熱帯熱マラリア原虫におけるレジストームの発見を促進する変異誘発原虫の生成

Nature Communications volume 14、記事番号: 3059 (2023) この記事を引用

1631 アクセス

19 オルトメトリック

メトリクスの詳細

薬剤耐性の in vitro 進化は、抗マラリア薬の標的を同定するための強力なアプローチですが、耐性を引き出すための主要な障害となるのは、寄生虫の接種材料のサイズと突然変異率です。 ここで我々は、熱帯熱マラリア原虫のDNAポリメラーゼδの触媒残基を編集することによって、寄生虫の遺伝的多様性を高めて耐性選択を強化することを試みた。 突然変異蓄積アッセイでは、突然変異率が約 5 ～ 8 倍上昇し、薬物加圧系統では 13 ～ 28 倍増加することが明らかになりました。 スピロインドロン PfATP4 阻害剤 KAE609 で攻撃すると、野生型寄生虫よりも迅速かつ低接種量で高レベルの耐性が得られます。 選択により、他の株では耐性をもたらさなかった「耐性のない」化合物MMV665794に対する耐性をもつ変異体も得られます。 我々は、MMV665794およびキノキサリン類似体のパネルに対する耐性の原因として、これまで特徴づけられていなかった遺伝子PF3D7_1359900（キノキサリン耐性タンパク質（QRP1）と呼ぶ）の変異を検証した。 この「ミューテーター」寄生虫が利用できる遺伝子レパートリーの増加を利用して、熱帯熱マラリア原虫レジストームの発見を推進することができます。

抗マラリア薬の発見では、マラリアを治療し、最終的に排除するための新しい薬や改良された薬を積極的に探してきました。 熱帯熱マラリア原虫に対する現在の最前線のアルテミシニンベースの併用療法（ACT）は、抗マラリア薬耐性の中心地である東南アジアにおいて、アルテミシニンとパートナー薬剤の両方に対して感受性が低い原虫の出現により損なわれてきました1,2。 さらに、ルワンダとウガンダの分離株でアルテミシニンに対する感受性の低下を引き起こす kelch13 変異が出現したという最近の報告に例示されているように、アルテミシニン耐性は世界中の流行地域に住む人々にとって公衆衛生上の脅威となっています 3,4。 全細胞表現型に基づくスクリーニングを使用して、優れた効力と多段階活性を備えた多くの有望な抗マラリア化合物が発見されています5。 ただし、このアプローチでは、分子標的に関する知識が不足しているため、リードの最適化が困難になります。 薬剤の標的、作用機序、耐性メカニズムをより深く理解することで、薬剤耐性に耐えられるより優れた薬剤の設計につながる可能性があります6、7、8。 さらに、薬剤標的または耐性遺伝子の知識は、薬剤耐性の蔓延と封じ込めを監視するための現場でのゲノム疫学調査のための分子マーカーを提供します9,10。

薬剤耐性の in vitro 進化とその後の全ゲノム解析は、作用機序や耐性のメカニズムと傾向の定義に役立つため、薬剤標的を同定するための重要なアプローチとなっています 11、12、13。 典型的な in vitro 耐性選択は、薬剤感受性の寄生虫をすべて殺すことができる濃度の抗マラリア薬に曝露される 105 ～ 109 匹の寄生虫接種材料を使用して行われます 8,14,15。 その後、再発性の寄生虫を全ゲノム配列決定して、耐性表現型の原因となっている根本的な遺伝子を同定することができます。 成功への主な障害は、選択レジメンや株の背景に関係なく、耐性原虫の選択が長期間にわたるか、場合によっては完全に不可能であることです。 したがって、この労力と時間のかかるプロセスでは、分子標的やクエリ化合物の定義された作用機序を特定できない可能性があります。 たとえば、Malaria Drug Accelerator Consortium (MalDA) による 48 化合物による一連の in vitro 耐性選択では、23 化合物が耐性原虫を生成し、15 ～ 300 日後に耐性が観察されました 16。 複数の試行や条件を経ても耐性寄生虫を生成できない化合物は、「耐性のない」化合物と呼ばれています17。 化合物が明らかに「抵抗性」である理由は複数考えられますが、抵抗性の傾向が低いことは、抗マラリア薬発見の観点からは魅力的な性質であり、そのため、それらの作用機序についての洞察は貴重です。

防御的変異を持つ寄生虫を選択する能力は、少なくとも部分的には、十分な遺伝的多様性を備えた接種材料のサイズに依存します。 ただし、技術的な実用性の理由から、in vitro 耐性選択の最大接種量は通常、フラスコあたり約 5 × 109 個の寄生虫 (170 mL 培養液中に約 10% の寄生虫血症、3% のヘマトクリット) に制限されており、これは可能な接種量よりも桁違いに少ないです。感染した人間に発生します。 培養サイズが大きくなり、選択時間が延長されると、より多くの化合物が消費され、これが制限となる可能性があります。 いくつかの実験室株、およびカンボジア西部の薬剤耐性震源地から収集された野外分離株は、無性生殖生活環ごとに部位あたり約 10-9 から 10-10 塩基置換という同様の範囲の突然変異率を有することが示されている 18,19。 20、21。

この研究では、特定の培養体積で表される遺伝的多様性を高め、選択の実験時間スケールを潜在的に短縮するために、CRISPR-Cas9 を使用して、DNA ポリメラーゼの校正活性が欠損している熱帯熱マラリア原虫変異体 Dd2 寄生虫を生成します。 δ 触媒サブユニット。げっ歯類のマラリア原虫 Plasmodium berghei における同様のアプローチにヒントを得たものです 22,23。 我々は、この遺伝子操作された熱帯熱マラリア原虫株の突然変異率が増加し、接種材料が低下し、既知の標的を持つ化合物である KAE609 に対する耐性を選択するのに必要な時間が短縮されることを示します 24。 以前に野生型 3D7 および Dd2 寄生虫による選択に失敗した、以前に同定された耐性化合物 MMV665794 でチャレンジすると、機能未知の遺伝子 PF3D7_1359900 に変異を持つ複数の耐性クローンが得られます。 これらの候補変異を CRISPR-Cas9 で編集して野生型寄生虫に導入すると、選択した系統に同レベルの耐性が付与され、キノキサリン系化合物に対する耐性におけるこの遺伝子の役割が実証されました。 私たちの結果は、この「ミューテーター」寄生虫が新しい抗マラリア標的を特定し、薬剤耐性メカニズムを理解する可能性を裏付けています。

培養中の熱帯熱マラリア原虫寄生虫の遺伝的レパートリーを増やすために、基礎的な自然突然変異のレベルを高めるために、DNA ポリメラーゼ δ の触媒サブユニット (PF3D7_1017000) からの 3’−5’ 校正活性が損なわれた寄生虫を生成することを目的としました。酵母およびげっ歯類のマラリア原虫Plasmodium bergheiに関する以前の研究に関する22、23、26。 高忠実度の複製 DNA ポリメラーゼ δ はラギング鎖合成の主要な酵素であり、DNA 複製中に誤って取り込まれたヌクレオチドを切除できる 3′-5′ エキソヌクレアーゼ活性を含んでいます 27,28。 DNAポリメラーゼδのエキソヌクレアーゼドメインの2つの保存された触媒残基の破壊（補足図1）は、3’−5’校正活性の障害を引き起こし、DNA複製の忠実度の低下をもたらします。 これにより、ヌクレオチド配列の変異が増加し、ゲノム内の突然変異率が高くなります29,30。 熱帯熱マラリア原虫 3’−5’ プルーフリーディング サブユニットの 2 つの保存された触媒残基、D308 および E310 は、Dd2 株バックグラウンドで CRISPR-Cas9 を使用してアラニンに置換されました (図 1A、B)。

