一酸化窒素はマウスのネズミチフス菌全身感染の宿主の手がかりである - 株式会社コーストワイズ・ベンチャーズ・グループ

Communications Biology volume 6、記事番号: 501 (2023) この記事を引用

575 アクセス

1 オルトメトリック

メトリクスの詳細

一酸化窒素 (NO) は、微生物感染に対する自然免疫応答として生成されます。ヒト胃腸炎の主な原因病原体であるネズミチフス菌（S. Typhimurium）は、マウスにおいてより重篤な全身疾患を誘発します。しかし、種に関連した毒性の違いに寄与する宿主要因は不明です。今回我々は、宿主のNO産生がサルモネラ病原性アイランド2（SPI-2）を活性化することにより、感染初期のマウスマクロファージにおけるネズミチフス菌の複製を促進することを報告する。 NO シグナル伝達によって誘導される SPI-2 活性化は、Fnr および PhoP/Q の 2 成分系によって媒介されます。 NOはfnr転写を有意に誘導したが、FnrはphoP/Q転写を直接活性化した。マウス感染アッセイでは、感染初期に全身臓器における細菌負荷が NO に依存して増加することが明らかになり、宿主 NO が病原性に早期に寄与していることが示されました。この研究は、ネズミチフス菌の宿主シグナル伝達を介した病原性活性化経路がマウスの全身感染に大きく寄与していることを明らかにし、サルモネラ菌の病因と宿主と病原体の相互作用についてのさらなる洞察を提供する。

活性酸素種 (ROS) や活性窒素種 (RNS) の生成を含む自然免疫応答は、侵入する病原体の複製と拡散を制限することにより、微生物感染に対する宿主防御の第一線となります 1。一方で、微生物病原体は自然免疫応答に拮抗する戦略を開発しており、それらの応答を自らの毒性を促進するシグナルとして利用するものさえあります 2,3。宿主の自然免疫機能と病原体の毒性メカニズムの間の相互作用が、ほとんどの感染症の結果を大きく決定します4。

サルモネラ菌は、人間や動物にさまざまな病気を引き起こす重要な細胞内病原体です。サルモネラ菌による感染症は、発展途上国と先進国の両方で大きな負担となっており、毎年 1 億 1,000 万人以上のヒト感染者が報告されています 5,6。血清型と宿主の組み合わせに応じて、サルモネラ感染症は一般に消化管に局在して軽度の胃腸炎を引き起こすか、腸管外にさらに拡散して腸チフスなどの重度の全身疾患を引き起こすかのどちらかです7、8、9。 Salmonella enterica 血清型 Typhimurium (S. Typhimurium) はヒト胃腸炎の主な原因物質ですが、マウスでは腸チフス様の全身感染症を誘発する可能性があります 10,11。ネズミチフス菌がどのように宿主と異なって相互作用し、マウスに重篤な毒性をもたらすのかは明らかではない。

宿主マクロファージ内で生存および複製する能力は、ネズミチフス菌の全身感染に不可欠です12、13。したがって、ネズミチフス菌は、サルモネラ病原性アイランド 2 (SPI-2) によってコードされる特定の III 型分泌システム (T3SS) を必要とする方法で、マウスのマクロファージ内で多数複製します14。 SPI-2 遺伝子の発現は、すべての SPI-2 オペロンのマスター制御因子である、SPI-2 によってコードされる SsrA (内在性膜同族センサー)/SsrB (応答制御因子) の 2 成分制御システム (TCS) の制御下で行われます。陽イオン欠乏、リン酸欠乏、自然免疫応答によって生成されるファゴソームの酸性化など、さまざまな宿主の合図による食作用の際に誘導されます15、16。 SPI-2にコードされたT3SSは、SPI-2の内部と外部の両方でコードされたエフェクタータンパク質を宿主細胞に注入し、ネズミチフス菌が生存するサルモネラ含有液胞（SCV）と呼ばれる特殊な膜結合区画の形成を誘導します。そして複製17、18、19。ネズミチフス菌の SPI-2 変異体は、初代マウス腹膜マクロファージ (PM) および RAW264.7 や J774A.120、21、22 などのマウスマクロファージ細胞株で細胞内増殖欠陥を示し、全身感染では高度に減弱することが判明しました。マウスモデルは経口、腹腔内（ip）、または静脈内に感染しました20、22、23、24。 SPI-2 の発現は、ネズミチフス菌の複製の許容性が低いヒトマクロファージでも誘導されますが、誘導レベルはマウスマクロファージで観察されるものよりもはるかに低く 25,26 、これは SPI-2 に対する宿主特異的合図の存在を示しています。 2 マウスマクロファージの活性化。

RNS のプロトタイプである一酸化窒素 (NO) は、アルギニンをシトルリンと NO に変換する誘導性一酸化窒素合成酵素 (iNOS) による微生物感染に対する自然免疫応答として生成されます27,28。 ROS は病原体を最初に殺す役割を果たしますが、RNS は感染臓器および感染マクロファージ内の後期段階でのネズミチフス菌の複製を阻害すると報告されています 29,30。しかし、NO 自体は弱い抗菌活性しか示しません 31。注目すべきことに、ネズミチフス菌に感染したマウスマクロファージ (5 ～ 20 μM) で NO 産生が検出されました 32,33。しかし、ヒトのマクロファージは、ネズミチフス菌の複製に対する許容性が低いため、一般に低レベルの iNOS 発現を示し、無視できる量の NO34、35、36、37 を生成します。これは、宿主の NO 産生と SPI-2 発現およびネズミチフス菌の複製との間に正の相関があることを示唆しています。興味深いことに、ネズミチフス菌は SCV 内に存在することで ROS と RNS の両方との直接接触を避けています 33,38。しかし、NO は SCV 内に自由に拡散するため、宿主の NO 産生がマウスにおける重篤なネズミチフス菌の毒性に寄与するかどうかは興味深い。

TCS は、細菌が環境または細胞パラメーターを感知して応答し、変化する条件に適応することを介したシグナル伝達経路です 39。ネズミチフス菌の病原性機能のマスター調節因子である PhoP/Q TCS は、一般に、複数の宿主の合図を感知することにより、転写レベルの ssrB と転写後レベルの ssrA の両方を介して SPI-2 を活性化します 40。 PhoP/Q システムを欠くネズミチフス菌変異体は、マウスにおける毒性が高度に弱毒化されており、マクロファージ内で生存できないため、PhoP/Q によるマクロファージ内シグナル感知は、SPI-2 を介したマウスにおけるネズミチフス菌の毒性にとって重要です 40,41。 42. PhoP/Q が宿主の NO 生成を感知するか応答するかどうかは調査されていません。

Fnr はよく知られた世界的な嫌気性調節因子であり、O2 利用可能性の変化に遭遇する多くの細菌性病原体の毒性に寄与しています 43,44,45。 Fnrはネズミチフス菌の全身感染にも必要である。これは、fnr変異体が経口感染マウスと腹腔内感染マウスの両方で完全に弱毒化されており、fnrの欠如によりPMs内でネズミチフス菌が複製する能力が劇的に低下するためである46。マイクロアレイベースのトランスクリプトーム解析により、ネズミチフス菌において、Fnr は多くの侵入関連病原性遺伝子を正に制御するが、SPI-2 には影響を及ぼさないことが明らかになりました 46。この研究は、Luria-Bertani (LB) で非 SPI-2 誘導条件である対数期まで増殖させたネズミチフス菌を使用して実施されたため 16、Fnr が宿主マクロファージにおける SPI-2 誘導に寄与するかどうかは不明です。 Fnr は細菌の NO 応答性調節因子としても知られています 44。 NO への結合は、Fnr の [4Fe-4S]2+ クラスターと反応して Fnr を不活性化し、それによって Fnr 調節遺伝子の発現に影響を与えます 45。 NO が fnr の転写レベルに影響を与えるかどうかは不明です。

