。

すべてのグラフはプロットされ、GraphPad Prism (バージョン 9.1.2.) を使用して統計分析が実行されました。グラフは、3 回の反復の平均 ± 標準偏差を表します。 P 値は、対応のない t 検定を使用して計算されました (*P < 0.05、**P < 0.005、***P < 0.001、****P < 0.0001、ns = 有意ではありません)。感染後 0 ～ 30 時間で得られた蛍光強度を使用して、曲線下面積 (AUC) を計算しました。阻害のパーセンテージは、次の式を使用して計算しました: (1-(サンプルの AUC / 模擬処理した rgRSV 感染細胞の AUC)) × 100。ウイルスレベルを 50% 低下させるアプタマーの阻害濃度 (IC50) は、次のように推定されました。可変傾きの非線形曲線をサンプルの阻害のパーセンテージに当てはめる。

図の基礎となるデータは次のとおりです。図 2、3、4、5、およびすべての補足図は補足データファイルに同梱されています。この研究からの追加データは、合理的な要求に応じて責任著者 ([email protected]) から入手できます。この文書には補足情報が記載されています。

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資金の一部は、NIH、NIAID、ワクチン研究センターの学内研究プログラム (ZIA AI005024-22) およびハンガリー国立研究開発イノベーション局 (NKFIH 助成金番号: ANN-139564) によって提供されています。プロジェクト番号 TKP2021-EGA-24 は、TKP2021-EGA 資金計画に基づいて資金提供された国立研究開発イノベーション基金からのハンガリーイノベーション技術省の支援を受けて実施されました。 KP は、欧州生化学協会連盟 (FEBS) の短期フェローシップによって支援されました。

センメルワイス大学が提供するオープンアクセス資金。

センメルヴェイス大学、ブダペスト、ハンガリーの生化学・分子生物学研究所、分子生物学部

クリスティナ・ペルチェ、ゾルターン・ヤノス・トルナイ、タマス・メサロス

医療免疫学研究室、ラドバウド感染症センター、ラドバウド分子生命科学研究所、ラドバウド大学医療センター、ナイメーヘン、オランダ

マーク・エレベルド & マリエン・I・デ・ヨンジュ

ワクチン研究センター、国立アレルギー感染症研究所、国立衛生研究所、ベセスダ、メリーランド州、米国

リー・オウ、ハイジュアン・ドゥ、アダム・S・オリア、ピーター・D・クォン

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TM と M.dJ. この作品を概念化しました。 LOは、ヒトメタニューモウイルスおよびヒトパラインフルエンザウイルス3型から、Ds-Cav1および融合後Fタンパク質を融合前三量体とともに調製した。 HD は血球凝集素三量体を提供しました。 ASO は SARS-CoV-2 スパイクを提供しました。 KP と TM は RSV F アプタマーの選択を設計および実行しました。 KP、ZJTはアプタマー特性評価アッセイを設計し、実施した。 KP、私、MDJ。ウイルス中和実験を設計および実行。 KP は結果を分析し、解釈しました。 TM、KP、M.dJ、PDK が原稿を執筆および編集しました。著者全員が結果を検討し、原稿の最終版を承認しました。この原稿はまだ受理されておらず、他の場所でも出版されていません。

タマシュ・メサロスへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

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転載と許可

Percze、K.、Tolnai、ZJ、Eleveld、M. 他。アプタマーを保持するトリプトファン様側鎖は、肺上皮細胞のRSウイルス感染を阻害します。 Sci Rep 13、9403 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-36428-2

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受信日: 2023 年 2 月 27 日

受理日: 2023 年 6 月 3 日

公開日: 2023 年 6 月 9 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-36428-2

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