A sgRNA、Cas9、およびドナーテンプレートを含む pDC2-Cas9-gRNA プラスミドを使用して、熱帯熱マラリア原虫 Dd2 の D308 および E310 残基をアラニンに置換しました。 2 つの sgRNA 結合部位とサイレント シールド変異が示されています。 B CRISPR-Cas9 編集された寄生虫を 5 nM WR99210 で選択し、編集されたクローンを限界希釈により単離しました。 3 つのクローン DNA ポリメラーゼδ変異体寄生虫 (Dd2-Polδ) を全ゲノム配列決定および変異蓄積アッセイのために選択しました。 C Dd2-Polδ 変異体寄生虫の適応度。 競合フィットネスアッセイでは、蛍光参照ライン Dd2-GFP を Dd2-WT または Dd2-Polδ クローン H11 と 1:1 の比率で混合しました。 増殖はフローサイトメトリーによって 2 日ごと、合計 20 日間測定され、MitoTracker Deep Red によって検出された感染赤血球の総数と比較した GFP 陽性寄生虫の割合が測定されました。 技術的な三重実験による 2 つの独立した生物学的実験 (n = 2) を実行し、データは平均値 +/-SD として表示されます。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

熱帯熱マラリア原虫 DNA ポリメラーゼ δ は、寄生虫の生存に必須であると予測されています 31。 DNA ポリメラーゼ δ の校正機能の除去が寄生虫に適応度コストをもたらすかどうかを調べるために、競合的適応度アッセイを実行しました。 緑色蛍光タンパク質 (GFP) を強力に発現する操作された寄生虫である Dd2-GFP が、増殖基準として使用されました 32。 参照 Dd2-GFP 株を、Dd2 野生型 (Dd2-WT) または Dd2 DNA ポリメラーゼδ 変異体 (Dd2-Polδ) と 1:1 の比率で混合し、2 つの株の相対的比率をフローによって測定しました。サイトメトリーを 2 日ごとに 20 日間 (約 10 世代)。 Dd2-Polδは、各系統がよりゆっくり増殖するDd2-GFP参照といかに迅速に競り勝つことができたかに基づいて、Dd2-WTと比較してわずかに低下した適応度しか示さなかった(図1C)。

ヌクレオチド配列の多様性と突然変異率の変化を調べるために、全ゲノム配列決定と組み合わせて突然変異蓄積アッセイを実行し (図 2A)、Dd2-Polδ と Dd2-WT を比較しました。 Dd2-Polδの3つのクローン（E8、F11、H11）およびDd2-WTのクローンを完全培地中で100日間（約50世代）連続培養しました（図2A）。 寄生虫を 20 日ごとに収集し、限界希釈によってクローンを単離しました。 合計 12 クローンの Dd2-WT と 37 クローンの Dd2-Polδ (時点ごとに 1 ～ 3 クローンに相当) を全ゲノム配列決定用にランダムに選択しました。 すべての寄生虫のゲノムは、Dd2 参照ゲノム (PlasmoDB-44_PfalciparumDd2_Genome) にマッピングされました。 コード領域と非コード領域を含む Dd2 コア ゲノムを、一塩基変異体 (SNV) コールの参照として使用しました。 バリアント表面抗原遺伝子ファミリー (var) とすべての染色体のサブテロメア領域がコア ゲノムから除外されました。 Dd2 コアゲノムの座標は補足表 1 に定義されています。各クローンの de novo SNV は、0 日目の親株との比較によって決定されました。Dd2-WT の de novo SNV の数は、平均して100 日間の培養期間にわたってコード配列内のクローンあたり 1 SNV。 対照的に、各 Dd2-Polδ クローンは、コード領域 (エクソーム) にクローンあたり平均 3 ～ 6 個の SNV を持っていました (図 2B、補足図 2A、B、補足表 2 および補足データ 1)。 Dd2-WT クローンと Dd2-Polδ クローン間の非コード領域の SNV 数の差はそれほど顕著ではありませんでした (図 2B)。 それにもかかわらず、各 Dd2-Polδ クローンには、すべてのタイプ、特に非同義変異体のより多くの SNV が 14 染色体すべてに分布していました (図 2C および補足図 3A、B)。 突然変異のクラスター（20 bp以内に生じる）があるかどうかを調べ、12の例を特定しましたが、これらはすべてATに富む遺伝子間領域にありました（補足表3）。 複数のミスセンス変異を含む遺伝子は 4 つだけ特定されました (補足図 3C)。 遷移（Ts）イベントとトランスバージョン（Tv）イベントの塩基対置換を比較すると、Dd2-PolδのTs：Tv比が中程度に減少し、G：C→A：T遷移が2〜4倍増加したことが示されました（補足図） .4A、B）。

Dd2-WT と Dd2-Polδ の 3 つのクローンを比較する変異蓄積アッセイ。 すべての系統を並行して 100 日間 (約 50 世代) 培養しました。 寄生虫はクローン分離のために 20 日ごとにサンプリングされ、その後ゲノム DNA 抽出のために採取されました。 全ゲノム配列決定は、0、20、40、60、80、および 100 日目に収集されたサンプルに対して実行されました。 B Dd2-WT および Dd2-Polδ 株のエクソーム、非コードおよびコアゲノム領域における固有の SNV の数は、各点は 1 つのクローンを表します。ここで、n = 以下の独立したクローンの数 (WT:12、E8:12、F11:14、H11:11)。 中央線が表示され、25/75 パーセンタイルがボックスで囲まれ、ひげは最小値と最大値を示します。 両側ウィルコクソン対応対符号付き順位検定では、Dd2-WT と比較した Dd2-Polδ クローンの統計的有意差が示され、p 値は示されています (a:0.0049; b:0.0015; c:0.002; d:0.002; e:0.002; f:0.0298; g:0.0005; h:0.001)。 C SNV のゲノム位置、寄生虫系統ごとに色分け。 D Dd2-WT (n = 12) および Dd2-Polδ クローン E8 (n = 12)、F11 (n = 14) および H11 (n = 11) の変異率、データは平均 + /-SD (値と 95% 信頼区間は表 1 に示されています)。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

次に、世代ごと、ゲノムまたはエクソームごとの各系統のすべてのクローンの de novo SNV の平均数に基づいて、Dd2-WT および 3 つの Dd2-Polδ クローン E8、F11、および H11 の突然変異率を決定しました (「方法」を参照)。 各 Dd2-Polδ クローンは、Dd2-WT よりも高い突然変異率を示し、コアゲノム (コード領域および非コード領域) の 2 ～ 3 倍からコード領域 (エクソーム) の 5 ～ 8 倍まで変化しました (図 2D、表 1 および補足データ 2)。 Dd2-Polδ クローン F11 および H11 はクローン E8 よりも高い突然変異率を示したので (図 2D および表 1)、その後のすべての実験はクローン H11 を用いて実行されました。 クローン間の突然変異率のわずかな差がDNA修復遺伝子の自然突然変異に起因する可能性があるかどうかを調べるために、DNA修復に役割を果たす遺伝子が100日間の培養期間中にDd2-Polδ株で突然変異したかどうかも調べました(補足データ 1)。 DNA 修復遺伝子内またはその付近の SNV が各 Dd2-Polδ 株で観察されましたが、単一の SNV がすべてのクローン間で共有されることはありませんでした。 Dd2-Polδ クローン E8 は、2 つの推定 DNA 修復遺伝子のコーディング領域に SNV を持っていました。DNA ポリメラーゼ シータの G435E 変化 (PfDd2_130037000) と DNA 修復タンパク質 RHP16 の N420K 変化 (PfDd2_120056000) です。 Dd2-Polδ クローン F11 には、RuvB 様ヘリカーゼ 3 に P225L 変化がありました (PfDd2_130068000)。 Dd2-Polδ クローン H11 には、DNA 修復遺伝子のコーディング領域に SNV がありませんでした。 ただし、SNV は、増殖細胞核抗原 2 (PfDd2_120031600) に近接する非コード領域で観察されました (補足データ 1)。

Dd2-Polδ培養で利用できるより多様な遺伝子レパートリーが薬剤耐性原虫の選択効率を高めるという仮定に基づいて、我々は、以下の薬剤を使用してDd2-WTとDd2-Polδを比較する概念実証実験を実施しました。よく特徴付けられた行動様式。 現在第 II 相臨床試験中の KAE609 (シパルガミン) は、耐性を付与することが知られている SNV を持つ熱帯熱マラリア原虫 P 型ナトリウム ATPase 4 遺伝子 (Pfatp4、PF3D7_1211900) を標的としています 24。 in vitro 薬剤耐性選択は、2.5 nM KAE609 (Dd2 の約 5 倍の IC50) の存在下で培養した寄生細胞を 2 × 106、2 × 107、2 × 108 および 1 × 109 に設定した開始接種材料の範囲で実行されました。 -WT) を接種材料ごとに 3 つの独立したフラスコに入れます。