この研究では、マウス感染アッセイ、ゲンタマイシン防御アッセイ、RNA シーケンス (RNA-seq)、SPI-2 遺伝子 (ssrA) プロモーター置換分析などを使用して、マウスのネズミチフス菌全身感染に対する宿主 NO 産生の寄与が調査されました。他の分子技術。われわれは、宿主のNO産生がSPI-2を活性化することによりマウスマクロファージにおけるネズミチフス菌の複製を促進し、感染初期段階で感染マウスの肝臓および脾臓における細菌負荷を増加させることを発見した。さらなる研究により、NOシグナル伝達によって誘導されるSPI-2活性化がFnrおよびPhoP/Qによって媒介されることが明らかになった。したがって、この研究は、自然免疫系によって生成される NO がマウスにおけるネズミチフス菌の病原性活性化の宿主の手がかりであることを明らかにし、サルモネラの病因についてのさらなる洞察を提供します。

以前の研究では、ネズミチフス菌感染に反応してマウスでは NO が産生されるが、ヒトのマクロファージではほとんど産生されないことが報告されており 32,33,47 、これは今回で確認された。ネズミチフス菌野生型株 ATCC 14028 s による 24 時間の感染期間中に、マウス RAW264.7 では最大 20 μM の NO (以前に報告された範囲内) が検出されましたが、ヒト U937 マクロファージ細胞では 1 μM 未満が検出されました (図.1a)。ヒトTHP-1細胞でもごくわずかなNO生成が検出されました（補足図1a）。 LPS処理によるRAW264.7細胞とU937細胞の間のNO生成の違いがさらに確認されました（補足図1b）。マウス（高）とヒト（低）に異なる毒性を与えるネズミチフス菌は、ヒトのマクロファージよりもマウスのマクロファージでよりよく複製しました48。一致して、ゲンタマイシン保護アッセイによって示されるように、ネズミチフス菌の細胞内細菌負荷は、U937細胞よりもRAW264.7細胞の方がはるかに高かった（図1b）。 NO 産生と細胞内細菌負荷の違いは、初代マウス骨髄由来マクロファージ（BMDM）と初代ヒト末梢血単核細胞（PBMC）でさらに確認されました（補足図1c、d）。細菌負荷の増加は、RAW264.7 細胞（16 時間で 17.4 倍）よりも BMDM（16 時間で 3.2 倍）の方が小さかった。これはおそらく、RAW264.7 細胞ではインフラマソーム活性化が存在しないためであると考えられる。インフラマソームアダプタータンパク質 ASC を発現しません。

a ネズミチフス菌野生型株ATCC 14028に感染したRAW264.7細胞およびU937細胞による亜硝酸塩生成。 RAW264.7細胞およびU937細胞をMOI 10で感染させ、上清中の亜硝酸塩レベルを指定の時点でグリースアッセイを使用して測定しました(n = 3の独立した実験)。 b RAW264.7およびU937細胞におけるネズミチフス菌野生型の細菌負荷。細菌のCFU（×105）/ウェル（y軸）およびゲンタマイシン添加後の時間（x軸）を示す（n = 3回の独立した実験）。 c RAW264.7細胞では、U937細胞よりもネズミチフス菌SPI-2遺伝子の発現が高い。 RAW264.7 細胞と U937 細胞を野生型ネズミチフス菌に 8 時間感染させ (MOI = 10)、その後細胞を溶解し、RNA 抽出と RNA-seq のために細胞内細菌を収集しました (R8: RAW264.7 8 時間) ; U8、U937 8 h)。 RPMI-1640培地中の細菌から抽出したRNAを対照(Con)として使用した(n = 3の独立した実験)。データは補足表 1 から取得したものです。すべてのデータは平均 ± SD として表示されます。 P 値は、二元配置 ANOVA を使用して決定されました (a、b)。感染後 hpi 時間。ソースデータは補足データ 1 に含まれています。

SPI-2はマウスマクロファージにおけるネズミチフス菌の複製に必要である49ため、RAW264.7細胞におけるSPI-2発現の誘導は、RNA-seqプロファイリング（図1cおよび補足表1）および定量的リアルタイムPCRによって確認されました（ 7つのSPI-2遺伝子（ssrA、ssrB、sipC、ssaE、sscA、sifA、ssaV;補足図1e）のqRT-PCR）分析。 U937細胞におけるSPI-2の発現も誘導されましたが、そのレベルはRAW264.7細胞よりも大幅に低かった（図1cおよび補足表1）。したがって、宿主のNO産生とマウスマクロファージにおけるネズミチフス菌のSPI-2発現および複製レベルの間には正の相関があり、自然免疫応答によって産生されるNOがマウスの全身感染時のネズミチフス菌の毒性に寄与している可能性があることを示唆している。

マウスマクロファージにおけるNO産生がネズミチフス菌の毒性に寄与しているかどうかを調べるために、感染の2時間前にRAW264.7細胞をiNOSの競合阻害剤であるL-NMMAで処理し、NO産生とSPI-2遺伝子の発現を阻害した。処理細胞と未処理細胞における感染期間中のさまざまな時点で評価しました。未処理の細胞と比較して、代表的な SPI-2 遺伝子である ssaG の発現レベルは、qRT-PCR 分析によって測定されたように、L-NMMA 処理 RAW264.7 細胞において 24 時間の感染期間の各時点で有意に減少していました (図.2a)。 C57BL/6 マウスからの初代 PM を使用しても同じ結果が得られました (図 2b)。処理および未処理のRAW264.7細胞およびPMには、感染後15分で同等の数の細胞内細菌が含まれていたため、L-NMMAの添加はマクロファージによる細菌の取り込みに影響を与えませんでした（補足図2a）。さらに、NOを産生できないiNOS-/- PM（iNOS免疫不全C57BL/6マウス由来のiNOS欠損マクロファージ）でも、野生型C57BL/6マウスに比べてssaGの発現量が有意に減少していた。 PM（図2c）。 NOの補給により、iNOS-/- PMにおけるssaG発現が増加しました（図2d）。したがって、マウスマクロファージにおけるNO産生は、ネズミチフス菌におけるSPI-2発現を促進する。

a-c RAW264.7細胞（a）、C57BL/6マウスの腹膜マクロファージ（PM）（b）、およびiNOS-/-マウスのPM（c）におけるネズミチフス菌ssaG mRNAレベルのqRT-PCR分析。は、50 μM L-NMMA の存在下または非存在下での時点を示しています (n = 3 回の独立した実験)。 d 20μM NOの存在下または非存在下での感染後4、8、16、および24時間（hpi）のiNOS-/-マウスからのPMにおけるssaG発現のqRT-PCR分析（n = 3の独立した実験）。 e、f、h 指定された時点での RAW264.7 細胞 (e)、C57BL/6 マウスからの PM (f)、および iNOS-/- マウスからの PM (h) における野生型ネズミチフス菌の細菌負荷の増加50 μM L-NMMA の存在または非存在下でのポイント (n = 3 回の独立した実験)。 g RAW264.7 細胞あたりの細胞内細菌の数 (3 つの独立した実験からプールされたグループあたり n = 75 細胞)。細胞あたりの細菌の数をランダムなフィールドでカウントしました。 −、未処理。 +、50μM L-NMMAの添加。代表的な免疫蛍光画像（8、12、および24 hpi）を補足図2bに示します。 i20μM NOの存在下または非存在下での、示された時点でのiNOS-/-マウス由来のPMにおけるネズミチフス菌野生型細菌負荷の増加（n = 3の独立した実験）。 j 50μM L-NMMAの存在下または非存在下での、指定された時点でのRAW264.7細胞におけるネズミチフス菌ssrB変異体の複製（n = 3の独立した実験）。 k 野生型ネズミチフス菌野生型を腹腔内（ip）感染させた野生型マウスおよびiNOS-/- C57BL/6マウスの、感染後の示された時点での肝臓および脾臓から回収された細菌数、毎日n = 2匹のマウス。すべてのデータは平均値 ± SD として表示されます。 P 値は、二元配置分散分析 (a – f、h – k) または両側対応のないスチューデント t 検定 (g) を使用して決定されました。 hpi 感染後時間、dpi 感染後日数。ソースデータは補足データ 1 に含まれています。