5日間の薬物治療後、顕微鏡検査では生存可能な寄生虫は検出されませんでした。 Dd2-WT の再燃は、1 × 109 の最高開始接種量でのみ観察され、寄生虫は 3 つの独立した選択フラスコで 18、21、および 30 日目に観察されました。 対照的に、Dd2-Polδ株は、より低い開始接種量で、12日目までに寄生虫を戻した(図3A)。 2 × 108 および 1 × 109 の寄生虫を含む 3 つのフラスコすべてが陽性であり、2 × 107 の寄生虫を含む 3 つのフラスコのうち 1 つも 12 日目に再燃性の寄生虫を示しました。 3 つのフラスコのどれも、2 × の開始接種では寄生虫に対して陽性ではありませんでした。 １０６（図３Ａ）。

Dd2-WT (青線) および Dd2-Polδ (赤線) を 2.5 nM KAE609 (5 × IC50) の存在下で連続培養しました。 寄生虫接種は 3 つ組のフラスコで 2 × 106 ～ 1 × 109 細胞の範囲であり、寄生虫は 30 日間の選択期間にわたって顕微鏡検査によって検出されました。 Dd2-Polδ 寄生虫は、2 × 107、2 × 108、および 1 × 109 の開始接種材料で 12 日目に観察されましたが、Dd2-WT 寄生虫は 109 接種材料でのみ検出され、18、21、および 30 日目に 3 つのフラスコに出現しました。 、 それぞれ。 B Dd2-WT (左パネル) および Dd2-Polδ (右パネル) の薬物圧力に曝露されていない親系統および薬物選択系統 (R1 ～ R3) の KAE609 の用量反応曲線。 示されているのは代表的なアッセイ (2 つの技術的反復、エラーバーは SD を示す) であり、IC50 値は以下の生物学的反復に由来する平均 +/- SD として表されます (Dd2-WT、n = 6; Dd2-R1、n = 3; Dd2-R2、n = 3;Dd2-R3、n = 3;DNA-Polδ、n = 6;Polδ-R1、n = 6;Polδ-R2、n = 6;Polδ-R3、n = 5）。 C 膜貫通ドメイン内またはその近くに位置する KAE609 耐性変異を示す PfATP4 の AlphaFold モデル。 青色の残基は Dd2-WT 選択に由来し、赤色の残基は Dd2-Polδ に由来します。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

選択前は、Dd2-WT 親株と Dd2-Polδ 親株はどちらも、約 0.3 ～ 0.6 nM の同様の IC50 を持っていました。 Dd2-WT バックグラウンドから KAE609 で選択された系統の IC50 値は 3 ～ 9 nM の範囲でした (図 3B)。 比較すると、Dd2-Polδ バックグラウンドから薬物で選択された系統は、IC50 値が約 700 ～ 900 nM でかなり耐性があり (図 3B)、親系統よりも 3 桁高かった。

これらの表現型を駆動する耐性決定因子を同定するために、選択された系統のセットを全ゲノム配列決定および pfatp4 遺伝子の直接サンガー配列決定によって検査しました。 どちらのアプローチでも、これらの耐性株のpfatp4（PF3D7_1211900）の変異が明らかになり、それぞれフラスコ1とフラスコ3のDd2-WTバックグラウンドのL350HとG199Vでタンパク質変異が引き起こされ、Dd2-Polδバックグラウンドのすべての株でG358Sが引き起こされました（補足データ） 3)。 3 つの変異はすべて、PfATP4 膜貫通領域内またはその近くに位置すると予測されています 33 (図 3C)。 変異L350HおよびG358Sは、PfATP434を標的とする別の化合物であるジヒドロイソキノロンSJ733を用いた、それぞれDd2および3D7におけるインビトロ耐性実験から以前に報告されていた。 L350H も、カンボジア分離株の KAE609 を使用して選択されました 25。 PfATP4 に加えて、他の 5 つの遺伝子の非同義 SNV が観察されました (補足データ 3)。これは、Dd2-Polδ 系統で選択する場合、標的に関する事前知識が利用できない場合に候補を優先するために追加の基準が必要になる可能性があることを示しています。 追加の 5 つの遺伝子 (PF3D7_0318500、PF3D7_0520800、PF3D7_1002200、PF3D7_1004200、PF3D7_1428400) のうち、piggyBac 変異誘発スクリーニング 31 の検査により 2 つが非必須遺伝子であることが特定され、3 番目の遺伝子の変異は低複雑性領域にあり、4 番目の遺伝子の変異は mu駅薬剤を使用しない変異蓄積実験の一部のクローンでも観察されたため、バックグラウンド変異である可能性があります。

全体として、これらの結果は、Dd2-Polδ 系統が、開始寄生虫の数が少なく (2 × 107 対 1 × 109)、より短い選択期間で、予想される分子標的内の薬剤耐性寄生虫を選択できることを確認しました 24,25,34 Dd2-WT より (12 日 vs 18 ～ 30 日)。

次に、「魅力的な」化合物を使用して Dd2-Polδ ラインに挑戦しました。 「耐性のない」クラスの化合物は一般に、標準株（通常は Dd2 または 3D7）を用いた in vitro 選択中に薬剤耐性寄生虫を生成できない化合物を指します。 これらの化合物は耐性を示す傾向が低いため、これらの化合物の作用機序を特定することは非常に興味深いものです。 TCMDC-124162 (2-N,3-N-ビス[3-(トリフルオロメチル)フェニル]キノキサリン-2,3-ジアミン)としても知られるMMV665794は、表現型ハイスループットスクリーニングから同定されたキノキサリン足場抗マラリア薬です36。 最初の in vitro 薬剤耐性選択は、この化合物を用いて野生型 3D7 および Dd2 株で異なるアプローチを使用して実行されましたが、成功しませんでした (補足表 4)。

Dd2-Polδ および Dd2-WT を 95 nM (1 × IC50) のキノキサリン化合物で断続的に処理しました。 耐性株を獲得する可能性を最大化するために、フラスコあたり 1 × 109 個の寄生虫という高い開始接種材料を 3 回使用しました (図 4A)。 10 ～ 12 日間の圧力をかけた後、両方の系統の顕微鏡検査では寄生虫は検出できず、20 日後に薬剤圧力を解除しました。以前の結果と一致して、Dd2-WT は 60 日間の曝露期間中に回復しませんでした (図 4A)。失敗した選択 (補足表 4)。 対照的に、Dd2-Polδ 系統の 3 つのフラスコはすべて 21 日目に回復しました。その後、薬物濃度を 2 × IC50 まで増加させ、寄生虫の抑制をもたらしました。 40日目に培養物を薬剤を含まない完全培地に切り替え、60日目に再び寄生虫が3つのフラスコすべてで検出されました。 薬剤によって選択された寄生虫から単離されたクローン株は、薬剤圧力にさらされていない親株と比較して、IC50 が約 2 ～ 2.5 倍増加しました (図 4B)。 2 つのフラスコの寄生虫は、2 × IC50 の一定の薬剤圧力に再曝露すると正常に増殖しましたが、3 番目のフラスコの寄生虫は生存しませんでした。

Dd2-WTではMMV665794に対する耐性を進化させることができないが、Dd2-Polδでは耐性の分離に成功したことを示す選択スキーム。 上のパネル: 1 × IC50 (95 nM) に 60 日間曝露した Dd2-WT。 下のパネル: Dd2-Polδ 選択圧力を 2 × IC50 (190 nM) まで上昇させ、3 つの独立したフラスコで 60 日後に再発が観察されましたが、薬物圧力下で安定して増殖できたのは 3 つのフラスコのうち 2 つだけでした。 再燃性の寄生虫をさらに 3 倍および 4 倍の IC50 で攻撃しましたが、生き残ることはできませんでした。 B 親株および 2 × IC50 圧力下で生存できた 2 つの耐性株 (C1-2) の MMV665794 の用量反応曲線。 代表的なアッセイ (2 つの技術的反復、エラーバーは SD を示す) を示します。IC50 値は、以下の生物学的反復 (DNA-Polδ、n = 7; Polδ-R1、n = 5; Polδ-R2、n = 5)。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

より高いレベルの耐性が得られるかどうかを調査するために、2 つの再帰フラスコの寄生虫培養物をそれぞれさらに 2 つのフラスコ (それぞれ 4.5 × 108 個の寄生虫を含む) に分割し、3 × IC50 または 4 × IC50 でさらに圧力をかけました。 寄生虫はどちらの処理でも 4 日後に死亡し、その後薬物を含まない完全培地で培養されました (図 4A)。 しかし、60日経過しても寄生虫は回復せず、MMV665794に対して低レベルの耐性しか得られなかったことを示しています。

MMV665794 で選択された系統の原因となる耐性変異を特定するために (図 4)、2 つの独立した選択から単離された 6 つのクローンに対して全ゲノム配列決定を実行しました。 キノキサリンで選択されたすべての系統に共通する唯一の変異遺伝子は、機能不明の保存されたマラリア原虫膜タンパク質をコードする PF3D7_1359900 (PfDd2_130065800) でした。 2126 アミノ酸のタンパク質は、4 つの予測される膜貫通ドメインをコードします (図 5A)。 6つのクローンのそれぞれには、2つの異なるSNVのうちの1つ、G1612V（フラスコ2からの4つのクローン）またはD1863Y（フラスコ3からの2つのクローン）のいずれかが含まれており、それぞれDd2のG1616VおよびD1864Yに相当します（図5Aおよび補足データ3）。 薬剤によって選択されたクローンでは、新しいコピー数バリアントは検出されませんでした (補足データ 4)。

PfQRP1 (PF3D7_1359900) は、4 つの予測膜貫通ドメインを持つ 250 kDa のタンパク質をコードします。 MMV665794 を用いた 2 つの独立した選択で見つかった 2 つの変異 G1612V および D1863Y は、α/β ヒドロラーゼと保存を共有する C 末端ドメインに位置しています。 B Ser-Asp-His の推定触媒トライアド (黄色)、および G1612V および D1863Y 耐性変異 (紫) を示す、PfQRP1 の C 末端 656 残基 (1471 ～ 2126) のモデル。 C、D CRISPR-Cas9 編集 QRP1 の IC50 値。 同等の G1612V および D1863Y 変異をコードする Dd2 株は、Dd2-WT およびサイレント編集対照と比較して、MMV665794 に対する感受性が大幅に低下し、キノキサリン骨格を共有する構造的に関連する分子である MMV007224 に対して交差耐性を示しました。 各ドットは生物学的複製を表し、n = 6 の独立した複製を平均±SD で示し、サイレント編集対照と比較した統計的有意性は両側マンホイットニー U 検定によって決定されます。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

アピコンプレックス内に明らかなオルソログのみを持つPF3D7_1359900の潜在的な機能についての洞察を得るために（補足図5）、trRosettaとAlphaFold 37、38を使用して、耐性変異を含む領域の構造モデルを調べました。 この領域は、タンパク質の C 末端に向かって、予測される 4 つの膜貫通セグメントの下流に位置します (図 5A)。 DALIサーバーを使用したタンパク質構造の比較により、エステラーゼ/リパーゼとの潜在的な構造的相同性が示され、推定上のSer-Asp-His触媒トライアドはタンパク質モデル上で近接して位置し、オルソログ全体で高度に保存されています（図5Bおよび補足図5）。ただし、潜在的な加水分解酵素活性を特徴付けるにはさらなる研究が必要です。

PF3D7_1359900 の薬物選択変異を検証するために、G1612V または D1863Y 変異のいずれかに相当する Dd2 を導入することにより、CRISPR-Cas9 編集系統を生成しました。 さらに、対応するサイレント突然変異 (G1612sil および D1863sil) および編集されたすべての系統に共通する gRNA シールド突然変異のみで改変された対照寄生虫系統が生成されました。 サイレントコントロールではなく、両方の変異株は、薬剤で選択された寄生虫で観察されたのと同様に、MMV665794 への IC50 のわずかな変化を示しました (図 5C)。

PF3D7_1359900 の変異が他の in vitro 進化実験の文脈で生じたかどうかを調べるために、37 の化合物で選択された 262 の熱帯熱マラリア原虫株において Malaria Drug Accelerator Consortium によって同定された SNV のデータベースを調べ、フレームシフト変異を持つ単一のクローンを同定しました。 PF3D7_135990016 の残基 D100 で。 注目すべきことに、クローンは、MMV665794と同様のキノキサリン骨格を有する化合物であるMMV007224で圧力をかけられていた(図5D)。 タンパク質の開始近くにフレームシフト変異が存在する（補足図6A）ことに加え、piggyBac全ゲノムスクリーニング31での変異誘発は、この遺伝子が無性血液段階では必須ではないことを示しています。

我々は、MMV665794耐性変異を持つCRISPR編集寄生虫がその類似体であるMMV007224に交差耐性を付与できるかどうかをテストした。 G1612VおよびD1863Y変異株は両方とも、MMV665794で観察されたのと同様に、MMV007224に対して同様の低レベルの耐性を示した(図5D)。 同様に、PF3D7_1359900のフレームシフト変異を有するMMV007224で選択された系統は、MMV665794に対して同等の低悪性度耐性を示しましたが、無関係な化合物KAE609およびクロロキンは示しませんでした（補足図6B）。

これらの発見は、我々がキノキサリン耐性タンパク質 1 (PfQRP1) と名付けた PF3D7_1359900 によってコードされるタンパク質が、キノキサリン様化合物に対する一般的な耐性を付与する可能性があることを示唆しています。 PfQRP1 の変異がキノキサリン様足場を持つ化合物に対するより広範な耐性を媒介するかどうかを調べるために、MMV665794 の 6 つの類似体 (補足資料) を合成し、追加の 5 つの類似体を商業的に調達し、このパネルを QRP1-D1863Y CRISPR 編集寄生虫に対して評価しました。 1 つを除くすべてのキノキサリン類似体は、ホスファチジルイノシトール 4-キナーゼを標的とする抗マラリア薬である BQR695 および KDU69139 とは対照的に、QRP1 変異株では対照とは大きく異なる低レベルの耐性を示しましたが、キノキサリン化合物とは無関係な作用機序を持つと予想されていました（補足図）。 。 7）。 我々のデータは、PfQRP1 がキノキサリンベースの化合物に対して低度の耐性を与える、これまで特徴付けられていないタンパク質であることを示唆しています。

KAE609 および MMV665794 の両方に対する耐性を生成する Dd2-Polδ 系統の能力の増強は、選択に利用できる遺伝的多様性の増加と一致していました。 我々は、KAE609、MMV665794、および関連性のない抗抵抗性化合物サリノポスティン A および KM15HA40,41 による 2 つの追加の耐性選択で選択した寄生虫を比較し、薬剤圧力下での Dd2-Polδ の変異率を決定しました。 薬物選択された系統のデノボSNVは、選択実験の対応するバッチで使用された親系統と比較して決定されました（図6Aおよび補足図8）。 これらの系統における突然変異率の変化は、加圧されていない Dd2-WT と比較され、欠陥のある校正 DNA ポリメラーゼ δ と薬剤圧力の複合要因を反映しています。 薬物圧力下のDd2-Polδは、薬物圧力を受けていない野生型Dd2と比較して、コード領域で13〜28倍、ゲノム内で約3〜6倍の突然変異率の増加を示しました（図6Bおよび表1）。 薬物処理されていない Dd2-Polδ と比較した場合、これらの変化はコード領域で約 1.5 ～ 3.5 倍増加し、ゲノム全体では本質的に変化しません (約 0.8 ～ 1.9 倍)。 薬剤圧力下での Dd2-Polδ の Ts:Tv 比は変動し、認識できる傾向は示されませんでした (補足図 9)。