SPI-2はマウスマクロファージにおけるネズミチフス菌の複製に必要であるため、宿主のNO産生がマウスマクロファージにおけるネズミチフス菌の複製に寄与するかどうかを調べた。複製アッセイは、未処理および L-NMMA 処理した RAW264.7 細胞および C57BL/6 マウス PM で実行されました。未処理細胞と比較して、ネズミチフス菌の細胞内負荷は、初期感染段階（最初の4〜12時間）でL-NMMA処理細胞で大幅に減少しました（図2e、f）。免疫蛍光計数により、感染後12時間のL-NMMA処理RAW264.7細胞における細菌数が減少していることがさらに確認されました（図2gおよび補足図2b）。ただし、未処理細胞で増殖が阻害された後の段階（20および24時間）では、L-NMMA処理細胞で細菌負荷の増加が検出されました（図2e〜gおよび補足図2b）。同様の結果が、iNOS-/- マウスから単離されたマクロファージでも観察された(図2h)。 NOの補給により、初期感染段階（最初の4〜12時間）のiNOS-/- PMにおけるネズミチフス菌の細胞内負荷が増加しました（図2i）。これらの結果は、宿主のNO産生がマウスマクロファージの感染初期段階ではネズミチフス菌の複製を促進する一方、後期段階では複製を阻害することを示した。ネズミチフス菌の複製に対するNOの作用にSPI-2が必要かどうかを検証するために、SPI-2遺伝子を発現できないssrB変異体（補足図2c）を生成し、NO依存性複製について評価しました。複製におけるSPI-2の本質的な役割と一致して、ssrB変異体は未処理の細胞では複製しませんでした（図2j）。興味深いことに、ssrB変異体は、感染初期段階ではL-NMMA処理RAW264.7細胞内で複製しなかったが、後期段階では複製し（図2j）、宿主NO産生がSPIを活性化することにより感染初期段階でネズミチフス菌の複製を促進することを示している。 -2 を生成し、SPI-2 の活性化とは独立した方法で後の段階で複製を阻害します。したがって、NO は、感染初期段階のマウスマクロファージにおける SPI-2 依存性複製の宿主の合図となります。

ネズミチフス菌全身感染に対する宿主NO産生の寄与を、腹腔内感染C57BL/6野生型マウスとiNOS-/-マウスの全身臓器(肝臓および脾臓)における細菌負荷を比較することによって、インビボでさらに調査した。 ROS は、マクロファージによる摂取したサルモネラ菌の早期死滅に必須であり、RNS は感染後期におけるサルモネラ菌の複製の制御に関与していると報告されています 30。一貫して、野生型マウスとiNOS-/-マウスはどちらも感染後の最初の6日間は同様に生存しました（補足図2d）。しかし、野生型マウスは、感染後の最初の3日間（肝臓）または4日間（脾臓）にiNOS-/-マウスよりも肝臓および脾臓の細菌負荷が高かった（図2k）。これは、NO産生がSを促進することを示している。感染初期段階におけるネズミチフス菌の細胞内複製は、マクロファージ複製アッセイと一致した（インビトロの結果）。対照的に、iNOS-/- マウスでは感染後 5 日目から細菌負荷が野生型マウスよりも有意に高く（図 2k）、これは以前に報告されている感染後期におけるサルモネラ菌に対する NO の静菌活性と一致しています 30。静脈内（iv）感染した野生型マウスは、感染後2日目に測定されたように、肝臓および脾臓における細菌負荷がiNOS-/-マウスよりも高かった（補足図2e）。感染の初期段階は感染経路とは関係ありません。これらの結果は、NO が、感染の初期段階で細胞内複製を促進することによってネズミチフス菌の毒性に寄与する生体内宿主シグナルであることを確認しました。

宿主の NO 産生が感染初期および後期のネズミチフス菌の複製に対して反対の効果を示したので、感染初期のネズミチフス菌複製に対する NO の寄与の重要性を調査しました。 NO は SPI-2 発現を誘導することによってネズミチフス菌の複製を促進するため、複製に対する SPI-2 発現レベルの影響を評価して NO 産生の寄与を決定しました。 7 つの ssrA (SPI-2 遺伝子のマスター制御因子) プロモーター置換誘導体が生成されました (補足表 2)。 ssrA プロモーターの置換用のプロモーターは、RNA-seq データの RAW264.7 細胞での発現レベルに基づいて選択されました。 ssrA プロモーターの置換は、オーバーラップエクステンション PCR および Red 組換えシステムによって実行されました (詳細については、材料と方法を参照)。これらは、RAW264.7 細胞において SPI-2 遺伝子を野生型レベル (P1150::PssrA、PsinR::PssrA、PyfiR::PssrA、PaceB::) の 5.8 倍低いレベルから 2.6 倍高い範囲のさまざまなレベルで発現しました。 PssrA、PphnA::PssrA、P2773::PssrA、およびP0658::PssrA）は、感染後8時間（hpi）でのssrAのqRT-PCR分析によって検証されました（図3a）。 RAW264.7細胞内の他の4つの代表的なSPI-2遺伝子（ssaE、sscA、ssaG、およびsifA）の発現は、各派生株のssrA遺伝子の発現とよく相関しており（補足図3a）、これらの派生株を用いてマクロファージ内のSPI-2遺伝子を実現した。

異なるプロモーター置換株におけるネズミチフス菌 ssaG mRNA レベルの qRT-PCR 分析 (n = 3 の独立した実験)。 8 hpi で RAW264.7 細胞または U937 細胞から収集した細菌から RNA を抽出しました。 RPMI-1640培地中の細菌から抽出したRNAを対照として使用した。 b、c RAW264.7細胞（b）およびC57BL/6マウス由来のPM（c）におけるネズミチフス菌野生型およびプロモーター置換株の細菌負荷の増加（n = 3の独立した実験）。 d 〜5×103 CFUの野生型またはプロモーター置換株を腹腔内（ip）接種した後のマウスの生存プロット。 n = 1 グループあたり 15 匹のマウス。 e ネズミチフス菌野生型株およびプロモーター置換株に腹腔内感染させたマウスの肝臓および脾臓から回収された細菌数。 n = 1 グループあたり 6 ～ 8 匹のマウス。すべてのデータは平均値 ± SD として表示されます。 P 値は、両側非対応一元配置分散分析 (a-c)、ログランク曲線比較検定 (d)、またはマン-ホイットニー U 検定 (e) を使用して決定されました。ソースデータは補足データ 1 に含まれています。

マクロファージ複製アッセイは、RAW264.7 細胞およびマウス PM 16 hpi の 7 つの派生株を用いて実行されました。この時点で、高い細胞内細菌負荷と高いNO生成が検出されました（図1aおよび補足図1c）が、細胞死は有意ではありませんでした（補足図3b）。我々は、野生型ネズミチフス菌および同様のSPI-2レベル（PphnA::PssrA）またはより高いSPI-2レベル（P0658::PssrAおよびP2773::PssrA）を発現する誘導体における細菌負荷の増加が、低レベルのSPI-2レベルよりも有意に高いことを発見した。 RAW264.7 細胞と PM の両方で SPI-2 誘導体 (P1150::PssrA、PsinR::PssrA、PyfiR::PssrA、および PaceB::PssrA) を発現しており、SPI-2 発現レベルと複製率の間に正の相関があることが示唆されています。マクロファージにおいて（図３ｂ、ｃ）。低SPI-2発現誘導体（P1150::PssrA、PsinR::PssrA、PyfiR::PssrA、およびPaceB::PssrA）は、LB培地で野生型と同様に成長し（補足図3c）、RAW264に感染しました。 .7細胞は野生型と同じくらい効率的であり（補足図3d）、マクロファージにおけるこれらの誘導体の複製能力の低下は、増殖欠陥または感染能力の低下によるものではないことを示しています。結果は、マウスマクロファージにおけるネズミチフス菌の複製レベルがSPI-2発現レベルと正の相関があることを示しています。

次に、ネズミチフス菌の毒性に対する SPI-2 発現レベルの影響をさらに検証するために、マウス感染アッセイを実施しました。野生型ネズミチフス菌および同等レベル（PphnA::PssrA）またはそれ以上のレベルのSPI-2（P0658::PssrAおよびP2773::PssrA）を発現する誘導体に感染したマウスの死亡率は、ネズミチフス菌に感染したマウスの死亡率よりも有意に高かった。下位 – SPI-2 – 発現誘導体 (P1150::PssrA、PsinR::PssrA、PyfiR::PssrA、および PaceB::PssrA)。前者のグループのマウスはすべて12日目までに死亡しましたが、後者のグループのマウスの22〜76％が20日間のモニタリング期間にわたって生存しました（図3d）。予想通り、SPI-2発現レベルと感染マウスの生存率の間には負の相関関係が得られました（図3d）。一貫して、SPI-2発現レベルは、コロニー計数に基づいて、感染後3日目の感染マウスの全身臓器（肝臓および脾臓）の細菌量と正の相関がありました（図3e）。この結果は、マウスの全身感染時のネズミチフス菌の毒性が SPI-2 発現レベルに依存していることを示しています。したがって、ネズミチフス菌の全身感染には、高レベルのSPI-2発現を誘導してマウスマクロファージの複製を増強することによるNOシグナル伝達が必要である。