A さまざまな抗マラリア化合物で選択された Dd2-Polδ 内の SNV の数。 KAE609 を除いて、これらの選択では Dd2-WT に耐性のある寄生虫を生成できませんでした。 Dd2-WTと比較して、Dd2-Polδを使用したKAE609選択ではSNVの数が多いことに注意してください(補足表6を参照)。 各ドットは配列決定されたクローンを表し、括弧内は独立したクローンの数を示します: Dd2-WT + KAE609 (2); DD2-Polδ+KAE609 (3); DD2-Polδ+MMV665794 (6); Dd2-Polδ+SalA (6); DD2-Polδ+KM15HA (2)。 青とオレンジのバーはそれぞれエクソームとコアゲノムを表し、平均値 ± SD が示されています。 B 薬物圧力下での Dd2-WT および Dd2-Polδ の突然変異率。 各ドットは配列決定されたクローンを表し、上記 (A) で示した薬物の下にある独立したクローンの数は次のようになります。Dd2-WT-薬物 (12)。 DD2-Polδ-薬物(11)。 データは平均値 +/-SD として表示されます (値と 95% 信頼区間については表 1 を参照)。 非薬物処理のDd2-WTおよびDd2-PolδクローンH11からのデータ(図2Dを参照)が比較のために含まれている。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

薬剤圧力下の Dd2-WT の変異率も、薬剤圧力がかかっていない Dd2-WT と比較して、コード領域で約 3 倍増加しました。 しかし、これは全ゲノムにわたって比較的変化がなく(表1)、以前の報告と一致しています18。

まとめると、我々のデータは、Dd2-Polδ 系統の突然変異率が増加しており、これにより、以前は耐性がなかった化合物であっても薬剤耐性寄生虫を選択する可能性が向上する一方、ゲノムの完全性と寄生虫の堅牢性を維持するのに十分に低いことが示されています。

我々は、Dd2-Polδ変異因子である熱帯熱マラリア原虫が、抗マラリア薬の標的と耐性機構を同定するための強力な新しいツールであると提案する。 DNA ポリメラーゼ δ に対する人工的な修飾から生じる欠陥のある校正は、自然突然変異の割合の増加をもたらします。 培養寄生虫の遺伝子配列空間を拡張することにより、in vitro での耐性体制の進化のもとで薬剤耐性系統を生み出す能力が強化されたことが明らかになりました。 作用機序が既知である薬剤 KAE60924 を用いた選択では、Dd2-Polδ 系統を使用した 10 ～ 100 倍低い接種量とより短い選択ウィンドウで耐性寄生虫が得られることが観察されました。 抵抗力のない化合物であるキノキサリン MMV665794 の場合、Dd2-Polδ 系統は、以前の選択が失敗していた場所で中程度の抵抗力を持つ寄生虫を生成しました。 突然変異率の上昇から生じる潜在的な考慮事項の 1 つは、薬剤耐性の選択中に発生する、より無関係な遺伝子突然変異の存在です。 したがって、ゲノム編集の検証と組み合わせて、複数の独立した選択から少なくとも 2 つのクローンの配列を決定することは、原因となる変異を正確に特定するために重要です。

全ゲノム配列決定と組み合わせた突然変異蓄積アッセイを使用することで、代表的なレポーター遺伝子座に依存せず、全ゲノムデータに基づいて突然変異率を決定することができました42。 私たちは、野生型および Dd2-Polδ 寄生虫を 100 日間追跡して、突然変異率を導き出しました。 Dd2-Polδ 寄生虫の場合、この割合はゲノム全体で Dd2-WT より約 3 倍高く、エキソームの変化を比較すると最大 8 倍でした。ただし、野生型エキソームの変異率は変動する可能性があることに注意してください。親 Dd2 クローン 13 個のうち 7 個が実験期間中に SNV を獲得しなかったため、過小評価されました。 したがって、Dd2-Polδは、Dd2-WTよりもその半数体ゲノムで突然変異が発生するために必要な寄生虫の数が少なくなります（5.08E7対1.63E8寄生虫;補足データ2）。

抗マラリア薬の存在下では、エクソーム全体の変異率は、未処理系統と比較して Dd2-Polδ 系統で 1.5 ～ 3.5 倍高かった。 1つの説明は、処理自体の潜在的な突然変異原性ストレスである可能性がありますが、全ゲノムにわたる突然変異率は、非薬物処理系統と比較した場合、わずかに増加しただけ(0.8～1.9倍)であり、アトバクオン選択下では突然変異率が 3 倍増加18。 したがって、エキソーム内のこの見かけの増加は、一次耐性変異をサポートすることによって薬剤圧力に耐える能力またはフィットネスを維持する能力に影響を与える機能的変異の積極的な選択を反映している可能性があります。 あるいは、より多くのバイスタンダー突然変異を蓄積するクローンは、薬物圧力がない場合に選択される可能性がありますが、偶然の耐性 SNV を持っている場合は、より低い突然変異負荷を持つクローンと競合する可能性があります。

Dd2-Polδの穏やかなミューテーター表現型は、原因となる可能性のある突然変異の同定を可能にするために選択中にあまり多くの突然変異を作成しないこと、および有害な突然変異が生成される可能性にもかかわらず適応度を維持することにより、2つの点で有利である可能性がある。 Dd2-WTと比較して、Dd2-Polδ株はわずかな適応性の損失のみを示し、長期培養後のDNAポリメラーゼにおける操作されたD308A/E310A変異の復帰は観察されませんでした。 対照的に、P. berghei の同等の DNA ポリメラーゼ δ 変異体は、適応度の大幅な低下を示し、DNA ポリメラーゼ δ における抗変異因子変異の存在が観察されました 22,23。 P. berghei DNA ポリメラーゼ δ 変異体の変異率が野生型の約 90 倍と高く、生体内での生育条件がより厳しい可能性があることは、齧歯類のマラリア原虫の原虫適合性に対する大きな影響を説明できる可能性があります。 DNA ポリメラーゼδ上のこれら 2 つの残基の変異は、Pf6K データベースに存在する臨床分離株では見つかりませんでした 43。

DNA ポリメラーゼにおける抗変異因子の変異は忠実度を高めるように作用し、それ自体固有の適応度コストが発生する可能性があります (Herr et al., 2011)。 配列決定された熱帯熱マラリア原虫 Dd2-Polδ クローンのいずれにおいても、DNA ポリメラーゼδにおける既知の抗変異因子変異は観察されませんでした。これはおそらく、変異率の適度な上昇によって課せられる限られた選択圧を反映しています。 それにもかかわらず、3 つの Dd2-Polδ クローンすべてが、DNA 複製および DNA 修復に役割を果たす遺伝子内またはその近くに SNV を持っていましたが、これらの変異が機能的効果を与えるかどうかは不明です。 クローン H11 の増殖細胞核抗原 2 (PCNA2) に近い非コーディング SNV (補足データ 1) は、熱帯熱マラリア原虫の 2 つの PCNA タンパク質のうちの 1 つである pcna2 の遺伝子発現を調節し、DNA ポリメラーゼ δ44 の高い処理能力を促進する可能性があります。 45、46。 さらに、他の 2 つのクローン (F11 および H11) よりも低い突然変異率を示した Dd2-Polδ クローン E8 は、推定上の DNA ポリメラーゼ シータ (PF3D7_1331100) Gly435 に非同義の SNV (G435E) を持ちます。 DEAD/DEAHボックスヘリカーゼの領域にあるヒトDNAポリメラーゼθ。 DNA ポリメラーゼ θ は、低忠実度の DNA ポリメラーゼおよびヘリカーゼ活性を有し、標準的な非相同末端結合、ミクロ相同性媒介末端結合および相同組換えによる二本鎖切断修復などの DNA 修復に役割を果たします。 ポリメラーゼ θ は、ゲノムの安定性と、G4 四重鎖構造によって形成された切断の修復に影響を与えます 46,47。

耐性寄生虫を誘発する Dd2-Polδ 株の能力を、2 つの化合物、KAE609 (シパガーミン) および MMV665794 を使用して評価しました。 現在第 II 相臨床試験中の KAE609 は、寄生虫の原形質膜を通過する Na+ の輸送を担う P 型 ATPase PfATP4 を標的としています (Rottmann et al., 2010; Spillman et al., 2013)。 我々の選択から得られた3つの変異はすべてPfATP4の予測膜貫通領域にあり、これまでに観察された最も多くの変異と一致していた（Rottmann 2010; Jimenez-Diaz et al., 2014; Viadya et al., 2015; Lee and Fidock, 2016）。 注目すべきことに、Dd2-Polδ株を用いた選択により、KAE609の第II相試験中の治療失敗の大部分で最近観察されたG358S変異体が得られ(Schmitt et al., 2021)、この株によるin vitro進化が結果をもたらす可能性があることを示している。臨床関連性がある。 この高レベルの耐性変異は、ジヒドロイソキノロン化合物 (+)-SJ733 を用いた選抜でも以前に観察されており (Jimenez-Diaz et al., 2014)、また、別のグループによる Dd2-Polδ 系統を用いた KAE609 選抜でも並行して観察されています 48。 クイら。 G358S SNV を使用して CRISPR 編集系統を作成し、この変異が IC50 の大きな変化を引き起こすのに十分であることを実証し、PfATP4 の Na+-ATPase 活性を KAE609 による阻害から保護するが、代償として PfATP4 の親和性を低下させることを示しました。タンパク質をNa+48にします。 PfATP4 に対するこの機能的効果にもかかわらず、変異型寄生虫は強い適応コストを持っていません 48。 これは、バルク培養において成長が遅い変異体または耐性の低い変異体と競合する可能性があるため、Dd2-Polδ 系統による選択で G358S 変異体のみを観察した理由の一部を説明する可能性があります。

より少ない寄生虫数でより容易な耐性を獲得することに加えて、Dd2-Polδ 系統の主な可能性は、以前は耐性がなかった化合物のための新しい配列空間にアクセスできることにあります。 私たちは、キノキサリン化学足場とフルタミド様官能基を備えた魅力的な化合物である MMV665794 を使用して Dd2-Polδ ラインに挑戦しました 16,49。 Dd2-Polδを用いた選択では、約60日後に中程度の耐性の寄生虫が得られましたが、野生型3D7またはDd2系統での選択は失敗しました（補足表4）16。

MMV665794耐性クローンの全ゲノム配列決定により、2つの独立した選択フラスコから選択された6つのクローンすべてにおいてPF3D7_1359900の変異が明らかになった。 この遺伝子は、7 kb 遺伝子の約 0.8 kb にある単一の piggyBac 挿入部位 31 と、遺伝子の開始点付近のフレームシフト変異体の観察に基づいて、非必須であると予測されています。 G1612V および D1863Y 変異の CRISPR-Cas9 編集により、耐性表現型におけるそれらの役割が確認されました。 さらに、これらの寄生虫は、構造的に関連するいくつかのキノキサリン様化合物に対して交差耐性を示しました。 キノキサリン耐性タンパク質 1 (PfQRP1) と名付けた PF3D7_1359900 によってコードされるタンパク質は、N 末端に向かう 4 つの膜貫通ドメインと、保存性を共有する耐性変異が位置する C 末端に向かうドメインを含むと予測されています。従来の加水分解酵素。 PfQRP1 の非必須の性質は、これがキノキサリン化合物の標的ではなく、耐性メカニズムであることを示唆しています。 G1612V および D1863Y 変異が機能喪失をもたらすかどうかは不明ですが、MMV007224 で選択された系統にフレームシフト変異が存在することは示唆されています。 QRP1 が、プロドラッグを活性型に変換する PfPARE エステラーゼと同様の方法でキノキサリン化合物に直接作用するのか 50 、それとも間接的な影響を与えるのかは不明です。 それにもかかわらず、誘発される耐性のレベルは控えめであり、効力の損失はわずか 2 倍です。 したがって、MMV665794 に対する耐性を獲得することが困難であることと、効力の変化が限られていることから、この化学クラスの化合物がさらなる探索のための有望な抗マラリア薬候補である可能性があることが示唆されています。 より一般的には、以前は「耐性がなかった」化合物が Dd2-Polδ ラインを使用して探索されるため、このアプローチが直接の標的ではなく耐性遺伝子の変異をより頻繁に生じるかどうかを判断することは興味深いでしょう。 「抵抗不可能な」化合物の性質は、直接の標的の変異により寄生虫が生存不能になること、または化合物が複数の標的または宿主由来の標的に当たる可能性があることを意味する可能性があります。 これらの可能性により、最も可能性の高い結果として耐性変異が生じる可能性があります。

全ゲノム解析と組み合わせた in vitro での耐性の進化は、新規化合物の作用機序を理解するだけでなく、この分野で薬剤耐性のマーカーを同定する上で非常に成功した技術であることが証明されています 13,51。 このアプローチの限界の 1 つは、一部の化学物質に対する耐性を引き出すのが比較的難しいことです。 ここで開発された Dd2-Polδ 寄生虫株は、in vitro 培養の遺伝的複雑性を高めることにより、寄生虫の接種量を減らし、選択時間を短縮し、以前は抵抗できなかった化合物の探索を可能にする可能性があります。

CRISPR-Cas9 を使用したすべての遺伝子操作には、熱帯熱マラリア原虫 Dd2 株が使用されました。 「ミューテーター」系統を生成するために、DNA ポリメラーゼδ触媒サブユニット (PF3D7_1017000) の保存された触媒アミノ酸残基 D308 および E310 をアラニンに変異させました。 2 つの異なるシングルガイド RNA (sgRNA) と、sgRNA-Cas9 複合体の結合を防ぐための追加のシールド変異を伴う D308A/E310A 二重変異を含むドナー修復テンプレート (長さ 699 bp、363 bp/289 bp の隣接相同性) を連続してクローニングしました。 SpCas9 および hdhfr 選択マーカーを含む単一のプラスミド (図 1A を参照) 52。 推定上の耐性変異G1612VおよびD1863YをPF3D7_1359900に導入するために、各変異に対する2つのsgRNAおよびドナー修復テンプレートを上記のように構築した。 G1612Vについては746 bp（443 bp/235 bpの隣接相同性）のドナーテンプレートが生成され、D1863Yについては671 bp（252 bp/307 bpの隣接相同性）のドナーテンプレートが生成されました。 ガイド RNA はオリゴプライマー (IDT) として合成されました。 標的部位のサイレント変異のみをコードするドナー修復テンプレートおよびコントロールドナーテンプレートは、GeneArt (Thermo Fisher Scientific) によって合成されました。 ドナー DNA テンプレートの 5' および 3' には、NEBuilder HiFi DNA Assembly52 を使用して、AatII および EcoRI 部位に挿入する目的の pDC2-Cas9-gRNA プラスミドと相同性のある追加の 20 ～ 21 bp 配列が隣接しました。 プラスミド構築物はサンガー配列決定によって検証された。 sgRNA とサンガー配列決定プライマーを補足表 5 に示します。

寄生虫は、0.5% アルブマックス II (Gibco)、25 mM HEPES (培養グレード)、1x GlutaMAX (Gibco)、25 μg/mL ゲンタマイシン (Gibco) で構成され、O+ ヒトレッドを供給された RPMI 1640 (Gibco) 完全培地で培養されました。血液細胞 (RBC) は、国立保健サービス血液・移植 (NHSBT) または赤十字 (スペイン、マドリード) の匿名の健康なドナーから得られます。 RBCの使用は、英国で行われた実験についてNHSケンブリッジシャー研究倫理委員会およびウェルカム・サンガー研究所の人体材料およびデータ管理委員会の承認を得て、関連するガイドラインおよび規制に従って行われました。 赤血球は倫理的に調達され、その研究使用はスペインで行われた実験に関する IRB/EC 承認プロトコールに基づくインフォームドコンセントの条件に従って行われました。 寄生虫は定期的に 0.5 ～ 3% の寄生虫血症、3% のヘマトクリットで維持され、マラリアガス (1% O2、3% CO2、および 96% N2) 下で培養されました。 同期リング段階は、エレクトロポレーション前のサイクルでの 5% ソルビトール処理によって得られました。 次のサイクルでは、10% 寄生虫血症のリング ステージ (0 ～ 16 時間) をエレクトロポレーションのために採取しました。 Gene Pulser Xcell (BioRad)を使用して、pDC2-Cas9-gRNAドナープラスミドを熱帯熱マラリア原虫Dd2株にトランスフェクトした。 sgRNA1 または sgRNA2 のいずれかを含むプラスミド (50 μg)、または両方のプラスミドの混合物 (100 μg) を、150 μl の濃縮寄生感染赤血球および完全サイトミックス (120 mM KCl、0.2 mM CaCl2、2 mM EGTA、10μl) と混合しました。 mM MgCl2、25 mM HEPES、5 mM K2HPO4、5 mM KH2PO4; pH 7.6）を加えて総量を 420 μl52にします。 トランスフェクタントは、5 nM WR99210 (Jacobus Pharmaceuticals) を含む完全培地中で 8 日間選択されました。 その後、寄生虫が再び出現するまで、培養物を薬物を含まない完全培地で維持した。 限界希釈を実施して、クローン遺伝子編集寄生虫を単離した（図１Ｂ）。 バルク培養物およびクローン培養物からのトランスフェクタントは、対立遺伝子特異的 PCR およびサンガー配列決定によって遺伝子型特定されました。 プライマーを補足表 5に示します。