NOシグナル伝達が存在しない場合、RAW264.7細胞ではSPI-2発現が2.4倍減少し（図2a）、これはssrA置換変異体PyfiR::PssrAにおけるSPI-2発現レベルと同様でした（図2a）。 3a)。 NOシグナルの欠如による毒性の弱毒は、マウスで毒性の大幅な低下を示したPyfiR::PssrAの毒性と同様である可能性があると推測できます（図3d、e）。 RAW264.7細胞におけるNO産生は、PyfiR::PssrA変異の影響を受けませんでした（補足図3e）。したがって、NO 生成の欠如は、少なくとも部分的に、ヒトにおける毒性の低下に寄与します。

NO依存性SPI-2活性化のシグナル伝達経路を調査するために、我々はまず既知のSPI-2調節因子の関与の可能性を検討した。 RNA-seqによって示され、qRT-PCRによって確認されたように、phoPおよびslyA（PhoPによって調節される遺伝子）の発現は、示差的な誘導に従って、ヒトマクロファージよりもマウスでより高いレベルに誘導されました（補足表3）。 SPI-2遺伝子の。マウスRAW264.7細胞およびPMにおけるL-NMMAによるNO産生を阻害すると、phoP転写が減少し（図4a）、NO産生がマウスマクロファージにおけるphoP転写を増強することが示された。マウスマクロファージにおけるSPI-2誘導におけるPhoPの本質的な役割を考慮すると、ssaGは、未処理およびL-NMMA処理したRAW264.7細胞およびPMの両方で予想されたようにphoP変異体によって発現されず（図4b）、PhoPがNO 媒介 SPI-2 活性化に必要です。したがって、マウスマクロファージにおけるより高いSPI-2発現は、NOによって増強されたPhoP活性によるものでした。インビトロ分析により、phoP / Q発現は低O2条件下ではNO（20μM）によって有意に増強されたが、高O2条件下では有意に増強されなかったことがさらに明らかになり（図4c、d）、これは宿主条件（低O2）下でのNOに対する応答が示されていることを示している。 PhoP/PhoQ による影響は、嫌気性調節因子などの他の調節因子によって媒介されている可能性があります。

50μM L-NMMAの存在下または非存在下でのRAW264.7細胞またはPMにおけるネズミチフス菌野生型phoP mRNAレベルのqRT-PCR分析（n = 3の独立した実験）。 RAW264.7細胞またはPMをMOI 10で野生型株に感染させました。L-NMMAを50μMの濃度で添加しました。細胞懸濁液から収集した細菌の発現と比較した、16 hpi での細胞内細菌の phoP 遺伝子発現の変化倍数を示します。 b 50μM L-NMMAの存在下または非存在下での野生型およびphoP変異体におけるネズミチフス菌ssaG mRNAレベルのqRT-PCR分析（n = 3の独立した実験）。 RAW264.7細胞またはPMをMOI 10で野生型またはphoP変異体に感染させました。指示されている場合、L-NMMAを50μMの濃度で添加しました。 16 hpi で、phoP 変異体での発現と比較した野生型での ssaG 遺伝子発現の変化倍数が表示されます。 c、d 低O2条件（c）または高O2条件（d）のいずれかで、20μM NOの存在下または非存在下でのネズミチフス菌野生型phoPおよびphoQ mRNAレベルのqRT-PCR分析（n = 3の独立した実験）。野生型細菌を、20μM NOの存在下または非存在下、低O2または高O2条件下でN-最小培地中で増殖させた。未処理サンプルと比較した、NO の存在下での phoP および phoQ 発現の変化倍数が表示されます。すべてのデータは平均値 ± SD として表示されます。 P 値は、両側対応のないスチューデントの t 検定 (a) または二元配置分散分析 (b–d) を使用して決定されました。ソースデータは補足データ 1 に含まれています。

RNA配列データに基づくと、NO応答性の全体的な嫌気性調節因子をコードするfnrの発現は、マウスRAW264.7細胞(14.6倍)ではヒトU937細胞(3.7倍)よりもはるかに高いレベルまで誘導された。（補足表4）、L-NMMAを使用してマウスRAW264.7細胞におけるNO産生を阻害すると、fnr転写レベルが顕著に低下し（図5a）、fnr転写におけるNOの役割が示されました。 phoPおよびssaGの発現は、fnrの欠失によって下方制御され、RAW264.7細胞におけるその過剰発現によって増強されました（図5b）。これは、FnrがマウスマクロファージにおけるPhoP誘導性のSPI-2活性化に必要であることを示しています。 fnr の欠失と過剰発現による phoP と ssaG の発現の下方制御と上方制御は、それぞれ、NO の非存在下、低 O2 条件下で N 最小培地で培養された細菌でも in vitro で検出され、NO の存在下ではより強く検出されました。これは、Fnr依存性のPhoP/Qを介したSPI-2の活性化が、マウスマクロファージにおけるNO産生によって増強されることを示しています（図5c）。 fnr変異体は、マウスマクロファージにおける細菌負荷の大幅な減少を示し、phoPおよびSPI-2遺伝子の活性化におけるその役割と一致しました（図5d）。

50μM L-NMMAの存在下または非存在下での、RAW264.7細胞の感染後の指定の時点でのネズミチフス菌野生型におけるfnr mRNAレベルのqRT-PCR分析（n = 3の独立した実験）。 b RAW264.7細胞の感染後16時間における野生型、fnr変異株、またはfnr過剰発現株におけるphoPおよびssaG mRNAレベルのqRT-PCR分析（n = 3の独立した実験）。 c 20μM NOの存在下または非存在下でN最小培地で増殖させた野生型、fnr変異体、またはfnr過剰発現株におけるphoPおよびssaG mRNAレベルのqRT-PCR分析（n = 3の独立した実験）。 d 16 hpiでのRAW264.7細胞における野生型、fnr変異体、またはfnr過剰発現株の細菌負荷の増加（n = 3の独立した実験）。 e 精製Fnrタンパク質を用いたphoPプロモーターの電気泳動移動度シフトアッセイ(EMSA)。画像は 3 つの独立した実験の代表です。 EMSAの完全なゲルを補足図4に示します。 f Fnr-クロマチン免疫沈降（ChIP）サンプルにおけるphoPプロモーターの濃縮倍数（n = 3の独立した実験）。 g 示された濃度のNOの存在下、N-最小培地で増殖させた野生型株におけるfnrおよびssaG mRNAレベルのqRT-PCR分析（n = 3の独立した実験）。 h 示された濃度のNOの存在下でのFnrタンパク質の濃度(n = 3の独立した実験)。 Nは分子番号を示します。野生型ネズミチフス菌は、NO 生成物質であるスペルミン NONOate の存在下または非存在下、低 O2 条件下で N-minimal 培地中で増殖されました。細菌内の総 Fnr タンパク質含有量は、ELISA を使用して推定されました。 Fnrの[4Fe-4S]クラスターと8つのNO分子との反応に基づいて、NO不活化Fnr分子を計算し、残存機能性Fnrタンパク質分子を計算した。すべてのデータは平均値 ± SD として表示されます。 P 値は、二元配置分散分析 (a – c、f – h) または一元配置分散分析 (c) を使用して決定されました。ソースデータは補足データ 1 に含まれています。