突然変異蓄積アッセイは、Dd2-WT および 3 つの Dd2-Polδ クローンを使用して実行されました。 10 ml 中に 1 ～ 5% の寄生虫血症を含む混合段階の寄生虫を 100 日間連続培養しました。 0、20、40、60、80、および100日目に連続培養物から寄生虫を取り出し、96ウェルプレートでの限界希釈によるクローン単離を行った。 各時点からの 1 ～ 3 個の寄生虫クローンを、DNeasy Blood & Tissue Kits (Qiagen) によるゲノム DNA 抽出のために増殖させ、Hiseq X (Illumina) での全ゲノム配列決定を行いました。

アッセイは、試験寄生虫と対照寄生虫をそれぞれ 1% の寄生虫血とともに 1:1 の比率で混合することによって実行されました。 ER hsp70 プロモーター 32 から緑色蛍光タンパク質を発現する Dd2 系統である Dd2-GFP を、6 ウェル プレートで Dd2-WT または Dd2-Polδ と競合する参照寄生虫として使用しました。 クエリおよび競合培養物のヘマトクリットは、Cellometer Auto 1000 (Nexcelom Bioscience) を使用して測定されました。 寄生虫血症は、MitoTracker Deep Red FM (Invitrogen) で寄生虫を染色し、ソフトウェア CytExpert v2.4 を実行する CytoFlex S フローサイトメーター (Beckman Coulter) を使用して計数することによって決定し、FlowJo v10 を使用してさらに分析し、ギムザ後の顕微鏡検査によって計数と寄生虫の段階を確認しました。染色（VWR Chemicals）。 非感染ＲＢＣを、フローサイトメーターでゲーティングするためのシグナルバックグラウンドとして使用した。 競合適応度は、MitoTracker Deep Red 染色による総寄生虫血症とフローサイトメーター上の GFP 陽性対照寄生虫の割合を 20 日間 (約 10 世代) 2 日ごとに測定することによって決定されました。 １００ｎＭのＭｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ Ｄｅｅｐ Ｒｅｄ ＦＭを含有する２００μＬのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ）に４μＬの培養物を入れることにより、９６ウェル丸底プレート（Ｃｏｓｔａｒ）でサンプルを調製した。 プレートを 37 °C で 15 分間インキュベートし、フローサイトメーターで分析しました。 ゲートは、それぞれ GFP 信号および Mitotracker Deep Red FM 信号の FITC (ゲイン 5 または 10) および APC (ゲイン 3 または 5) チャネル用に設定されました。 代表的なゲート戦略を補足図10に示します。3つの技術的複製を使用した2つの独立した生物学的実験を実行しました。

耐性の in vitro 進化には 2 つの化合物、KAE609 (シパルガミン) と Tres Cantos Antimalarial Set で同定され、Medicines for Malaria Venture Malaria Box に含まれる抗マラリア化合物 MMV665794 が使用されました 36,49。 KAE609 の最小接種材料 (MIR) を決定するために、Dd2-WT および Dd2-Polδ クローン H11 のリング段階培養物を含む 3 つの独立したフラスコを、2 × 106、2 × 107、2 × 108 の範囲の接種材料でテストしました。 、および1×109の寄生虫。 各フラスコを、2.5 nM (約 5 × IC50) の KAE609 を含む完全培地中で継続的に培養しました。 この濃度は、ギムザ染色された薄い塗抹標本の顕微鏡検査では検出できないレベルまで寄生虫を殺すことができました（100 個の赤血球の最小 30 視野）。 薬物治療後の寄生虫の死亡と再発は、1～2日ごとに顕微鏡検査を行い、薄い塗抹標本をギムザ染色することによってモニターされました。 ＭＭＶ６６５７９４による選択は、３つの独立したフラスコ内で断続的に薬物に曝露しながら、Ｄｄ２－ＷＴおよびＤｄ２－Ｐｏｌδを用いて実施した（図４Ａに示す）。 初期接種量 1 × 109 の寄生虫を 95 nM の MMV665794 (1 × IC50) に 20 日間継続的に曝露しました。 次に、Dd2-WT を薬物を含まない完全培地で 60 日目まで維持しました。選択後に再び出現した Dd2-Polδ 寄生虫を、その後 40 日目まで 2 倍増量の 190 nM の MMV665794 に曝露しました。寄生虫が増殖するまで薬物圧力を除去しました。検出され、その後、濃度は 3 × IC50 および 4.5 × 108 個の寄生虫の接種で 4 × IC50 まで上昇しました。 選択されたすべての系統について、寄生虫クローンを限界希釈法によって単離し、18 ～ 25 日間増殖させました。 ゲノム DNA 抽出と全ゲノム配列決定のために、薬剤圧力前の寄生虫と薬剤圧力後の生存寄生虫を収集しました。

薬物感受性アッセイは、5% ソルビトールを使用して調製した同期環期寄生虫を使用して 96 ウェル プレートで実施しました。 次のサイクルの環期寄生虫を、２％ヘマトクリット（アッセイプレート中の最終濃度）で１％寄生虫血症まで希釈して、最大成長阻害濃度の半分（ＩＣ５０）アッセイを行った。 濃度範囲は、完全培地中で化合物を２倍段階希釈することによって調製した。 未処理の寄生虫、または５μＭアルテスネートおよびＲＢＣのみ（２％ヘマトクリット）で処理した寄生虫を対照としてアッセイプレートに含めた。 寄生虫の増殖は、72 時間の薬物インキュベーション後に、2 × SYBR Green I (Molecular Probes)53 を含む 2 × 溶解バッファーを使用し、FluorStar Omega v5.11 で測定することによって測定されました。 IC50 分析は GraphPad Prism v8/v9 を使用して実行され、統計的有意性は両側 Mann-Whitney U 検定によって決定されました。 すべてのアッセイは、それぞれ 2 回の技術的反復を伴う 3 ～ 6 回の独立した生物学的実験で実行されました。

寄生虫サンプルを０．１％サポニン中で溶解し、１×ＰＢＳで洗浄し、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｂｌｏｏｄ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を抽出した。 gDNA の濃度は、Qubit dsDNA BR アッセイ キットを使用して定量化し、配列決定の前に Qubit 2.0 蛍光光度計 (Thermo Fisher Scientific) で測定しました。 サンプルを約 450 bp のフラグメントに剪断し、NEBNext UltraII DNA ライブラリー キット (NEB) を使用してライブラリーを構築し、続いてサンプルのプールと Illumina シーケンシング プラットフォーム用の正規化のために qPCR を行いました。 ペアエンドシーケンス (2 × 150 bp) および PCR フリーの全ゲノムシーケンスは HiSeq X (Illumina)54 で実行されました。 サリノポスティン A および KMHA15 に対する耐性について選択されたサンプルを、Illumina MiSeq または NextSeq 550 シーケンス プラットフォームでそれぞれシーケンスし、平均 30 倍のカバレッジ深さで 300 または 150 bp のペアエンド リードを取得しました。