電気泳動移動度シフトアッセイ（EMSA）分析により、精製Fnrタンパク質がin vitroでphoPQのプロモーターに結合することが示されました（図5eおよび補足図4）。クロマチン免疫沈降定量的PCR（ChIP-qPCR）分析により、FnrとphoPQプロモーターとの結合がさらに実証されました（図5f）。これらの結果は、Fnr がそのプロモーターに結合することによって phoPQ を直接活性化したことを示しています。

in vitro 分析により、fnr の発現は、マウス RAW264.7 細胞のレベル (10 ～ 20 μM) に相当する 10 ～ 40 μM (スペルミン NONOate 由来) の NO 濃度の増加に伴って増加したが、それ以上の濃度では影響を受けなかったことがさらに明らかになりました。レベルのNO濃度（200μM）（図5g）。 NO濃度依存的なfnr発現の増強に加えて、ssaG発現は増加することがわかったが、それは低O2条件下でのみであり、これは高O2条件下でのFnrの不活性化と一致する（図5g）。したがって、Fnr はマウスマクロファージにおける NO 産生を感知し、それに応答してその転写を増強し、Fnr を介した SPI-2 の活性化を増強します。

NO に結合すると、タンパク質内の [4Fe-4S] クラスターのニトロシル化により Fnr が不活性化されるため 44、Fnr を介した SPI-2 活性化の NO 濃度依存性の増強は、低 NO 濃度下で未結合の Fnr タンパク質が存在することを示しました。 (10 ～ 40 μM) fnr 転写の増加による。これは、細菌ごとに生産される総 Fnr 分子を推定することによって確認されました [ELISA によって決定されたタンパク質濃度と Fnr のモル質量 (Mr 30,000) および最大の NO 結合に必要な部分 (Fnr の各 [4Fe-4S] クラスターが反応する) から計算最大8個のNO分子を含む）]（図5h）。

この研究では、宿主の自然免疫系によって産生される NO が、マウスマクロファージおよびマウスの全身臓器におけるネズミチフス菌の複製を促進する細胞内合図であり、Fnr および PhoP/Q を介して SPI-2 を活性化することを報告します。シグナル伝達経路。ネズミチフス菌における NO シグナル伝達による SPI-2 活性化の誘導は濃度依存性 (5 ～ 20 μM) であり、SPI-2 発現は高レベルの NO (50 ～ 100 μM) によって阻害されたことから、ネズミチフス菌が毒性は宿主の NO 産生レベルによって異なった影響を受けます。マウスマクロファージにおけるNO産生は、最大の誘導に必要な範囲内であったが、NO産生の欠如はヒトU937細胞におけるネズミチフス菌の複製の欠如に寄与した可能性があり、マウスとヒトにおけるネズミチフス菌の毒性の違いの証拠を提供している。

IFN-γ活性化マクロファージにおける所見と一致して、感染後期におけるネズミチフス菌複製のNO依存性阻害が本研究のマウスマクロファージでも検出され、さらにその阻害はSPI-2とは独立していた。したがって、宿主の NO 産生は両刃の剣として機能し、感染の初期段階ではネズミチフス菌の毒性を促進しますが、後期ではその複製を阻害します。 NO は SCV 内に自由に拡散するため、NO に由来する RNS が感染後期に高レベルで蓄積し、ネズミチフス菌の複製を阻害すると考えられます。この仮説を裏付けるように、RAW264.7 細胞の ONOO- レベルは感染後 16 時間で有意に増加し (補足図 5)、阻害の開始と同時に増加しました。ただし、この仮説のさらなる検証と、原因となる同族体が存在する場合の同定は、まだ研究の余地があります。

以前に報告された弱酸性 pH、低 Mg2+、抗菌ペプチド、高浸透圧ストレスなど 50、51、52、およびここで特定された NO など、マウスマクロファージにおける SPI-2 活性化に関する既知の宿主環境の手がかりのほとんどは、PhoP/Q によって媒介されます。さらに、PhoP/Q は SPI-2 活性化のための複数のホストキューの統合ポイントとして関係しています。酸性 pH、低 Mg2+、抗菌ペプチド、高浸透圧ストレスは PhoQ によって直接感知され、活性化された PhoQ は PhoP 活性 (つまりリン酸化) 状態 (つまり PhoP-P) を促進します。対照的に、NOに対するphoP/Q応答は間接的であり、phoPQプロモーターに直接結合してPhoP/Q発現を増強するFnrによって媒介される。さらに、PhoPQ の NO 媒介活性化は、低酸素条件下でのみ発生します。これは、SCV 環境の特徴でもあります。したがって、この研究では、PhoP/Q 活性を制御する別のメカニズムが特定されました。

PhoP は、SsrA/SsrB を介して活性化することに加えて、sseL 遺伝子のプロモーター領域に直接結合することにより、SsrA/SsrB 非依存的に SPI-2 エフェクター SseL を活性化します53。 PhoP に加えて、OmpR も SPI-2 遺伝子の重要な調節因子です 54。リン酸化された OmpR の増加に応答して、S. Typhimurium 野生型における SPI-2 ssrA 発現の上昇は、phoP 変異体の発現と同等であり、PhoPQ が OmpR55 の上流のイベントを調節することによって SPI-2 遺伝子発現も活性化する可能性があることを示唆しています。したがって、NO 媒介 PhoP 活性化も SsrA/SsrB とは独立して SPI-2 を調節する可能性があります。

FnrはNO56と結合することによって不活化されるため、低NOレベルがFnr媒介SPI-2活性化を促進できるという発見は予想外であった。 Fnr 調節に対する NO の影響についての我々のこれまでの理解は、Hmp43、44 の場合のように、調節因子の不活化による遺伝子発現の抑制解除に限定されていました。本研究は、NOがタンパク質に結合してFnrを不活化するだけでなく、より低濃度でその転写を正に制御し、その結果Fnr活性が亢進し、それによってPhoPQやSPI-2などのFnr制御遺伝子に影響を与えることを報告している。したがって、NO シグナル伝達によって誘導される Fnr 活性化は、このタンパク質によって調節される遺伝子に全体的な影響を及ぼします。

NO（宿主の自然免疫系によって産生されるものと同様のレベル）によってFnr活性化が用量依存的に増強されるという発見は、特に細菌性病原体のFnr制御遺伝子発現に大きな影響を与える。したがって、ネズミチフス菌の場合、マウスマクロファージによって産生されるNOによるFnrの活性化も、他の遺伝子に広範囲に影響を与えることによってネズミチフス菌の病因に寄与する。 Fnr 活性に対する低レベル NO の影響は SPI-2 遺伝子をはるかに超えており、Fnr レギュロンに世界的な影響を及ぼします。

Fnr と PhoP/Q はどちらも、多数の遺伝子に影響を与える祖先全体的な制御システムであり、サルモネラ菌以外の多くの細菌性病原体の病原性に関与しています。たとえば、赤癬菌 57、尿路病原性大腸菌 58、鳥病原性大腸菌 59 などです。 NO シグナル伝達経路におけるこれら 2 つのシステムの関与は、この分子がそれぞれの宿主によって産生されるという条件で、NO が他の病原体によっても利用される可能性があることを示していますが、これについてはまだ研究されていません。

研究されたほとんどの場合、ヒトマクロファージにおける NO 生成は無視できますが、いくつかの例外があります。以前に発表されたデータは、健康なボランティア由来のヒトマクロファージは検出可能なiNOSを欠く傾向があり、細菌による刺激後にごくわずかな量のNOを生成するのに対し、病気またはストレスを受けた個人由来のマクロファージではiNOSおよびNO60のレベルが上昇していることを示唆しています。興味深いことに、ヒトのマクロファージにおける NO 産生とネズミチフス菌の全身感染の間には相関関係があるようです。なぜなら、この病原体は、免疫不全状態にある複数の個人（非常に若い人、非常に高齢者、または病気の人）では全身疾患を引き起こすが、健康な成人ではそうではないからです61。サハラ以南のアフリカで出現した侵襲性ネズミチフス菌 ST313 株も、ほとんどの報告例で免疫不全状態の個人に菌血症を引き起こします 62。したがって、免疫力が低下したヒトにおけるネズミチフス菌によって引き起こされる全身性疾患は、部分的に NO の産生と関連している可能性があります。

SPI-2 は、ヒトマクロファージにおけるヒト特異的血清型 S. Typhimurium の増殖には必要ではありませんが 63、S. Typhimurium における SPI-2 の不活性化がインフラマソーム反応を増強するため、SPI-2 はヒトマクロファージにおける S. Typhimurium の免疫回避に寄与しています。ヒトマクロファージの減少により、強力な IL-1β 産生とマクロファージの死が引き起こされます 64。 NO（20μM）の補給により、ヒトマクロファージにおけるネズミチフス菌のSPI-2発現も増加しましたが（補足図6a）、ヒトマクロファージにおけるSPI-2発現が増加しました（2つの高SPI-2発現誘導株を使用することにより）。ネズミチフス菌の細胞内負荷はわずかに増加しました（補足図6b、c）。したがって、NOによるSPI-2活性化の欠如は、ヒトマクロファージにおけるネズミチフス菌の複製の低下の原因の一部に過ぎず、他の機構もその複製の制御に関与している。ヒトマクロファージにおける細胞内複製に対する宿主の合図と細菌の機構はまだ研究されていない。

致命的な全身疾患を引き起こすには、組織マクロファージにおける細菌の複製を介して、マウスの全身部位（主に肝臓と脾臓）にネズミチフス菌が大量に蓄積することが必要である。これは、大量の細菌が宿主の免疫によって容易に除去されないためである65。細菌数の大幅な増加は一般に初期感染期（1週間以内）に起こり、この時点では肝臓と脾臓の免疫反応が十分に確立されていない66,67。その後、宿主の免疫が始まると増殖プラトー期が起こります。細菌の増殖を制限する68。初期感染段階での細胞内複製を促進するシグナルとして宿主の NO 産生を利用することは、ネズミチフス菌がマウスの全身感染を誘導する重要なメカニズムである可能性があります。

S. エネトリカ血清型ダブリンは、S. エネトリカの主要な保有源であるウシに全身感染を引き起こす可能性があり、マウスにも全身感染を引き起こす可能性があります69,70。マウスのマクロファージに加えて、ウシのマクロファージも細菌成分による刺激により NO を生成することが報告されています 27。マクロファージ由来の NO が 2 つの宿主における S. Dublin の全身感染に寄与しているかどうかについては、さらなる調査が必要です。 S. Gallinarum と S. Choleraesuis は、それぞれ家禽と豚に全身感染を誘発する可能性があり、これらは S. enetrica の他の 2 つの主要な保有源となっています 71。しかし、細菌によって刺激された家禽およびブタのマクロファージは両方とも、検出可能なNO27を生成できず、NOシグナル伝達SPI-2活性化経路が存在しないことを示した。したがって、全身感染を促進するために、他の宿主特異的メカニズムが S. enetrica によって利用される可能性があります。

結論として、この研究は、宿主の自然免疫系によって生成される NO がネズミチフス菌の毒性を促進する重要な合図として機能することを実証しました。これは、宿主の自然免疫応答が病原体自身の利益のために利用される可能性があり、宿主の自然免疫系と病原体の間の相互作用が疾患の転帰にとって重要であるという仮説を裏付けています。

すべての動物実験は、中国天津の南開大学の施設内動物管理使用委員会 (IACUC) によって承認されました (IACUC 番号: 2018050601)。私たちは、動物の苦痛と研究に含まれる動物の数を最小限に抑えるために最善を尽くしました。

この研究で使用した細菌株とプラスミドの詳細情報は補足表 5 に提供され、使用したプライマーは補足データ 2 にリストされています。マウス毒性株 S. ネズミチフス菌 ATCC 14028s を野生型株として使用しました。細菌変異体は、レッド相同組換えによる 1 段階の遺伝子置換によって構築されました 72,73。変異体を生成するために、クロラムフェニコールまたはカナマイシン耐性遺伝子配列と、標的遺伝子の両端にある 2 つの相同アーム配列 (38 ～ 40 bp) を、それぞれ pKD3 または pKD4 プラスミドから PCR 増幅しました。 ssrAプロモーターを他の選択されたプロモーターと置き換えるために、選択された遺伝子のプロモーター配列を、オーバーラップエクステンションPCRによってクロラムフェニコール耐性遺伝子配列とスプライスした。次いで、得られたDNAセグメントを、一連のレッドリコンビナーゼを発現するpKD46プラスミドを保有する野生型ネズミチフス菌のコンピテントセルにエレクトロポレーションした。変異体およびプロモーター置換株を、対応する抗生物質を含むルリア・ベルターニ (LB) 寒天プレート上でスクリーニングしました。確立されたすべての株は、PCR 増幅および DNA 配列決定によって確認されました。必要に応じて、FLP リコンビナーゼをコードする pCP20 というヘルパープラスミドを使用して抗生物質耐性遺伝子を除去しました。

fnr相補株およびfnr過剰発現株は、低コピー数プラスミドpWSK129上にfnr遺伝子を発現させることにより構築した。 fnrプロモーター領域およびオープンリーディングフレームを有するDNA断片を、高忠実度Pfu DNAポリメラーゼおよび鋳型として野生型ネズミチフス菌ゲノムDNAを使用してPCR増幅した。精製した DNA 断片と pWSK129 プラスミドを組み合わせた制限酵素 (BamHI と EcoRI) で二重消化し、酵素消化産物を T4 DNA リガーゼを使用して連結して再構成プラスミド pFnr を生成しました。次いで、ｐＦｎｒをｆｎｒ変異株または野生型株に電気形質転換して、それぞれ相補株およびｆｎｒ過剰発現株を生成した。

細菌株は、温度感受性プラスミド pKD46 または pCP20 を持つ株を除き、37 °C の LB ブロス (10 g/L トリプトン、5 g/L 酵母抽出物、および 10 g/L NaCl) 中で日常的に増殖しました。 30℃。 SPI-2 遺伝子の発現を誘導するために、細菌を LB ブロスで一晩培養し、N-最小培地 (7.5 mM (NH4)2SO4、5 mM KCl、0.5 mM K2SO4、80 mM MES pH 5.8、 38 mM グリセロール、8 μM MgCl2、337 μM KH2PO4、および 0.1% カザミノ酸 [w/v])。 PhoP の非誘導条件では、N-最小培地の MgCl2 濃度を 1 mM に変更しました。低 O2 増殖条件では、一晩培養した細菌を、15 mL の密閉ポリプロピレンチューブ内で新鮮な LB 培地または N-最小培地 (8 μM MgCl2 または 1 mM MgCl2 を含む) に 1:100 で継代培養し、6 時間振盪せずに培養しました。定常相（OD600 ≈ 0.4）に達するまで。高酸素増殖条件では、一晩培養した細菌を新鮮な LB 培地または N-最小培地 (8 μM MgCl2 または 1 mM MgCl2) に 1:100 の割合で 200 rpm で振盪しながら 4 時間継代培養し、定常期 (OD600) に達しました。 ≈ 0.8）。

必要に応じて、抗生物質の個別または組み合わせを次の使用濃度で使用しました: 20 μg/mL クロラムフェニコール (Cm)、100 μg/mL アンピシリン (Ap)、50 μg/mL カナマイシン (Km)、200 μg/mL ストレプトマイシン ( Sm)、および 10 または 100 μg/mL ゲンタマイシン (Gm)。

野生型 C57BL/6 マウスは、Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co. Ltd (北京、中国) から購入しました。 C57BL/6 バックグラウンドを持つコンジェニック iNOS-/- マウスを Jackson Laboratory (USA) から購入しました。すべてのマウスは、動物研究の科学ガイドラインに従って、特定の無菌環境で飼育されました。

マウス生存アッセイでは、一晩培養した野生型株と ssrA プロモーター置換株を、接種率 1:100 の新鮮な LB 培地に継代培養しました。培地の OD600 値が 2 に達したとき、細菌を収集し、0.9% NaCl で 1 × 105 CFU/mL または 2.5 × 104 CFU/mL まで段階希釈しました。 6 ～ 8 週齢の C57BL/6 マウスのグループ (1 グループあたり 5 ～ 10 匹) に、1 × 104 を含む 0.9% NaCl 懸濁液 0.1 mL を注射することにより、指定されたネズミチフス菌株を感染させました。感染マウスの死亡率毎日同じ時刻に記録し、日次生存率を計算した。

肝臓および脾臓に定着したサルモネラ菌の数を計算するために、感染マウスを感染後 3 日で頚椎脱臼により屠殺した。肝臓および脾臓を滅菌ハサミおよびピンセットを使用して切除し、それぞれの組織をホモジナイザーを使用してPBS中で粉砕した。ホモジネートを希釈し、LB 寒天プレート上に広げて CFU を計測しました。