Dd2-Polδ クローンのゲノム配列は、GATK4 のベスト プラクティス ワークフローに従って分析されました55。 各寄生虫クローンからのペアエンド シーケンシング リードを、bwa mem (bwa/0.7.17 = pl5.22.0_2) を使用して、熱帯熱マラリア原虫 3D7 (PlasmoDB-44_Pfalciparum3D7) および Dd2 参照配列 (PlasmoDB-44_PfalciparumDd2) とアライメントしました。 PCR 重複は GATK MarkDuplicates (picard/2.22.2--0) によって削除されました (補足表 6)。 バリアント呼び出しは GATK HaplotypeCaller (gatk/4.1.4.1) によって実行されました。 SNV はフィルタリング基準 (ReadPosRankSum ≥ −8.0、MQRankSum ≥ −12.5、QD ≥ 20.0、SOR ≥ 3.0、FS ≤ 60.0、MQ ≥ 40.0、GQ ≥ 50.0、DP ≥ 5.0) に合格する必要がありました。 ヘテロ接合性コールを持つ変異体、またはコアゲノムの外側に位置する変異体は除外されました（Dd2コアゲノム座標は補足表1に示されています）。 遺伝的変異のアノテーションと機能的効果の予測は、snpEff (v4.3t)56 を使用して決定されました。 転写開始部位は、最近洗練されたデータセットに従ってマッピングされました57

変異蓄積アッセイ中に発生する新規SNVの数は、各寄生虫系統での減算のために0日目に収集されたDd2-WTおよびDd2-Polδのゲノムを使用することによって同定された。 薬剤圧力条件については、減算のために薬剤圧力にさらされていない親系統のゲノムを使用することにより、de novo SNV が同定されました。 薬物なしの条件におけるDd2-WTおよびDd2-PolδにおけるSNV数の有意な変化は、両側Wilcoxonマッチドペア符号付き順位検定(GraphPad Prism v8/v9)によって決定されました。

CNV は、熱帯熱マラリア原虫に適合した GATK 4 ワークフロー 58 によって検出されました 59。 簡単に説明すると、熱帯熱マラリア原虫コアゲノム 60 の遺伝子コード領域全体でリードカウントを収集し、非薬物選択 Dd2 サンプルから構築された正常値のパネルに対してノイズ除去された log2 コピー比を計算しました。 少なくとも 4 つの連続遺伝子が 0.5 以上 (コピー数増加)、または -0.5 以下 (コピー数減少) のノイズ除去された log2 コピー比を示した場合、CNV は保持されました。

各寄生虫系統の突然変異率 (μ) は、寄生虫の連続培養中に発生し、0 日目の寄生虫系統とは異なるすべてのクローン (C) からの新規一ヌクレオチド変異体 (S) の平均数によって決定されました。赤血球のライフサイクル (L) とゲノムサイズ (G) は、以下に示すように計算されました 20,21。 Dd2 の単一の無性血液段階サイクルは 44.1 h20 で計算されました。 Dd2 コアゲノムとコード領域のサイズは、それぞれ 20,789,542 bp と 11,553,554 bp に設定されました (補足データ 2)。 Shapiro-wilk 正規性検定を使用して、SNV データセットの正規分布を調べました。 1 つのサンプルの t 検定を使用して、平均サンプルと 95% 信頼区間を調べました (補足データ 2)。 すべてのテストは R プログラミング (v4.1.3) によって実行され、データは Microsoft Excel (v16) で照合されました。

PfATP4 (PF3D7_1211900) および PfQRP1 (PF3D7_1359900) のタンパク質構造は AlphaFold37 によってモデル化され、比較は DALI サーバー 61 を使用して実行されました。 構造は、PYMOL 分子グラフィックス システムを使用して表示されました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

この記事の基礎となるデータは、補足資料およびソース データ ファイル内で入手できます。 関連するすべての配列データは、NCBI Sequence Read Archive でアクセッション コード ERP110649 (BioProject: PRJEB28444) で入手できます。 ライブラリ名 DN581642P:A7、D7、E7 および DN573783H:A5-12、B5-B12、C5-C12、D5-D8、D10-D12、E5-E12、F5-F12、G6-G7、G9-G12、H4- H12. Dd2 および 3D7 の参照ゲノムと遺伝子注釈データは、PlasmoDB で入手できます (Dd2 は https://plasmodb.org/common/downloads/release-44/PfalciparumDd2/ で、3D7 は https://plasmodb.org/common/downloads/ から入手できます) release-44/Pfalciparum3D7/)。 ソースデータはこのペーパーに付属しています。

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建設的なフィードバックをくださったリー研究室の現メンバーおよび元メンバーに感謝いたします。 シーケンスに関するサポートをしていただいた Liz Huckle と Sanger Scientific Operations のスタッフに感謝します。 Kotanan N. のアートワークに感謝します。 ビル＆メリンダ・ゲイツ財団からMCSL、DAF、GSK、EAW（OPP1054480）、DAF（INV-033538）への資金提供、Wellcome Institutional Translational Partnership award（ITPA）およびマヒドン大学からの資金提供に感謝いたします。 TK と TC、および Wellcome [206194/Z/17/Z] から MCSL と Wellcome Sanger Institute への資金提供。

ウェルカム サンガー研究所、ウェルカム ゲノム キャンパス、ヒンクストン、英国

クリティコーン・クンポルシン、ジョハンナ・ホシザキ、ムクル・ラワット、リチャード・D・ピアソン、マーカス・CS・リー

Calibr、スクリップス研究所部門、米国カリフォルニア州ラホーヤ

クリティコーン・クンポルシン

スウェーデン分子感染医学研究所およびウメオ大学分子生物学部（スウェーデン、ウメオ）

ティーララット コチャカーン & タナット チョーカジョーン

コロンビア大学アービング医療センター、微生物学および免疫学部、ニューヨーク州ニューヨーク州、米国

トーマス・ヨー、ジョン・オコンボ、カイラ・A・シンドラー、サチェル・モク、デヴィッド・A・フィドック

カリフォルニア大学サンディエゴ医学部小児科、ラホーヤ、カリフォルニア州、米国

マデリーン・R・ルース＆エリザベス・A・ウィンゼラー

コロンビア大学アービング医療センター医学部感染症部門マラリア治療および抗菌薬耐性センター、米国ニューヨーク州ニューヨーク

サシェル・モク、アン・カトリン・ウーレマン、デヴィッド・A・フィドック

米国ニューヨーク州ニューヨーク、コロンビア大学アービング医療センター医学部感染症部門

ヒクク・パーク & アン・カトリン・ウーレマン

TCG Lifesciences Private Limited、ソルトレイク エレクトロニクス コンプレックス、コルカタ、インド

ゴウランガ P. ヤナ & ビカシュ C. マイティ

Medicines for Malaria Venture、International Centre Cointrin、ジュネーブ、スイス

ブノワ・ラルー、エロディ・チェヌ、ジェームス・ダフィー

Global Health Medicines R&D、GlaxoSmithKline、トレス・カントス、マドリッド、スペイン

ソニア・モリナー・キューベル、ヴァージニア・フランコ、マリア・G・ゴメス＝ロレンソ、フランシスコ・ハビエル・ガモ

タイ、バンコクのマヒドン大学熱帯医学学部、マラリア研究センター、ゲノミクスおよび進化医学ユニット

タナト・チョカジョーン

生物化学および創薬、ウェルカム抗感染症研究センター、ダンディー大学、ダンディー、英国

マーカス CS リー

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KKとMCSLがこの研究を発案した。 KKはDd2-Polδ寄生虫株を作製し、突然変異蓄積実験を実施した。 KK と MR は寄生虫トランスフェクションを実行しました。 KK、KAS、SMC、VF、および MGG は、in vitro 薬物選択実験を実施しました。 薬物感受性および交差耐性アッセイは、KK、JO、MR、KAS、MCSLHP によって実施され、ACU は全ゲノム配列データの生成に貢献しました。 GPJ、BCM、BL、EC、JD が化合物の合成に貢献しました。 全ゲノム配列データは、KK、TK、TY、MRL、JH、RP、SMKKによって分析され、FJG、EAW、DAF、TC、MCSLが実験を概念化し、計画し、研究を監督しました。 著者全員が論文の執筆に貢献しました。

マーカスCSリーへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Nature Communications は、この研究の査読に貢献してくれた岩永史郎氏、三田敏宏氏、およびその他の匿名の査読者に感謝します。 査読ファイルが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

Kümpornsin、K.、Kochakarn、T.、Yeo、T. 他。 熱帯熱マラリア原虫におけるレジストームの発見を推進するためのミューテーター寄生虫の生成。 Nat Commun 14、3059 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41467-023-38774-1

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受信日: 2022 年 8 月 23 日

受理日: 2023 年 5 月 12 日

公開日: 2023 年 5 月 27 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-38774-1

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