マウスマクロファージ細胞株 RAW264.7 (ATCC TIB71)、ヒトマクロファージ細胞株 U937 (ATCC CRL-1593.2) および THP-1 (ATCC TIB-22) は、中国アカデミーの上海生化学細胞生物学研究所から購入しました。科学（中国、上海）。初代ヒト末梢血 CD14 + 単核細胞 (PBMC) は、Stem Cell Technologies (カナダ、ブリティッシュコロンビア州バンクーバー; https://www.stemcell.com/human-peripheral-blood-cd14-monocytes-frozen.html) から購入しました。マクロファージは、熱不活化ウシ胎児血清 (FBS; Gibco) を含む RPMI-1640 培地 (Gibco) 中で 37 °C、5% CO2 雰囲気下で培養されました。感染の約 48 時間前に、RAW264.7 細胞を懸濁し、カバースリップの有無にかかわらず、12 ウェル細胞培養プレートにウェルあたり 1 × 105 細胞の密度で播種しました。 U937 細胞と THP-1 (ATCC TIB-22) は、感染前に 10 nM の濃度のホルボール 12-ミリステート 13-アセテート (Sigma-Aldrich) で 48 時間活性化されました 48。この処理により、細胞が接着し、活性化されるようになりました。 CD14 + 単核細胞は、感染前 7 日間の組換え 1% マクロファージコロニー刺激因子の投与によりマクロファージに分化しました。

マウス腹膜マクロファージ（PM）は、C57BL/6 マウスおよび/またはコンジェニック iNOS-/- マウスの腹腔に過ヨウ素酸ナトリウム溶液を注射することによって誘発され、その後収集されました。収集した PM を 10% FBS を含む RPMI-1640 培地中で 37 °C、5% CO2 環境下で 3 時間インキュベートしました。次に、細胞をPBSで2回洗浄し、接着細胞を10% FBSを含むRPMI-1640培地でさらに48時間培養した。初代骨髄由来マクロファージ (BMDM) は、大腿骨と脛骨を PBS で洗い流すことによって単離されました。採取したBMDMを、10% FBSおよび100 ng/mL M-CSFを含むRPMI-1640培地中でインキュベートした。細胞は、2 ～ 3 日ごとに培地を交換しながら、5% CO2 環境下、37 °C で 8 日間インキュベートされました。すべての細胞は抗生物質を含まない培地で培養されました。

マクロファージ複製アッセイは、サルモネラ属菌 74 の定常期を使用して実行されました。一晩培養した細菌を新鮮な LB 培地に 1:100 の比率で植菌し、OD600 値が約 2.0 に達するまでさらに培養しました。細菌培養物を5000 rpmで5分間遠心分離し、上清を廃棄し、細菌ペレットを10％正常マウス血清に再懸濁し、37℃で20分間オプソニン化しながらインキュベートしました。次に、感染多重度 (MOI) 10 でマクロファージ単層を含む細胞プレートに細菌を添加しました。浸潤プロセスを促進するために、細胞プレートを 1000 × g で 5 分間遠心分離しました。 5％CO2下、37℃で30分間インキュベートした後、細胞培養上清を廃棄し、感染細胞をPBS（37℃に温めた）で3回穏やかに洗浄した。次に、細胞を100μg/mLゲンタマイシンを含む培地中で37℃で1時間培養し、続いて感染プロセスが終了するまで10μg/mLゲンタマイシンを含む培地中で細胞を培養した。感染後の指定の時点で、細胞プレートの培養上清を除去し、細胞をPBSで3回穏やかに洗浄しました。最後に、0.1% Triton X-100 を細胞プレートに添加し、強力な吸引によって細胞を溶解しました。溶解物を段階的に希釈し、LB 寒天プレート上にプレーティングして、サルモネラ菌の CFU 数を計測しました。感染後の各時点で、ウェルあたりの生存細胞数が検出されました。細菌の CFU は、生存細胞の数によって正規化されました。サルモネラ菌の細菌量の増加は、指定された時点の細胞内細菌数を 2 時間の細胞内細菌数で割ったものとして計算されました。細胞内のサルモネラ増殖に対する NO の影響を調べるために、SPI-2 発現の誘導の可能性を阻害するために、感染の 2 時間前に 50 μM L-NMMA (1-モノメチルアルギニン) を添加しました。

NO は亜硝酸塩の最終生成物であるため、その濃度はグリース試薬を使用して亜硝酸塩の濃度を検出することで間接的に測定されました。感染後の指定の時点で、RAW264.7 および U937 細胞の培養上清 (50 μL) を 96 ウェルプレートに移し、続いて 100 μL の Griess 試薬を添加し、室温で 10 分間インキュベートしました。その後、Sparkマルチモードマイクロプレートリーダー（Tecan社製）を用いて570nmにおける吸光度を測定し、亜硝酸ナトリウム標準曲線に基づいて培養上清中の亜硝酸塩濃度を算出した。

ssaG、fnr、phoP の in vitro 遺伝子発現を、低 Mg2+ 濃度 (8 μM MgCl2) および/または SPI-2 非誘導 (1 mM MgCl2) を含む N-最小培地で培養した細菌における qRT-PCR を使用して評価しました。上記のような最小培地。遺伝子発現は、低 O2 条件または高 O2 条件下で 8 μM または 1 mM MgCl2 を含む N 最小培地で培養した細菌でも評価されました。 Spermine NONOate (Abcam) を NO 供与体として使用し、標的遺伝子の転写に対する NO の影響を調べました。 NO 供与体は、8 μM または 1 mM MgCl2 N 最小培地で 1 時間細菌を増殖させた後、細菌細胞が対数期後期にあるときに培養物に添加されました。

qRT-PCRは、QuantStudio 5リアルタイムPCRシステム(Applied Biosystems)で実施した。製造業者の指示に従って、ランダム六量体（Sigma）を含むSuperScript II（Invitrogen）を使用して、RNAをcDNAに逆転写した。 qRT-PCR 反応系は、1 μL の cDNA、200 nM の各プライマー、および 10 μL のユニバーサル SYBR Green Master mix を含む総量 20 μL で実行されました。 qRT-PCR 反応手順は、95 °C で 10 分間、その後 95 °C で 15 秒、60 °C で 30 秒を 40 サイクルに設定しました。ハウスキーピング遺伝子 (16S rRNA) の発現に対する標的遺伝子発現の変化倍数を、2-ΔΔCt 法によって決定しました。

さまざまな種類のマクロファージ内のサルモネラ菌の遺伝子発現を研究および分析するために、RAW264.7 および U937 細胞の感染後 8 時間で細胞内細菌から RNA を抽出しました。 RPMI-1640培地中の細菌から抽出したRNAを対照として使用した。オンカラム DNase 消化プロセスを含む RNeasy Mini Kit (Qiagen) を RNA 精製に使用しました。 MicrobEnrich キット (Ambion) を使用して宿主細胞 RNA を除去し、次に MicrobExpress キット (Ambion) を使用して細菌の 23S および 16S rRNA を除去しました。キャピラリー電気泳動 (Agilent) を使用して RNA の品質を決定し、RNA は NanoDrop 2000 (NanoDrop Technologies) を使用して定量しました。次に、SuperScript Double-Stranded cDNA Synthesis Kit (Invitrogen) を使用して cDNA に逆転写しました。

Illumina プラットフォームシークエンシング用の cDNA ライブラリーは、提供された説明書に従って mRNA-Seq 8-Sample Prep Kit (Illumina) を使用して構築し、Novogene Co., Ltd. (北京、中国) の Illumina HiSeq 2000 プラットフォームでシーケンシングを実行しました。 10 pM の cDNA ライブラリーの最終希釈液を配列決定機にロードしました。 20 未満の Phred 品質スコアは低品質リードとみなされ破棄され、FastQC 品質管理ツールをデフォルトのパラメーターで使用して評価されました。次に、Bowtie (バージョン 2.2.3) を使用して、処理されたリードをネズミチフス菌 ATCC 14028S (CP001363 および CP001362) のゲノムにマッピングしました。各遺伝子にマッピングされたリード数は、HTSeq (バージョン 0.6.1) を使用して取得されました。遺伝子発現レベルは、100万マップされたリード当たりの転写物のキロベース当たりのリード（FPKM）として計算されました。差次的に発現される遺伝子は、R パッケージ DESeq2 を使用して決定され、FDR 有意しきい値は P 値 <0.05、変化倍数 >2 に設定されました。

RAW264.7細胞をカバーガラス上に播種し、上記のように感染させた。感染後の指定の時点で、感染細胞を 3% パラホルムアルデヒド (PFA) で 15 分間固定し、PBS で 3 回洗浄しました。次いで、細胞を０．１％トリトンＸ－１００溶液中で２０分間透過処理し、ＰＢＳで洗浄し、続いてＰＢＳ中の５％ＢＳＡで３０分間ブロックした。次いで、細胞を、PBSで100倍に希釈したマウス抗サルモネラLPS (Abcam)抗体とともに1時間インキュベートした。細胞をＰＢＳで３回洗浄した後、ＰＢＳで２００倍に希釈したヤギ抗マウスＩｇＧ（ＦＩＴＣ）（アブカム）二次抗体とともに１時間インキュベートした。洗浄プロセスを繰り返した後、細胞を DAPI (Invitrogen) とともに 2 分間インキュベートしました。最終的な洗浄プロセスの後、細胞を封入剤で覆いました。細胞内細菌の観察と画像取得には共焦点レーザー走査型顕微鏡（Zeiss LSM800）を使用した。さらなる画像処理には ZEN 2.3 (ブルーエディション) が使用されました。

RAW264.7マクロファージを96ウェル細胞培養プレートに播種し、上記のようにサルモネラ菌に感染させた。感染後の指定の時点で上清を吸引し、CytoTox 96® 非放射性細胞毒性アッセイ (Promega) を使用して、放出された細胞質乳酸デヒドロゲナーゼ (LDH) の濃度を測定するために使用しました。細胞毒性は、溶解されたマクロファージからの最大放出に対する放出されたLDHのパーセンテージとして表されました。

fnr配列をpET-28aプラスミドにクローニングしてpET-Fnrプラスミドを得、これを大腸菌BL21に電気形質転換してFnr融合タンパク質を発現させた。 HiTrap Ni2+ キレートカラムを使用して、BL21 を発現する pET-Fnr プラスミドの可溶性抽出物から Fnr 融合タンパク質を精製しました。ブラッドフォード法を使用してタンパク質濃度を測定しました。最終的に精製されたタンパク質は等分され、-80 °C で保存されました。

Fnr タンパク質ポリクローナル抗体は、Wuhan bioyears Biotech Co., Ltd (武漢、中国) によって製造されました。ネズミチフス菌野生型株を一晩、N-最小培地で1:100で継代培養し、異なる濃度のスペルミンNONO酸塩(5、10、20、50および100μM)の有無にかかわらず、低酸素条件下でOD600が200になるまで増殖させた。 0.6 (~5 × 108 細菌/mL)。細菌を回収し、ペレットを 4% SDS を含む Laemmli サンプルバッファー 75 に懸濁しました。懸濁液（約４０ｇタンパク質／Ｌ）を２０秒間超音波処理した。細胞抽出物 (タンパク質 0.2 mg) を SDS ゲル電気泳動に供し、次にポリ二フッ化ビニリデン (PVDF) 膜に転写しました。 Fnrタンパク質は、抗Fnr(1:250～1:500に希釈)およびペルオキシダーゼ結合二次抗体(Abcam)を使用するELISAによって検出した。細胞抽出物中のFnrタンパク質の量は、SDSゲル電気泳動による分離後のELISAで生成された染色から推定されました。推定は、未知のサンプルと、同じゲル内の既知量 (0.05 ～ 0.5 μg) の単離 Fnr タンパク質によって生成された染色の強度を比較することによって行われました。

ssrA、ssrB、phoP、およびhmpAのプロモーター領域配列を含むPCR断片を、ネズミチフス菌14028 SのゲノムDNAを鋳型として使用するPCRによって増幅した。 EMSA は、低酸素環境下、37 °C で 20 分間、精製プロモーターフラグメント (40 ng) を漸増濃度の精製 Fnr-His6 タンパク質 (0 ～ 20 μM) とインキュベートすることによって実行されました。総反応混合物は２０μＬであり、結合緩衝液は２０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、８０ｍＭＮａＣｌ、０．１ｍＭＥＤＴＡ、１ｍＭＤＴＴ、および５％グリセロールを含んでいた。サンプルを、0.5×トリス-ホウ酸-EDTA中の6%ポリアクリルアミドネイティブゲル上にネイティブ結合緩衝液とともにロードした。 DNA断片の染色には臭化エチジウムを使用しました。

FLAG タグ付き細菌株の一晩培養物を N-minimal 培地で 1:100 に希釈し、OD600 が約 0.6 になるまで増殖を続けました。細菌培養物を 1% ホルムアルデヒドで室温で 25 分間処理しました。最終濃度 0.5 M でグリシンを添加して反応を停止し、12,000 rpm、4 °C で 2 分間遠心分離してサンプルをペレット化しました。次に、細菌ペレットを氷で予冷した PBS で 3 回洗浄しました。次に、クロマチン免疫沈降キット (Millipore) のガイドラインに従って、サンプルを ChIP に使用しました。 FLAGに対するマウスモノクローナル抗体(Sigma; 1:1000希釈)を使用した。未処理のクロマチンを 10 分間煮沸することにより脱架橋し、ChIP-qPCR アッセイの「インプット」コントロールとして精製しました。 qPCR によって定量化された免疫沈降 DNA の値を、入力された未沈降 DNA の値で割った値が、候補遺伝子プロモーターの相対的濃縮とみなされました。非特異的濃縮を説明するために、これらの値は、タグなしの野生型を使用して各プロモーターについて得られた値に対して正規化されました。

特に明記しない限り、インビトロ実験は二連で実施し、少なくとも 3 回繰り返しました (n ≥ 3)。マウス毒性アッセイは、各注射グループで少なくとも 2 匹のマウス (n ≧ 2) を用いて 2 回実施され、2 回の実験の結合データが統計分析に使用されました。統計的有意性は、GraphPad Prism 8.0.1 ソフトウェア (GraphPad Inc.、サンディエゴ、カリフォルニア州) を使用して、両側非対応スチューデント t 検定、一元配置分散分析、二元配置分散分析、ログランク (マンテル-コックス) 検定を使用して分析しました。図の凡例に記載されているように、テスト要件に従って、またはマン・ホイットニー U 検定を使用します。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

この研究で取得された RNA 配列は、NCBI Sequence Read Archive (SRA、PRJNA915482) で入手できます。ソースデータは補足データ 1 に記載されています。

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リファレンスをダウンロードする

この研究は、中国国家自然科学財団 (32130003、81871624、32170110、32070133)、中国国家重点研究開発プログラム (2018YFA0901000)、天津自然科学財団 (22JCYBJC01060)、深セン自然科学財団から資金提供を受けました。 (JCYJ20210324135007019)。

教育省、南開大学、中国天津の分子微生物学および技術の主要研究室

Lingyan Jiang、Wanwu Li、Xi Hou、Shuai Ma、Xingyue Wang、Xiaolin Yan、Bin Yang、Di Huang、Bin Liu、Lu Feng

TEDA 生物科学およびバイオテクノロジー研究所、天津南開大学、微生物機能ゲノミクス重点研究室、天津、中国

Lingyan Jiang、Wanwu Li、Xi Hou、Shuai Ma、Xingyue Wang、Xiaolin Yan、Bin Yang、Di Huang、Bin Liu、Lu Feng

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LF が研究を発案し、監督しました。 LJ、WL、XH、SM、XM、XY、BY が調査を実施しました。 DH と BL は技術サポートと洞察を提供しました。 LJ はデータを分析しました。そしてLJとLFが原稿を書きました。

呂鳳への対応。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Communications Biology は、この研究の査読に貢献してくれた Jaclyn Pearson 氏、Panagiotis Tourlomousis 氏、およびその他の匿名の査読者に感謝します。主な担当編集者: Kaiwen Chen、Tobias Goris。査読ファイルが利用可能です。

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転載と許可

Jiang、L.、Li、W.、Hou、X. 他。一酸化窒素は、マウスのネズミチフス菌全身感染の宿主の手がかりです。 Commun Biol 6、501 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s42003-023-04876-1

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受信日: 2022 年 7 月 28 日

受理日: 2023 年 4 月 26 日

公開日: 2023 年 5 月 9 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04876-1

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